SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

IL-3およびWEHI-3D​​-馴化培地の調製のソース注：マウス顆粒球性白血病細胞株WEHI-3D​​は、IL-3を含有する馴化培地を生成するために培養されます。 <ol><li> 50μg/ mlのゲンタマイシンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％の長寿命グルタミンサプリメント、文化WEHI-3D​​。 T175のcm 3の組織培養フラスコ中の新鮮な培地50mlに対数増殖期中5×10 6個の細胞を接種し、約7日間増殖または細胞が約24による成長のそれらの対数期を経過するまで- 48時間（培養中の過剰な細胞死を避けるため）。 500 mlの一度に製造することができる - 馴化培地を200のバッチがので、-20℃で、複数の年間保存することが可能です。 </li><li> 15分には、細胞と細胞破片を除去するために、1,000×gでフラスコとスピンからの流体および細胞をデカントします。 supernのトップ90％を削除しますatant。 0.22μmのフィルターユニットを通して濾過。 </li><li>小分けしWEHI-3D​​馴化培地（CM）1ミリリットル中に、-20℃での保存のために50ミリリットルと200ミリリットルのボリュームまたは-70℃です。小さなアリコートを分析の準備、因子依存性細胞株の継代培養培地を作製するための中間ボリューム、および長期保存のために大容量のために有用です。 IL-3は、無菌条件下で使用した場合ので、解凍した媒体は、数週間保存することができ、4℃で比較的安定です。 </li><li>代替的に、0.22μmフィルターユニットを通して濾過した後、培地中に希釈した50 ng / mlでの濃度で組換えマウスIL-3を使用します。 </li></ol> VEGFR-2-EpoRを-BA / F3および制御するBa / F3細胞株の2文化と評価<ol><li> DMEMで培養制御するBa / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシンまたはペニシリン/ストレプトマイシンサプリメント、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CM安定。細胞からの3日ごとに約1時15希釈で継代細胞対数期で増殖。 </li><li> DMEMで培養VEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞を、10％FBS、50μg/ mlのゲンタマイシン、1％L-グルタミンおよび10％WEHI-3D​​-CMおよび1mg / mlのG418を安定化。対数期に増殖している細胞から1：15希釈で継代細胞。キメラ受容体の構築および発現の詳細については24を参照してください。 </li><li>中期対数期培養物から収穫制御するBa / F3またはVEGFR2-EpoRを-BA / F3細胞。穏やかにフラスコの底から、これらの非付着細胞を除去するために、ピペット。培地IL-3を含むを除去するために（細胞ペレットを回収するために5分間750×gで、10 mlの遠心分離）を、マウスの等張リン酸緩衝食塩水、pHが7.3（PBS）で3回洗浄します。 </li><li>その後、ウォッシュWEHI-3D-CMまたは組換えIL-3を含まないDMEMと添加剤と一度細胞、および13.5μlのあたり7.4×10 4細胞/ ml（ すなわち、1,000細胞の濃度で、この培地中で再懸濁し、10,000個の細胞あたり血球計数器を用いて計数することによって決定されるように135μL）のためにそれぞれのアッセイの半定量的または定量的のバージョンで使用しています。 </li><li>トリパンブルー排除（注意）によって生存のために細胞を評価します。細胞集団で1と血球計数器に100個の細胞の最小値をカウント：PBS（0.4％）1にトリパンブルーを混ぜます。色素を取る細胞は死んだか死んで考えられています。 98％以上の生存率アッセイを行うために必要とされます。 </li></ol> 3.半定量的アッセイ<ol><li> RTで72ウェルのマイクロウェルプレートのウェルにIL-3欠損培地の13.5μlの中に含まれる洗浄された細胞（1,000細胞）を追加します。重力がバイアス細胞濃度をしないことによって、細胞沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してください。よく較正されたP20自動ピペット、およびオートクレーブ処理のヒントを参考にしてください。 </li><li>較正されたP20ピペットまたは、好ましくは、P2ピペットを用いて（ウェルあたり1,000個の細胞を含む15μlの最終容量を作り、1.5μl）を10％の体積でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。 CAを取ります再サンプルはpH、塩および他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認します。可能であれば、（それぞれ、 例えば、DMEMまたはPBS）に適合する培地または緩衝液を使用するか、またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。同じチップで粉砕して、混合を確実にします。 </li><li>対照サンプルについては、単独で含有ノーIL-3を培地（i）を含みます。 （ⅱ）WEHI-3BD-CMは10％最終容量で、単独で培地に添加し;および/または（iii）VEGF-Aには、IL-3を含まない、培地単独中を100ng / mlに希釈しました。 </li><li>滅菌水、PBSまたは媒体とマイクロウェルプレートの未使用井戸を記入し、（水に浸したティッシュペーパーで）加湿容器内にプレートを配置したガス交換を可能にします。 10％CO 2の加湿雰囲気中で容器内の細胞をインキュベートします。試験サンプルおよびメディアコンポーネントが利用可能である場合、このアッセイは、快適に一人で3時間に設定することができます。 </li><li>典型的に16時間後にプレートを評価しますインキュベーションは、その時に正と負のサンプル間の時間差別は明らかです。細胞が培養中に表示される方法の例については、 図3を参照してください。 100倍の倍率 - 40で標準的な倒立位相差顕微鏡を使用してプレートを分析します。 注：ウェルズはラウンドと半透明表示されるセルが含まれていますように、IL-3またはVEGF-Aとして支持する成長因子を含みます。支援的な成長因子を含まない、または培地のみを含むウェルは、円形細胞の数、ならびに死亡または瀕死の細胞および細胞破片（例えば、 図3C）を低減しています。 24〜48時間後のインキュベーションでアッセイを評価する感度のために最適です。 </li></ol> 4.定量的バイオアッセイ<ol><li>室温での標準的な96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、IL-3欠乏培地中で洗浄された細胞（135μl中10,000細胞）を加えます。 CEには影響しません重力によって細胞の沈降を確実にするために等分中に細胞懸濁液を混合するために注意してくださいLL濃度。 </li><li>較正されたピペット（P20）を使用して、10％の容量（15μL）でウェルに試験サンプルおよびコントロールを追加します。試料はpH、塩または他の細胞増殖抑制性/潜在的な細胞傷害性物質の面でのBa / F3細胞の培養条件と互換性があることを確認するために注意してください。可能な場合は、互換性のあるメディアを使用するか、バッファー（ 例えば 、DMEMまたはPBS）またはそのような培地または緩衝液中に希釈します。フィルターは、0.22μmの細孔酢酸セルロース遠心管フィルターユニットを用いて少量を滅菌します。 </li><li> 48時間、10％CO 2の加湿雰囲気中で、細胞、成長因子および/ ​​または阻害剤の薬剤の混合物をインキュベートします。水に浸したティッシュペーパーを有しており、ガス交換を可能にする加湿容器内にアッセイを行います。ウェル中の生細胞数の代理マーカーは、インキュベーション期間の終了時に、その下に記載されている代替方法のいずれかを使用してアッセイを評価しています。 </li><li> 代替＃1：3 H-thymidineの設立 注：この定量化は、96ウェルプレートフォーマットのために設計されています。 <ol><li> 37°C（ウェル当たり150μlの体積）で48時間、アッセイプレートのインキュベーションの後、（IL-3 / WEHI-3D ​​CMなしのBa / F3培地）アッセイ培地を50μlの体積で3 H-チミジンを加えますウェルあたり1μCiの最終用量を与え、20μCiの/ mlの濃度でウェルあたり。 </li><li>セルハーベスターを用いて細胞を回収する前に、37℃でさらに4時間培養します。シンチラントにフィルタを配置することによって、個々のサンプルを抽出し、液体シンチレーションカウンターで定量化します。 </li></ol></li><li> 代替＃2：携帯ATPの生物発光検出 注：このアプローチは、集団内の生存細胞を反映した生物発光信号を生成することができる細胞溶解物と組み合わせたATPモニタリング試薬を使用しています。 <ol><li> ATPを抽出し、生成するATPモニタリング試薬を使用するために細胞を溶解製造業者の説明書に従って発光シグナル。 96ウェルプレートフォーマットと互換性のルミノメーターを使用して発光をお読みください。 </li></ol></li><li> 代替＃3：生存可能な細胞によるインジケータ染料の酵素的還元 注：レサズリンベースのアッセイは、細胞生存率に対して良好な相関を示します。 <ol><li>レサズリン系色素で培養した細胞を組み合わせて、製造業者の説明書に従って、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイを定量化します。 </li></ol></li></ol>

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スティーブンA.スタッカーとマルク・M.アーヘンは、概日テクノロジーズ株式会社、成長因子のVEGFファミリーを標的とすることにより治療薬を開発する会社では株主です。

ここに記載のアッセイは、増殖因子に依存する高い生存性の細胞を、使用することに依存しています。細胞は、したがって、彼らが要因に依存していることを確認し、キメラ受容体の発現を維持するために慎重に培養する必要があります。媒体は作りたてと過度に長期間およびWEHI-3D​​ CMが重要である高活性であることが格納されていないことを保証します。細胞は完全に救出リガンドに細...

分泌タンパク質成長因子およびその同族の細胞表面受容体の血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの可溶性リガンドおよび膜埋め込み受容体、細胞膜を横切ってシグナルを伝達におけるそれぞれその機能の重要かつ多様な群です。彼らは、内皮細胞でだけでなく、上皮由来の細胞と免疫系1,2のもので、主に機能します。リガンド活性化VEGF受容体（のVEGFR）によって係合さシグナル伝達経路は、加齢性黄斑変性症および癌などの主要な病態において重要であり、それらを標的とする治療薬は、頻繁な臨床用途（VEGF-Aを標的とする、例えば、モノクローナル抗体ベバシズマブ）であります3,4。 VEGFファミリーの複雑さの一つは、自然界に存在する可溶性リガンド（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、パラポックスウイルス属ファミリーORFとヘビ毒VEGF、加えて他によってコードされるVEGFタンパク質の多様性であります抑制するVEGF-A）2のアイソフォーム。 これらのリガンドは、受容体チロシンキナーゼファミリーの3つのメンバー、すなわちVEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3と相互作用します。これらの受容体は、可変異なる細胞型上で発現されるが、多くの場合、すべてのサイズ5の血液やリンパ管を裏打ちする内皮細胞の表面上に共発現されます。 VEGFR-2は、哺乳動物のリガンドのVEGF-6、VEGF-C 7およびVEGF-D 8,9と同様にオルフウイルスVEGF 10とヘビ毒VEGF 11を結合することができます。 VEGFR-2は、胚発生、創傷治癒、癌、および眼疾患における血管形成（既存の血管か​​らの新しい血管の成長）を駆動する際に主要な役割を果たしています。これらの状況では、そのようなVEGF-A、-C及び-Dバインドなどとリガンドは、血液、血管内皮細胞12-15上の受容体を活性化させます。リンパ管内皮細胞上で、VEGFR-2は、リンパ管形成、新しいリンパ管16を形成する役割を果たしています。 VEGFR-2はまた、拡張および健常組織と疾患17の主要な動脈およびリンパ管の拡大を促進することができます。 VEGFR-2の完全な理解：リガンド相互作用は、血管新生依存性疾患18の治療に使用するための阻害剤の開発のためには重要です。 VEGFR-2のVEGF-A結合のほとんどのアイソフォームは、VEGF-CおよびVEGF-Dのタンパク質分解切断はVEGFR-2 19,20に高い結合親和性を示すVEGF-相同ドメインからなるフラグメントを放出するために必要とされます。 我々は（特殊な培地を必要とする）を購入するには高価通過に技術的に困難である初代内皮細胞の必要性を回避するために設計され、VEGFR-2のリガンドを監視するためのバイオアッセイ、および文化21を開発し、複数のVEGFRおよび関連コを表現しています受容体22。スタッドに目的とする場合、他のVEGF受容体または共受容体とVEGFR-2のヘテロ二は、不必要な複雑さを引き起こす可能性がありますyのバイナリ受容体-リガンド相互作用、特異的な受容体に起因する活性を評価する、または阻害剤の効果を評価する。23。バイオアッセイは、細胞膜に関連する受容体の可動性を保持し、VEGFR-2の細胞外領域に結合し、架橋するリガンドの能力の評価を可能にします。 バイオアッセイは、（この場合はVEGFR-2）のVEGF受容体の細胞外領域を貫通し、エリスロポエチン受容体（EpoRを）、サイトカイン受容体ファミリーのメンバーの細胞内領域に融合されたキメラ受容体の構築に依存しています8,24。この融合タンパク質は、その後、結合し、受容体の細胞外ドメインが可能な細胞質エフェクター領域の活性化を引き起こす架橋することができるリガンドとその刺激によって、因子依存性プロB細胞系のBa / F3で表され細胞を促進するために、ヤヌスキナーゼ（のJAK）を介して生存シグナルを伝達生存および/または増殖。対照的に、リガンドと全長VEGFR-2と同じ細胞型において、および刺激の発現は、VEGFR-2経路の近位シグナル伝達エフェクターは、この細胞タイプでは利用できないことを示す、細胞の生存と増殖を促進しません。 私たちは、新規VEGFR-2リガンド10,19,20,24-29の結合を調査するために、種々の状況でアッセイを使用していました。 VEGFR-3-EpoRを-BA / F3アッセイと組み合わせて、我々は、VEGFR-2およびVEGFR-3 30に結合し、架橋のための相対的なVEGF-Cの活性とVEGF-Dの成長因子を比較しました。アッセイは、VEGFR-2またはVEGF-D、可溶性VEGFR-2トラップ及びVEGFファミリー31を標的とするペプチド模倣体に対するモノクローナル中和抗体の阻害活性を特徴付けるために使用されてきました。アッセイはまた、一次内皮細胞における試験の前にバインドするために、異なるオルフウイルス株からのVEGFの能力とクロスリンクVEGFR-2を表示するために使用されました<s&gt; 10,26アップ。アッセイは、それらがより面倒な内皮細胞アッセイ25時または浄化成長のための評価のプロトコルは27因子に導入される前に速やかに活性を評価することができるのVEGFの変異体の迅速なスクリーニングのために特に有用です。 私たちが説明するアッセイは、実施が容易であり、かつ半定量的バージョンは、成長因子、抗体または他の実験のための可溶性受容体ドメインの生産や精製を監視するときに時々必要とされる迅速な決定を可能にします。アッセイの使いやすさは、特定の組織または器官系から血液やリンパ管由来初代内皮細胞を用いて行われ、さらに、より完全な研究を補完する理想的なことができます。

<table><tbody><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td></tr><tr><td>G418 Sulphate (Geneticin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-gn-5</td><td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-Thymidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET-027</td><td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td></tr><tr><td>Vialight Plus Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-221</td><td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td></tr><tr><td>Prestoblue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13261</td><td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td></tr><tr><td>Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>136528</td><td>Small microtitre plate</td></tr><tr><td>96 well Tissue Culture Plate</td><td>Falcon, Corning Inc.</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>Gibco</td><td>11965-92</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Cell Harvester</td><td>Tomtec Life Sciences</td><td></td><td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter</td><td>LKB Wallac</td><td>1205</td><td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td></tr><tr><td>UniFilter-96 GF/B</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005177</td><td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &amp;micro;m poresize</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>8160</td><td>Centrifuge tube filters have a 0.22 &amp;micro;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500 &amp;micro;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

血管生物学に関与する受容体チロシンキナーゼおよびそれらの相互作用するリガンドの分析を伴う関連する受容体のファミリーの構成的発現、関連するリガンドの広い範囲と専門内皮細胞の初代培養物を扱うのが困難にしばしば困難です。ここでは、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管新生およびリンパ管新生を促進シグナルの主要なトランスデューサに対するリガンドを検出するためのバイオアッセイを説明します。エリスロポエチン受容体（EpoRを）の膜貫通および細胞質領域とVEGFR-2の細胞外（リガンド結合）領域の融合体をコードするcDNAは、因子依存性細胞株のBa / F3で表されます。この細胞株は、インターロイキン-3（IL-3）、24時間以内に細胞死におけるこの因子の結果の離脱の存在下で成長します。 VEGFR-2 / EpoRを受容体融合生存を促進する別のメカニズムを提供するの発現およびPotentiaでLLY融合タンパク質（ すなわち 、することができますクロスリンクVEGFR-2細胞外領域1）の細胞外部分に結合し、架橋することができるリガンドの存在下で安定にトランスフェクトされたBa / F3細胞の増殖。リガンドと細胞の少量を24時間で迅速な結果を可能にする半定量的アプローチ、および生存細胞数の代理マーカーを含む定量的アプローチ：このアッセイは、2つの方法で行うことができます。アッセイは実行が比較的容易であり、既知のVEGFR-2リガンドに応答性の高いであり、そのような受容体またはリガンドに対するモノクローナル抗体、および可溶性リガンドトラップとしてVEGFR-2シグナル伝達の細胞外阻害剤を収容することができます。

このセクションでは、VEGFR-2-EpoRを-BA / F3バイオアッセイ（アッセイの原理については、 図1を参照）の本質的な特徴を実証する実験の結果を示します。その他の公表された研究は、代替VEGFR-2リガンド、変異型VEGF分子および抑制性モノクローナル抗体8,10,19,24-30ためのアッセイのより広範なアプリケーションを示しています。 <p class="jove_content" fo:...

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A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K ビュー.  Peter MacCallum Cancer Centre. 我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。 

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Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

生物学

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

発生生物学

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

免疫・感染学

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

医学

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

スクラッチ創傷移動とスフェロイドスプラウティングアッセイを用いた血管新生の研究

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

著者スポットライト:アッセイ開発における課題と革新による血管新生の調査

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

要約

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血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

ラット間膜の血管新生アッセイ

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

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血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

ラット間膜の血管新生アッセイ

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価