これまでのアプローチは、試験管内で間葉系幹細胞を得るための侵襲性の高い方法に依存していましたが、それらの間葉系幹細胞は、30〜60%の範囲の効率で30%の不均一プールを生成するという限界がありましたここでは、ナイルレッドを用いたソーティングによって成熟脂肪細胞の純粋な集団を産生できる、急速に増殖する間葉系幹細胞を大量に生産するためのプロトコルを提示します。iPS細胞が80%コンフルエントに達したら、細胞をDPBSで洗浄し、EDTAを含む解離培地を加えます。細胞を摂氏37度で1分間インキュベートします。
1分後、解離試薬を吸引し、細胞を摂氏37度でさらに1分間置きます。次に、インキュベーターからプレートを取り外します。ウェルあたり1ミリリットルのStemFlex培地を追加し、15ミリリットルの円錐管に細胞を注意深く集めます。
細胞を遠心分離します。上清を取り除き、10マイクロモルの岩石阻害剤を含む3ミリリットルのMSC分化培地に穏やかに再懸濁します。細胞懸濁液を混合し、ウェルあたり500マイクロリットルを24ウェル超低アタッチメントプレートに分配します。
次にプレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。24時間後、達成された胚体を誘導するために、それらを15ミリリットルのチューブに集めて落ち着かせます。15分後、上清を除去し、10マイクロモルのレチノイン酸を添加したMSC分化培地を加える。
胚体を穏やかに再懸濁し、ウェルあたり500マイクロリットルを同じ24ウェル超低アタッチメントプレートに分配します。次にプレートをインキュベーターに入れます。48時間後、胚体を15ミリリットルのチューブに集め、15分間落ち着かせます。
その後、上清を除去し、0.1マイクロモルのレチノイン酸を添加したMSC分化培地を加える。胚体を再懸濁した後、ウェルあたり500マイクロリットルを同じ24ウェルプレートに分配し、プレートをインキュベーターに入れます。最後のレチノイン酸処理から48時間後、胚体を採取し、上清を除去し、サイトカインを含まないDMEM低グルコース培地を追加します。
同じ24ウェル超低接着プレートにウェルあたり500マイクロリットルの細胞懸濁液を穏やかに再懸濁して分配し、プレートを摂氏37度でインキュベートします。48時間後、iPS細胞由来胚体をプレートし、15ミリリットルのチューブに胚体を採取し、沈降させた後、上清を除去し、2ミリリットルの新鮮なMSC分化培地に再懸濁する。次に、懸濁液を基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートの2つのウェルに移し、細胞を摂氏37度でインキュベートします。
5日後、使用済み培地を、1ミリリットルあたり2.5ナノグラムの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む新しいMSC分化培地と交換し、最大11日間および15日間MCS分化を継続します。播種した胚体が80〜90%コンフルエントに達したら、DPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを添加し、摂氏37度で1分間インキュベートして継代します。プレートからトリプシン-EDTAを取り出し、摂氏37度で1分間再びインキュベートします。
次に、ウェルあたり1ミリリットルの培地を追加します。3分後、15ミリリットルのコニカルチューブ内のMSC分化培地を使用して細胞を回収し、細胞を遠心分離します。次いで、塩基性線維芽細胞増殖因子を含むMSC分化培地に細胞を再懸濁し、細胞を基底膜マトリックスコートプレート上に1対3の割合でプレートする。
MSCが90%コンフルエンスに達した後、成長停止期間を経ることができるように、さらに48時間培養を続けます。次に培地を取り出し、DBPSで細胞を洗浄します。洗浄後、完全脂肪細胞分化培地をプレートに加え、細胞を摂氏37度でインキュベートします。
14日間一日おきに培地を交換してください。iPS細胞由来MSCを脂肪細胞に分化させる。ナイルレッドを使用して脂肪細胞を選別するには、テキスト原稿に記載されているように、DMSOでナイルレッド作業溶液を調製します。
使用前に、原液を解凍し、DPBSで再構成して、300ナノモルの作業溶液濃度を達成してください。脂肪細胞分化の14日目以降に、細胞から培地を廃棄し、DPBSを用いて洗浄する。それからナイルレッド作業溶液を加えなさい。
プレートを覆い、細胞を摂氏37度でインキュベートします。15分後、ナイルレッド溶液をトリプシン-EDTAと交換し、細胞を摂氏37度で4分間インキュベートします。次に、15ミリリットルのコニカルチューブに5%FBSを含むDMEMを使用して細胞を収集し、細胞を遠心分離します。
上清を除去し、細胞を1ミリリットルあたり100万細胞の密度でDPBSに再懸濁します。次いで、FACSソーターを用いて、FL-1チャネルを用いてナイル赤陽性細胞を単離する。選別した細胞を採取し、脂肪細胞分化培地で再培養するか、RNA抽出に進み、脂肪細胞分化マーカーの定量解析を行います。
分化を開始すると、懸濁液に播種された細胞は、定義された細胞境界を有する円形であり、直径が小から中のサイズである。胚体の生存能力は、より多くの間葉系を生じさせる急速な増殖挙動によって観察される。この急速な増殖挙動は、その独特で細長い形態とともに、MSCを新しいマトリックスコーティングされたプレートに通過させた後でも保持されます。
良好な分化により、間葉系表面マーカーCD73、CD44、およびCD90の発現効率が90%を超える信頼性の高いMSCが得られます。また、造血表現型CD14、CD34、CD19を描いた表面マーカーが存在しない細胞の評価では、発現効率は1%未満であり、最終分化型脂肪細胞のマーカーであるFABP4の細胞質分布における高発現は、その発生成熟を示しています。さらに、脂肪細胞成熟の別のマーカーであるアディポネクチンの高発現は、脂肪細胞がグルコースシグナル伝達に応答して脂質貯蔵および脂肪生成を受けるのに十分機能的であることを示している。
染色後、ナイルレッドは脂質を含む成熟脂肪細胞にのみ結合するため、蛍光活性化フローサイトメトリーを使用して成熟脂肪細胞を選別するための効果的なツールとなります。ナイル赤陽性細胞は、選別されていない細胞と比較して、成熟マーカーの有意なアップレギュレーションを少なくとも2倍示しています。胚体形成や間葉系細胞の解離時に細胞を採取する際には、間葉系幹細胞の解離後の生存効率に大きな影響を与えるため、非常に穏やかでなければなりません。
変異を有する患者から得られた脂肪細胞の純粋な集団は、サンプルの不均一性によってデータが影響を受けることなく、特定の突然変異によって影響を受ける調節経路およびシグナル伝達経路を決定するために、機能的および全トランスクリプトームシーケンシングを受けることができます。この技術により、間葉系幹細胞をin vitroでスケーラブルに生成できるため、ヒトドナーから間葉系幹細胞を採取して脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に容易に分化させ、組織関連疾患の病因を理解する必要がなくなります。
