Name: a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors
Uploaded: 2016-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

IL-3의 제조의 소스 WEHI-3D​​ 에어컨 중간 주 : 마우스 과립 구성 백혈병 세포주 WEHI-3D​​는 IL-3을 함유하는 합성 배지를 생성하기 위해 배양한다. <ol><li> 둘 베코 변형 이글 배지에서 배양 WEHI-3D​​ (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 긴 수명 글루타민 보충제, 50 μg의가 / ㎖ 젠타 마이신. T175의 cm 3 조직 배양 플라스크에서 신선한 배지 50 ㎖로 성장 로그 단계에서 5 × 106 세포를 접종하고 약 7 일 동안 성장 또는 세포를 약 24으로 성장 그 로그 상을 통과 할 때까지 - 48 시간 (문화 과도한 세포 사멸을 방지). 500 mL를 한번에 제조 할 수있다 - (200)의 배치가되도록 조정 배지는 -20 ° C에서 여러 해 동안 저장 될 수있다. </li><li> 15 분은 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 1,000 × g으로 플라스크와 스핀에서 유체 및 세포를 가만히 따르다. supern의 최고 90 %를 제거atant. 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 필터링합니다. </li><li> 1 ml를 50 mL 및 -20 ° C에서 저장을위한 200 ml의 볼륨 또는 -70 ° C ~로 나누어지는 WEHI-3D​​ 에어컨 매체 (CM). 작은 분취 량의 장기 저장을위한 분석 준비 인자 의존적 세포주의 통과를위한 배양 배지를 제조하기위한 중간 볼륨 큰 볼륨에 유용하다. IL-3는 무균 조건 하에서 사용하는 경우 너무 해동 매체가 몇 주 동안 저장 될 수있다 4 ° C에서 상대적으로 안정적이다. </li><li> 대안 적으로, 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 여과 된 후 배지로 희석하여 50 ng를 / ㎖의 농도로 재조합 마우스 IL-3를 사용한다. </li></ol> VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 및 제어 바 / F3 셀 라인 2. 문화 및 평가 <ol><li> DMEM에서 배양 바 제어 / F3 세포를 10 % FBS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 또는 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 안정화. 세포로부터 3 일에 대한 1시 15분 희석에서 통과 세포로그 상에 성장합니다. </li><li> DMEM에서 배양-VEGFR2 EPOR-BA / F3 세포를 10 % FBS가를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 및 1 ㎎ / ㎖의 G418을 안정화. 로그 상에 성장하는 세포에서 1시 15분 희석에 통로 세포. 키메라 수용체의 구조와 표현에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오. </li><li> 중앙 로그 상 문화에서 수확 제어 바 / F3 또는 VEGFR2-EPOR - 바 / F3 세포. 천천히 플라스크의 바닥으로부터 이들 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 피펫. 매체 IL-3를 함유 제거 (세포 펠렛을 회수하기 위해 5 분 동안 750 x g에서 10 ㎖, 원심 분리), 마우스 긴장성 인산 완충 식염수, pH가 7.3 (PBS)으로 세 번 세척 하였다. </li><li> 10,000 세포 당 후 세척 상기 WEHI-3D-CM 또는 재조합 IL-3없이 회 DMEM 및 첨가제와 함께 세포, 및 7.4 × 104 세포 / ㎖ (즉, 13.5 μL 당 1000 세포의 농도로이 배지에 재현 탁 혈구를 사용하여 계산에 의해 결정된 135 μL)에 대한각각 분석의 반 정량적 또는 정량 버전에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 트리 판 블루 제외 (주의)에 의해 생존을위한 세포를 평가합니다. 세포 집단으로 1 혈구 100 셀들의 최소 개수 : PBS (0.4 %) (1)에 트리 판 블루를 섞는다. 염료을 차지 세포가 죽었거나 죽어 간주됩니다. 98 % 이상의 생존율 분석을 수행 할 필요가있다. </li></ol> 3. 반 정량 분석 <ol><li> RT에서 72 웰 마이크로 웰 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 매체의 13.5 μL에 포함 된 세척 세포 (1,000 세포)를 추가합니다. 중력 바이어스 세포 농도를하지 않습니다에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의하십시오. 잘 보정 P20 자동 피펫 및 멸균 팁을 사용합니다. </li><li> 교정 P20 피펫 또는, 바람직하게는, P2 피펫을 사용하여 (물론 1,000 세포를 포함하는 15 μL의 최종 볼륨을, 1.5 μL) 10 % 볼륨 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 캘리포니아를 타고재는 샘플의 pH, 소금 및 기타 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인합니다. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예를 들면, DMEM 또는 PBS, 각각) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 같은 팁 분쇄 혼합 보장합니다. </li><li> 대조 시료를 들어, (ⅰ) 보통 단독으로 함유 더 포함 IL-3,하지 (ⅱ) WEHI-3BD CM-10 %의 최종 부피에서 단독 배지에 첨가; 및 / 또는 (ⅲ) VEGF-A에는 IL-3를 함유하지 않는 단독 배지에서 100ng의 / ㎖로 희석 하였다. </li><li> 멸균, PBS 또는 매체와 마이크로 웰 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채우고 수 있도록 가스 교환 (물 티슈 페이퍼 젖과) 가습 컨테이너 내에서 접시를 놓습니다. 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 컨테이너 내에 세포를 인큐베이션. 테스트 샘플 및 미디어 구성 요소를 사용할 수있는 경우이 분석은 편안하게 한 사람이 3 시간에 설정할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 16 시간 후 번호판을 평가배양이되는 포지티브 및 네거티브 샘플 사이의 시간 차별은 분명하다. 세포 배양에 표시하는 방법의 예 그림 3을 참조하십시오. 100 × 배율 - 40 표준 역 위상차 현미경을 사용하여 번호판을 분석합니다. 참고 : 웰스 둥근 반투명 표시 셀을 포함 이러한 IL-3 또는 VEGF-A로지지 성장 인자를 포함. 지지 성장 인자없이 또는 배지 단독 웰 둥근 세포뿐만 아니라 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 찌꺼기 (예컨대,도 3c)의 수를 감소한다. 24 ~ 48 시간 게시물 배양에서 분석 평가하는 것은 감도 최적입니다. </li></ol> 4. 양적 생물 검정 <ol><li> RT에서 표준 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 배지에서 세정 균체 (135 μL 10,000 세포)를 추가한다. 가전​​ 영향을주지 않습니다 중력에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의LL 농도. </li><li> 10 % 볼륨 (15 μL) 보정 피펫 (P20)를 사용에서 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 샘플의 pH, 소금 또는 다른 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인하기 위해주의하십시오. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예., DMEM 또는 PBS) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 필터는 0.22 ㎛의 세공 셀룰로오스 아세테이트 원심 관 필터 유닛을 이용하여 소량 살균. </li><li> 48 시간 동안 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포 성장 인자 및 / 또는 억제제 제의 혼합물을 인큐베이션. 물에 적신 휴지를 가지고 있으며, 가스 교환을 할 수있는 가습 컨테이너 내에서 분석을 수행합니다. 잘 내 생존 세포 수의 대용 마커 배양 기간의 종료에서, 이는 아래에 나열된 다른 방법 중 하나를 사용하여 분석 평가이다. </li><li> 대안 1 : 3 H-thymidi북동 설립 참고 :이 정량은 96 웰 플레이트 형식을 위해 설계되었습니다. <ol><li> 37 ° C (웰 당 150 ㎕의 부피)에서 48 시간 동안 분석 플레이트를 배양 한 후 (IL-3 / WEHI-3D ​​CM없이 학사 / F3 배지) 분석 배지 50 ㎕의 부피로 3 H 티미 딘을 추가 웰 당 1 μCi를 최종 투여 20 μCi를주고 잘 / ml의 농도로 당. </li><li> 셀 수확기를 사용하여 세포를 수확하기 전에 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 접시를 품어. 섬광에 필터를 배치하여 각각의 샘플을 추출하여 액체 섬광 계수기로 정량화. </li></ol></li><li> 대안 # 2 : 셀룰러 ATP의 생물 발광 검출 주 :이 방법은 집단의 생존 세포를 반영하는 생물 발광 신호를 생성 할 수있는 세포 용 해물과 결합 된 ATP 모니터링 시약을 사용한다. <ol><li> 를 Lyse 세포 ATP를 추출하고, 생성하는 ATP 모니터링 시약을 사용제조업체의 지시에 따라, 발광 신호를 출력한다. 96 웰 플레이트 형식과 호환 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오. </li></ol></li><li> 대안 3 : 실행 가능한 세포에 의한 표시 염료의 효소 감소 참고 : 레사 주린 기반 분석은 세포 생존에 좋은 상관 관계를 보여줍니다. <ol><li> 레사 주린 계 염료로 배양 된 세포를 결합하고 제조자의 지시에 따른 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 정량화. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

스티븐 A. 스태커 및 마크 M. Achen은 일주기 기술 (주), 성장 인자의 VEGF 가족을 대상으로 치료제를 개발하는 회사의 주주입니다.

여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D​​ CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지?...

분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4. VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체. 이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 - 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 ​​나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다. 우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 - 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능​​력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다. 생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 - 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다. 우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 <s&gt; 10, 26입니다. 분석은 그들이 더 힘든 내피 세포 분석 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다. 우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.

<table><tbody><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td></tr><tr><td>G418 Sulphate (Geneticin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-gn-5</td><td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-Thymidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET-027</td><td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td></tr><tr><td>Vialight Plus Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-221</td><td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td></tr><tr><td>Prestoblue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13261</td><td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td></tr><tr><td>Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>136528</td><td>Small microtitre plate</td></tr><tr><td>96 well Tissue Culture Plate</td><td>Falcon, Corning Inc.</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>Gibco</td><td>11965-92</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Cell Harvester</td><td>Tomtec Life Sciences</td><td></td><td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter</td><td>LKB Wallac</td><td>1205</td><td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td></tr><tr><td>UniFilter-96 GF/B</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005177</td><td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &amp;micro;m poresize</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>8160</td><td>Centrifuge tube filters have a 0.22 &amp;micro;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500 &amp;micro;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 - 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 - 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.

이 섹션에서는, 우리는 VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정 (분석의 원리 그림 1 참조)의 필수 기능을 보여주는 실험의 결과를 보여줍니다. 다른 발표 된 연구는 다른 VEGFR-2 리간드, 돌연변이 VEGF 분자 및 저해 모노클로 날 항체 8,10,19,24-30에 대한 분석의 광범위한 응용 프로그램을 보여줍니다. 여기에 제시된 데?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K 조회수.  Peter MacCallum Cancer Centre.  우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다. 

비디오: A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

연구

생물학

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

발생학

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

면역학 및 감염병학

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

의학

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Scratch Wound Migration 및 Spheroid Srouting Assay를 이용한 혈관신생 연구

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

저자 스포트라이트: Investigating Angiogenesis Through Challenges and Innovations in Assay Development(분석 개발의 과제와 혁신을 통한 혈관신생 조사)

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.