Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Tüm işlemler Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (hayvan etik protokol Ohri-1696) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi. Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 1. İzolasyon <ol><li> 50 ml tüp enzim karışımı hazırlayın: 30 U Nötr Proteaz tartmak, 2500 U kollajenaz I ve 500 U DNAz I. Bu miktarlar yetişkin bir fare veya sıçan yavru akciğerler için yeterli. kullanılana kadar 4 ° C &#39;de izolasyon ve mağaza gününde hazırlayın. </li><li> pentobarbital sodyum, intra-peritonal enjeksiyon ile günde 13 Kurban yavrular (0.2 mi, 65 mg / ml). bilinç oluşturmak için ayak tutam refleks kullanın. Aşağıda tarif edilen hayvanın ölümü, göğüs açılarak sağlanır. </li><li> çok dikkatli olmama,% 70 etanol ile hayvan püskürtülerek cildin dezenfekte ve dikkatle diyafram başlayan ve rostral tarafa doğru kesim, cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi açmakakciğerlere zarar. Toraks erişim sağlamak için göğüs kafesi kesip alternatif hemostatik kelepçeler kullanarak açık göğüs kafesi yayıldı, ya da. </li><li> kalbi kaldırarak hayvan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. kalbi kaldırmak için, küçük forseps ile timus ve kalp kavramak ve cerrahi makas ile bu kesip. artık kan kopmuş aort ve pulmoner arter çıkana kadar hemen ardından, bir gazlı bez ile kan emer. </li><li> aşağıdaki gibi toraks akciğerlere kaldırın: küçük forseps ile trakea tutun, daha sonra rostral tarafında cerrahi makas ile trakea sever. yavaşça toraks dışına akciğer paketini çekerken, akciğerler serbest göğüs kafesi boyunca sırt tarafında herhangi bir bağ dokusu kesip. </li><li> cerrahi makas ile diyafram boyunca keserek aorta ve yemek borusu akciğerlere Sever. Şimdi akciğerler tamamen toraks arınmış bir gazlı bez ile hafifçe kalan kan kaldırın. </li><li> sur ile trakea ve bronşlar kaldırjik makas ve dikkatli bir şekilde soğuk 35 mi% 30 sitrat-fosfat-Dekstroz Adenin (CPDA-1) pıhtı önleyici ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir tüp akciğer lobları transferi (26.30 g trisodyum sitrat dihidrat, 3.27 g askorbik asit monohidrat, 2.22 g monosodyum dihidrojen fosfat, 31.80 g D-glikoz, 1 L 0.275 g adenin H2O arıtıldı; steril filtre kan ve ortadan kaldırmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kullanımdan önce 0.22 um membran filtre) kullanılarak çözelti. </li><li> % 30 CPDA-1 / PBS içinde 5 dakika çalkalandıktan sonra, 35 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) (RT) içeren yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe akciğer transfer sitrat çıkarmak için hafifçe ters. içeren bir tüpe aktarın 35 mi Dulbecco PBS + Sodyum pirüvat + Glukoz (DPBS ++) (RT). Her durulama adımı yaklaşık 5 dakika sürer. Not: Kalsiyum klorür dihidrat 132.4 mg, magnezyum klorür heksahidrat 100 mg, potasyum klorür (susuz), 200 m: DPBS ++ ticari sipariş veya kadar yapılabilir 21 şug potasyum fosfat monobazik (susuz) 200 mg sodyum klorür (susuz) 8000 mg sodyum fosfat dibazik (susuz) 1,144.5 mg, D-glikoz, 1000 mg sodyum piruvat ve 36 mg 1 L arı H2O, pH 7.3. Steril filtre kullanmadan önce, bir 0.22 mikron membran filtresi kullanılarak çözelti. </li><li> (37 ° C önceden ısıtılmış) ++ 10 mi DPBS ekleme ve çözünene kadar hafifçe baş aşağı çevirerek enzim karışımı içinde çözülür. </li><li> Yeni 50 ml tüp akciğerlere aktarın ve ince kıyılmış kadar neşter kullanılarak tüp duvara akciğer doğrayın. dokuya (10 mi, yetişkin fare / sıçan yavru akciğer başına enzim karışımı /) enzim karışımı ekleyin tüpü sıkıca kapatın ve (yumuşak çalkalama ile 38 ° C&#39;de inkübe ya ısı karıştırıcı, çalkalanan bir su banyosu ya da su içinde düzenli manuel ajitasyon ile banyo). Fetal doku 60 dakika, çocuk / erişkin doku 90-120 dakika, fibrotik yetişkin doku 120-150 dk: süre doku tipine bağlıdır. </li><li> iki değerli katyonlar w şelat sindirim durduruni 200 Etilendiamintetraasetik asit ul (EDTA, 0.15 M, pH 7.4 ile yıkanır. Steril filtre kullanılmadan önce 0.22 um membran filtre kullanılarak çözeltisi). </li><li> 20 mi% 5 fetal sığır serumu (FBS) / PBS ilave edin ve yeni bir 50 mL tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden Bütün süspansiyon geçmektedir. 40 ml kadar olan toplam hacim getiren 10 mi,% 5 FBS / PBS ile boru ve hücre süzgecinden yıkayın. </li><li> 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> 40 ml% 5 FBS / PBS tekrar süspansiyon, (pelet açıkça görülebilir olmalı) Süpernatantı ve santrifüj adımı 1.13 tekrarlayın. </li><li> 4 mi,% 5 FBS içinde yeniden süspanse / PBS (RT) ve dikkatli bir şekilde fazla 3 mi yoğunluk gradyan maddesi tabakası (1.073 g / cm3), 15 ml&#39;lik bir tüpe 14. İyi bir interfaz elde etmek için, tek bir hücre süspansiyonu katman, çok düşük bir hızda&gt; 45 ° &#39;lik açıyla meydana çok önemlidir. </li><li> 900 xg&#39;de Santrifüj 20 dakika, orta (5/10) hızlanma, hiçbir yavaşlama, 19 ° C. </li><li> in mevcut hücreleri toplayınterphase ve steril 10 ml PBS bunları tekrar süspansiyon. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika, 21 ° C santrifüj. </li><li> 500 mi αMEM,% 20 hacim / hacim FBS başına 2 mmol L-glutamin ile takviye edilmiş Süpernatantı ve 10 ml hücre pelletini önceden ısıtılmış tamamlanmış L-MSC kültür ortamı (minimum temel ortam Kartal, alfa modifikasyonu (αMEM), ve% 1 hacim / hacim Penisilin / streptomisin / Amfoterisin B </li><li> Tekrar santrifüj adımı 1.18. Daha sonra, önceden ısıtılmış taze kültür ortamı, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Bu aşamada hücreler çoğu plastik yapışık değildir, çünkü yüksek bir yoğunlukta bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ve plaka kullanarak hücreleri sayın. Sıçan yavru akciğer hücreleri 1-2 önce tohum ekme yoğunluğu yeterince yoğun iken tam kaplama yoğunluğu X, örneğin, bir yetişkin fare akciğer hücreleri 10 5 hücre / cm2&#39;de tohumlanmıştır hayvanın türüne ve yaşına bağlıdır 10 4 hücre / cm2 </sup&gt;. 0.2 ml L-MSC kültür ortamı / cm 2 kullanın. </li><li> Kültürü L-erişkin nemlendirilmiş bir% 5 O2,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C &#39;de. </li><li> PBS ile bir kez durulama sonra ortam ilk ekimden 24 saat sonra, ve daha sonra, her 3 günde bir değiştirin. Hücreler kökenli hayvan bağlı olarak ortalama 3-5 gün sürer% 80-90 izdiham kadar kültürlü olmalıdır. Yüksek izdiham fibroblastlar içine farklılaşmasını teşvik edecektir. </li></ol> CD146 + Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 2. Seçim <ol><li> Ikincil antikor ile manyetik boncuk kaplanması <ol><li> Steril koşullarda cryovial Coat yuvarlak tabanlı 10 ug ikincil antikor / 100 ul manyetik boncuk oranında biyotinlenmiş sekonder antikor ile, manyetik boncuklar, 2 ml&#39;lik steril. Beklenen 0.5 x 10 6 hücre başına 10 ul ikincil antikoru kullanarak, ve 100 ul manyetik boncukları ve 10 ug antikor, en az kullanın. Not: oranıüreticileri arasında farklılık gösterebilir boncuk hacmi başına kullanılan antikorlarının verilmesinin, seçim boncuk için üreticinin talimatlarına başvurun. Bu protokol, bu protokolün optimizasyonu kullanılan boncuk ve antikor masaya 1 bakınız. </li><li> Oda sıcaklığında / 30 dakika (RPM), 30 dakika için bir döner Örnek karıştırıcı içinde inkübe edin. </li><li> 1.5 ml steril% 0.1 sığır serum albümini (BSA) boncuk tekrar / PBS ve 3 ml transfer yuvarlak tabanlı tüp (tüp akış sitometrisi). Ek bir 1.5 mi% 0.1 BSA / PBS ile dondurarak saklamaya uygun vialler durulayın ve 3 ml tüp aktarın. </li><li> Uygun bir mıknatıs tüp yerleştirin ve tüm boncuk tüpün arka duvara bağlı ve çözelti berrak kalır kadar 2 dakika bekleyin. 3 ml% 0,1 BSA / PBS ile iki kez akış ve tekrar yıkama çıkarın. </li><li> ışıktan korumalı 4 ° C &#39;de 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde boncuklar ve mağaza, yeniden süspanse edin. 5 gün içinde kullanın. </li></ol></li><li> CD146 + L-mezenkimal Etiketleme<ol><li> yumuşak olmayan bir tripsin çözeltisi kullanılarak PBS ile durulandıktan sonra mezenşimal hücrelerin hasat. Not: Cilt kültür şişesi büyüklüğüne (0.2 ml / cm2, orta ya da PBS) bağlıdır. <ol><li> kültür ortamı çıkarın ve steril PBS ile hücreler üç kez yıkayın. </li><li> Yumuşak olmayan tripsin çözeltinin uygun hacmi ekleyin (Tablo 1 e bakınız). Hücreler müstakil kadar Tablo 1 &#39;de çözeltisi kullanıldığında, yaklaşık kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 10 dakika kuluçkalayın. </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca, L-MSC kültür ortamı, ve santrifüj ekleyerek enzimi. </li></ol></li><li> % 0.1 BSA / PBS içinde, tekrar süspansiyon hücreleri Süpernatantı ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak. Not:% 0.1 BSA hacmi / PBS kültür şişesi büyüklüğüne bağlıdır: 5 ya da 10 mi% 0.1 BSA / PBS için amaçlanmıştır. </li><li> Adımı yineleyin 2.2.2 ve 3 ml% 0,1 BSA / PBS (bloklar un hücrelerin özel miktarda tekrar süspansiyonBelirli bağlanma yerleri ve) hücrenin hayatta kalabilmesi için. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> birincil anti-CD146 antikoru ile alt tüp yuvarlak bir 3 ml hazırlayın, ve buz üzerinde tutmak. Not: hücrelerin özel bir miktarda ilave edilir ki ilk antikor konsantrasyonu kullanılır antikor bağlıdır. Önerilen anti-sıçan CD146 antikoru için bakınız Tablo 1. </li><li> primer antikor ile tüp aşama 2.2.3 hücrelerin toplam hacim. Sıkıca kapatmak ve 15 rpm, 4 ° C&#39;de dönen bir örnek mikserde 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> 500 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücreleri, 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Tekrarlayın santrifüj adımı. </li><li> Bölüm 2.1&#39;de talimatlara göre hazırlandı ve 15 rpm, 4 ° C&#39;de dönen bir örnek mikserde 30 dakika inkübe edildi ikincil antikor kaplı boncuklar içeren 3 ml çözelti içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li><li> CD146 + L-mezenkimal seçme<ol><li> Mıknatıs üzerinde etiketli CD146 + L-MKH&#39;lerin içeren tüp yerleştirin. pozitif hücrelerin tüpün arkasına çizilecektir. tüp hareketli veya boncuklar dokunmadan yavaşça steril bir Pasteur pipeti (bu toplanır ve deneysel tasarım göre atılabilir olarak) negatif hücreleri ile süpernatant hasat edilir. </li><li> mıknatıstan tüpü çıkarın ve 3 ml% 10 BSA / PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Adım 2.3.1 açıklanan seçim prosedürü tekrarlayın. dört kez daha (Σ 5 Seçim aşama). </li><li> Önceden ısıtılmış L-MSC kültür ortamında CD146 + L-mezenkimal yeniden süspanse edin ve mıknatıs geri döner. </li><li> Uygun büyüklükte bir kültür şişesi (0.2 ml / cm2) &#39;de, L-MSC kültür ortamı ve plakadaki supernatant, tekrar süspansiyon çıkarın. Genel bir kural olarak, aynı boyutta bir kültür şişesi içinde plaka hücreleri olan hücreler Boncuk seçiminden önce kaldırılmıştır. CD146 + L-MKH sayısı ve bu nedenle kaplama yoğunluğu, olacakKaynak hayvanın yaşı, türler ve suşuna bağlıdır. Her zaman ~ 5,000 hücre / cm2 bir kaplama yoğunluğu hedefliyoruz. Not: boncuk hücre büyümesini rahatsız etmeyecek ve hücreler çoğalmaya olarak yavaş yavaş kaybolacaktır. </li></ol></li></ol> 3. Dondurucu Hücreler <ol><li> Aşağıdaki dondurma ortamı kullanın:% 20 FBS,% 12.5 (% 0.9 NaCI içinde% 10 pentastarch)% 60 pentastarch çözeltisi CPDA-1,% 2.5 NaCI (% 0.9),% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) 22. Not: tüm malzemeyi varsa,% 5 DMSO,% 30 FBS ve% 65 αMEM içeren bir çözüm iyi bir alternatiftir. </li><li> 1 ml her bir cryovials 0.5 x 10 6 hücre / mL, kısım yeniden süspanse hücre bir donma kap kullanılarak -80 ° C &#39;de O / N dondurma. </li><li> Sonraki gün, bir sıvı azot depolama tankı transfer. </li></ol> 4. Çözülme Hücreler <ol><li> 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde hücreleri bir şişe çözülme. </li><li> 10 ml içinde süspanse edin hücreleriönceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile 500 x g&#39;de 5 dakika, 21 ° C&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı ve 10 ml kültür ortamı içinde hücre pelletini. Havalandırmalı kap hücre kültürü içinde tohum hücreleri, 0.2 ml / cm2 ortam 5000 hücre / cm2&#39;de şişeler muamele (örneğin, 75 cm 2 şişeye 15 mL) eklenmiştir. </li><li> % 5 Kültür hücreleri O2,% 5 hasat ve / veya deneysel kullanım için% 80-90 konfluent kadar CO2. Aşırı confluency farklılaşmasını neden olacaktır. 5.000 hücre / cm 2 ekim yaparken, L-MKH kültürü 3-4 gün içinde% 80-90 confluency ulaşacaktır. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Birincil L-MKH izolasyonu ve kültürü daha iyi işlev ve hücresel düzeyde diğer hücre popülasyonlarının ile olan etkileşimlerini ve akciğer gelişimi, sağlık ve hastalık rollerini anlamak için bir fırsat sunuyor. Bu, belirli bir hücre tek işaretleyici olmaması neredeyse imkansız yerinde bu hücrelerin çalışma yapar, bu özellikle önemlidir. Tüm ilköğretim hücre popülasyonlarının olduğu gibi, kimse bu hücreler (24 gözden) kültür 19 tutulur artık onların...

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. gelişimi sırasında, akciğer olmak üzere, mezenşimin gelişimsel ipuçları önemli bir kaynak olduğunu ve yerleşik MKH bu merkezinde olması olası bir aday vardır. Ayrıca, kanıtlar ikamet MKH kanser 1,2 ve fibrozis 3 de dahil olmak üzere, yetişkin hastalıkları altüst ortaya çıkmaktadır. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin 4 izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Kök hücre antijenini-1 (Sca-1) doku kök hücrelerin bir çeşitliliği için bir markör olarak farelerde tespit edilmiştir, ve L-MSC 5 izole edilmesi için de kullanılabilir, ancak ne yazık varBaşka bir tür 6 ortologlarını da bilinir. Araştırmacılar akciğer dokusu ya da sıvı ya da L-MSC izolasyonu için farklı yalıtım çeşitli yöntemler bildirilmiştir. / CD45 - / - CD90 + hücreleri 7, CD31 - / CD45 - / epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) - Bu, CD31 seçilmesi (FACS) göre yöntem flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması değişir / Sca-1 + hücreleri 8, çok ilaca dirençli taşıyıcı kıyılmış dokusu 13 takım plastik bağlılık 11,12 ve göç ATP bağlayıcı kaset G (ABCG2) pozitif hücreler 9 veya Hoechst 33.342 boya efflux 10. Burada sunulan yöntemin avantajı pek çok kat bulunmaktadır. Yumuşak enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı 14 kullanılarak, tek bir MKH&#39;lerin arasında, ancak epitelial veya endotelial hücreleri hariç yoğunluğu aralığının tüm hücreleri elde edilir. sonraki plastik bağlılık adım sadece mesench sağlarymal hücreleri lökosit ortadan kaldırarak, yapışır ve kültür kalmak. Bu hücreler CD146 ifade yok gibi en önemlisi, ancak CD146 + seçim aşaması, fibroblast ortadan kaldırılması için izin verir. Hücre yapışma molekülü CD146 ekspresyonu pozitif multipotency ile ilişkilidir ve bir mezenkimal hücre popülasyonu 15-19 den fibroblastlar ayıklamak için iyi bir belirteç etmektir. Sadece MSC değil, aynı zamanda lipofibroblasts 5,20 ifade edilmediği gibi bu, bir seçme markeri olarak CD90 ile bir avantajdır. o hücreler üzerinde nazik olduğu gibi bu protokolde açıkça, bir manyetik boncuk seçimi seçmiş ve tüm prosedür steril şartlarda yapılabilir. sonucudur yönteme karşı, bu izolasyon yönteminin bir başka önemli avantajı, sonucudur yöntemi için bir ay ya da daha fazla karşı bu 6-10 gün, nispeten hızlı olmasıdır. Üç beş gün ilk izolasyondan sonra mezenkimal nüfus CD146 + sele hazır<html> ction; Başka bir üç ila beş gün sonra CD146 + hücreleri deneyler için kullanılmaya hazır ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. MKH uzun ex vivo kültür 19 fibroblastlar doğru transdifferentiate olarak kültür azalmış zaman hücrelerinin kalitesini artırır. Son olarak, çünkü protokol doğası, sindirim enzimleri ve inkübasyon süresi seçilerek ayarlanması ile diğer organ sistemleri sadece uygun antikorlar seçerek veya hatta diğer türler için bu yöntemi uygulamak mümkündür. Bu izolasyon yönteminin ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir ve izolasyon ve CD146 + alt populasyonun sonraki seçimi genel şematik bir görünümüdür, sırasıyla Şekil 1 A ve 1 B &#39;de verilmektedir. Ayrıca, ayrıntıları bu hücrelerin dondurulması ve çözülmesi, geçiş için dahil edilmiştir. reklam / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; . Pulmoner mezenkimal hücreler (A) ve daha sonraki CD146 + hücre seçimi (B) min = dakika izolasyonu Şekil 1. Şematik genel bakış; EDTA = Etilendiamintetraasetik asit; 2. Ab = ikincil antikor; a-CD146 antikor = birincil anti-CD146 antikor; -ve hücreleri = CD146 negatif hücrelerin; + hücreler = CD146 pozitif hücreler ettik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutral Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td><td>-</td><td>Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &gt;45&amp;deg; angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Magnetic beads</td></tr><tr><td>biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td></tr><tr><td>DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&amp;rsquo;s instructions of the magnet beads of choice.</td></tr><tr><td>TrypLE express&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE</td></tr><tr><td>anti-rat CD146 antibody</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 &amp;mu;l per 0.5 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Pentaspan (pentastarch solution)</td><td>Bristol-Myers Squibb Canada</td><td>-</td><td>Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty freezing container</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. Ayrıca, büyük olasılıkla normal organ gelişiminde rol var ve hastalık rolleri, bir fibrotik doğa ile özellikle atfedilmiştir. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Burada anlatılan izolasyon tekniği akciğer ikamet MSC (L-MKH) birden özelliklerini uygular. sıçanların kurban üzerine, akciğerler çıkarıldı ve kan kaldırmak için birden çok kez durulanır. neşter mekanik ayrışma ardından, akciğerler kollajenaz tip I, nötr proteaz ve DNaz tip I obtaine bir karışımını kullanarak 2-3 saat sindirilirD tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yıkandı ve yoğunluk gradyan ortamı (yoğunluk 1.073 g / ml) üzerine yayıldı. Santrifüj işleminden sonra, interfaz gelen hücreler yıkanır ve kültürü ile işlenmiş balonlarına kaplanmıştır. Hücreler, fizyolojik,% 5 O2 4-7 gün% 5 CO2 şartları için kültürlenir. Fibroblastlar (CD146 -) tüketmek ve CD146 + hücreleri yalnızca L-MSC&#39;ler (CD146 +), pozitif seçim popülasyonu sağlamak için manyetik boncuk seçim yoluyla gerçekleştirilir. Özet olarak, bu prosedür, güvenli başka in vitro çalışma ve işleme için primer L-MSC nüfusu üretir. Çünkü protokol doğası, kolayca diğer deneysel hayvan modellerinde tercüme edilebilir.

MKH, yoğunluk ve plastik bağlılığın en güvenilir fiziksel özelliklerinin İki, L-MKH&#39;lerin içeren akciğer mezenkimal hücre fraksiyonu elde etmek için bu protokolün ilk bölümünde kullanılmaktadır. yoğunluk gradyan interfaz akciğer mezenkimal hücrelerin yanı sıra monosit ve makrofajlar dahil olsa da, plastik yapışma kültür 3-5 gün sadece akciğer mezenkimal hücreler kalmasını sağlar izledi. Nitekim bu hücre popülasyonu klasik MSC yüzey belirteçleri C...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

8.3K Görüntüleme.  Ottawa Hospital Research Institute.  Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir. 

Video: Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biyoloji

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Akış Sitometrisi için Fare Akciğerlerinden İmmün ve İmmün Olmayan Hücrelerin İzolasyonu

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Niş Bazlı İzolasyonu

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from appendicular bones, BMMSCs derived from the jaw have greater proliferative and osteogenic differentiation ability, gradually becoming important seed cells for jaw defect repair. However, the mandible has a complex bony structure and less cancellous content than appendicular bones. It is difficult to acquire a large number of high-quality jaw-derived marrow mesenchymal stem cells using traditional methods. This study presents a &#39;niche-based approach on stemness&#39; for isolating and culturing rat jaw bone marrow mesenchymal stem cells (JBMMSCs). Primary rat JBMMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adherent method combined with the bone slice digestion method. The isolated cells were identified as JBMMSCs through cell morphology observation, detection of cell surface markers, and multi-directional differentiation induction. The cells extracted by this method exhibit a &#39;fibroblast-like&#39; spindle shape. The cells are long, spindle-shaped and fibroblast-like. The flow cytometry analysis shows these cells are positive for CD29, CD44, and CD90 but negative for CD11b/c, CD34, and CD45, which is congruent with BMMSCs characteristics. The cells show strong proliferation capacity and can undergo osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation. This study provides an effective and stable method for obtaining enough high-quality JBMMSCs with strong differentiation ability in a short time, which could facilitate further studies of the exploration of biological function, regenerative medicine, and related clinical applications.

Yazar Spotlight: Yüksek Saflıkta Çene Kemiği İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Doku Mühendisliğinde Uygulanması

Mesenchymal stem cells from the jaw bone marrow have significant functions in diverse differentiation, self-renewal, and immune modulation. They have emerged as a crucial reservoir of precursor cells in gene therapy, tissue engineering, and regenerative medicine. Here, we present a unique method for isolating jaw bone marrow mesenchymal stem cells in rats.

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from ...

CD146 İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu^Düşük CD45^Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği