膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

脂肪生物学の分野における課題の1つは、培養における成熟した脂肪細胞を維持することであった。我々は、大きな変化を通じて長期のアディポサイトの研究を可能にする新しい方法を開発した。当社のアディポサイト培養技術は、細胞相互作用の研究を可能にし、糖尿病および肥満の新しい治療法の開発に役立つことを願っています。

成熟したアディポサイトの遺伝子の質と生存率に大きな影響を与える重要なステップがあるので、プロトコルに注意深く従うことが重要です。例えば、めっきの前に、遊離脂質と洗浄バッファーがすべて除去されていることを確認してください。さもなければ、リポサイトは、挿入物が反転したときにはれてしまう可能性があります。ヒト皮下脂肪組織サンプルを受け取った後、15センチメートルのペトリ皿の滅菌生物学的安全キャビネットに組織を入れる。

皿に小さな199のボリューム。ピンセットを使用して組織内の大きな線維化血管をつかみ、閉じたハサミの先端の裏側を使用して、脂肪細胞を放出するために容器に沿って脂肪を静かにスクラップします。すべての細胞が収集されると、線維組織の大きな部分を捨て、トリミングされた脂肪を計量します。

脂肪組織からさらに細胞を放出するには、脂肪組織の10グラムを新しい15センチメートルのペトリ皿に移し、湾曲したはさみを使用して脂肪の大きな部分のない滑らかな均質混合物になるまで慎重に脂肪をミンチします。すべての脂肪が処理されたら、スプーンを使用して10ミリリットルの細切り組織を個々の50ミリリットルチューブに移し、各チューブに30ミリリットルの消化バッファーを追加します。その後、37°Cの揺れインキュベーターにチューブを置き、毎分150回転を30〜35分間置きます。

脂肪溶液が均質で、アプリコット色が付き、大きな部分が存在しない場合、消化は完了する。消化の終わりに、消化された脂肪溶液を無菌1リットルフラスコにセットされた漏斗の中の250マイクロメートルのメッシュフィルターにデカントする。アディポサイト懸濁液の全容が排除されたら、疎和にメッシュフィルターを絞って、アディポサイトの収量を増加させ、フィルターを再び絞る前に50〜100ミリリットルの洗浄バッファーでフィルターを洗浄します。

分離漏斗に分離されたアジポサイト溶液を移し、漏斗がほぼ完全に満たされるまで洗浄バッファーを加える。漏斗を数回軽く反転させて、アディポサイト懸濁液をバッファーと混合し、層の明確な分離が起きるまでサスペンションを2〜3分間放置します。層が分離したら、漏斗のノズルを開き、ゆっくりと滅菌フラスコに底液を解き放ちます。

コラゲナーゼをすべて取り除いたら、精製した成熟したアディポサイト溶液を50ミリリットルの円錐形チューブに集め、遠心分離によって軽く細胞を詰めます。次に、18ゲージの針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、脂肪細胞懸濁液の下に残りの洗浄バッファーを除去し、ピペットを使用して成熟した脂肪細胞の上に浮かぶ自由な脂質層を除去する。成熟したアディポサイトの播種のために、透過性膜挿入成分を無菌表面に逆さまに置き、パックされたアディポサイトのチューブを数回穏やかに反転させ、細胞の均等な分布を確保する。

広いボアピペットチップを使用して、各膜に30マイクロリットルのパックされた成熟したアディポサイトを加えます。1 つの滑らかな動きで挿入パネルを反転して、シードされたアディポサイトが挿入物の底部に配置されるようにします。インサートのパネルを、井戸あたり37度の完全な培地の500〜1,000マイクロリットルを含む24ウェルプレートに入れなさい。

その後、プレートを覆い、慎重にプレートを組織培養インキュベーターに入れる。培養の7日ごとに、各インサートの切り抜き穴を介して培地を交換する。培養の1週間後、成熟脂肪細胞凝集体は、成熟脂肪細胞でのみ観察される特徴的な単一の脂質液滴形態を維持する皮下脂肪組織から分離した凝集体である。

PPAR-GAMMAアゴニストのピオグリタゾンおよびロシグリタゾンによる治療は、PPAR-GAMMA応答性遺伝子の発現増加をもたらすが、グルココルチコイド受容体アゴニストデキサメタゾンによる治療はこれらの遺伝子に影響を及ぼさない。同様に、グルココルチコイド受容体アゴニストはグルココルチコイド受容体標的遺伝子の遺伝子発現を強く駆動し、PPAR-GAMMAアゴニストはこれらの遺伝子に有意な影響を及ぼさない。さらに、PPAR-GAMMAアゴニストによる7日間の治療は、褐色脂肪特異的遺伝子UCP1の遺伝子発現を強く誘導する。

当社の新しい脂肪細胞in vitroモデルは、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解を含む成熟脂肪細胞の機能研究に使用できます。この新しいアディポサイト培養技術により、ヒトの成熟した白色のアディポサイトが茶色のようなアディポサイトにトランスパ分化できることを示すことができました。