Name: isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des israelischen Gesundheitsministerium skizziert durchgeführt. Alle Tiere wurden nach dem bewährten institutionellen Tierpflege Protokoll IL-02302-2015 des Technion Israel Institute of Technology behandelt. 1. Experimentelle Vorbereitung <ol><li> Herstellung von Chelat Fetal Bovine Serum Anmerkung: Epitheliale Zellen sind sehr empfindlich gegen Calcium, so dass es entscheidend ist, die Exposition dieser Zellen zu Calcium zu steuern. Um sicherzustellen , dass die Zellen zu Calcium nicht während des Isolierungsprozesses Chelat ausgesetzt wird verwendet , die für die Zubereitung Fetal Bovine Serum verwendet Färbepuffer 29 jegliches restliches Calcium zu entfernen. Das folgende Protokoll bereitet etwa 1 l Calcium freien Fetal Bovine Serum, die für die Zubereitung FACS Färbepuffers. <ol><li> In 400 g trockenem Chelat - Material, zB., Chelex, in einem 4 - Liter - Becher und H 2 O auf ein Gesamtvolumen 4 L. Abdeckung destilliert hinzufügen und kontinuierlich mit einem Magnetrührer rühren. </li><li> PH-Einstellung auf 7,4 unter Verwendung von 10 N HCl-Lösung unter Rühren. Fahren Sie für 20 min gerührt und erneut den pH-Wert nach Bedarf, bis der pH für mehr als 20 min stabil bleibt. </li><li> Inkubieren Becher bei 4 ° C über Nacht das chelatbildende Material erlauben eine kompakte Pellet zu bilden. Sorgfältig absaugen H 2 O und fügen Sie frisch destilliertem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 4 L. </li><li> Wiederholen der pH-Einstellung, wie in Schritt 1.1.2. </li><li> Das Becherglas bei 4 ° C für 1 Stunde die chelatbildende Material zu ermöglichen, einen kompakten Pellet zu bilden. Sorgfältig absaugen H 2 O. </li><li> Langsam zwei 500-ml-Flaschen von Serum auf die Chelat-Material Rinderföten hinzufügen. Rühren langsam bei 4 ° C für 1 Stunde sicherstellt, dass die Geschwindigkeitseinstellung keine Blasen erzeugt. </li><li> Das Becherglas bei 4 ° C für 1 Stunde die Chelat-Material zu ermöglichen, eine comp zu bildenhandeln Pellet. </li><li> übertragen Sie vorsichtig das Serum in 1 l Glasflasche und filtern sie durch eine Flasche Top-Filter unter sterilen Bedingungen. Lagern Sie die Chelat-Serum bei -20 ° C oder sofort ab. </li></ol></li><li> Herstellung von Färbepuffer <ol><li> Bereiten Sie 100 ml 3% als Chelat FBS in PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ und auf Eis halten. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von Haarfollikeln aus adulten Epidermis <ol><li> Anesthetize Mäuse unter Verwendung von 5% Isofluran ein Induktionsfeld an. Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert unter Verwendung von 50-80 Tage alten Mäusen, die in der Telogenphase des HF-Zyklus sind. </li><li> Euthanize Mäuse nach Standard-Laborverfahren. Hier einschläfern Mäuse CO 2 Überdosis in einer Euthanasie Kammer verwendet wird . </li><li> Shave alle Haare aus der Rückenhaut mit elektrischen Haarschneider. Vermeiden Sie Kopf und Gliedmaßen. Halten Sie die Clippers so nah wie möglich an der Haut. Vermeiden Sie die Haut und das Unterhautschicht zu beschädigen. </li&gt; <li> Wenn alle Haare entfernt wird, verwenden 70% Ethanol keine Haarrückstände zu entfernen, und die dorsale Haut zu desinfizieren. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem Sezieren-Pad, und mit einer Pinzette ziehen die Haut in der Nähe der Schwanz und machen einen kleinen Einschnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die gesamte Rückenhaut in einer posterior-anterior durch sorgfältig die Haut Wegschneiden und es von der Faszie zu trennen. Vermeiden Sie die subkutane Schicht zu beschädigen. </li><li> Legen Sie die Haut auf einer Sezieren Matte, Haarseite nach unten, und festzunageln zwei benachbarte Kanten der Haut an Ort und Stelle zu fixieren. Ziehen Sie das Fett abkratzen, mit einem stumpfen Skalpell, bis die Dermis klar und ordentlich ist. Hinweis: Wenn das Fett Abschaben, gebogenen Pinzette verwenden, um sanften Druck auf die Haut auftragen. Wenden Sie Druck auf die Haut der gekrümmten Seite der Pinzette. Dadurch wird die Haut vor dem Reißen zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Haut, Dermis Seite nach unten, in 100 mm sterile Kulturschale und glätten die Haut, um sicherzustellen, dass es keine Falten. 10 ml PBS ohne Ca 2+ </sup&gt; und Mg 2+ (PBS -) an der Kulturschale und die Haut glätten , wenn nötig. </li><li> Saugen Sie das PBS und 10 ml 0,25% Trypsin hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Haut entfaltet und schwimmt frei. Inkubieren einem Stück Haut pro 10 ml von 0,25% Trypsin. </li><li> Inkubieren Proben bei 37 ° C für 30-120 min oder bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Herstellung von Einzelzellsuspension von Haarfollikeln <ol><li> Scrape alle die Haare aus der Haut mit einer gebogenen Pinzette und Skalpell in einer von vorne nach hinten Richtung. Halten Sie die Haut anstelle der gekrümmten Seite der Pinzette und verwenden Sie das Skalpell das Haar abkratzen. Hinweis: Kratzen Sie die Haare in die Trypsin-Lösung aus hinzugefügt in Schritt 2.8. Beginnen Sie am Schwanz und folgen der Richtung des Haarwachstums. Scraping gegen die Richtung des Haarwachstums wird in erheblichen Verlust an HFs und Reduzierung der Zellausbeute zur Folge haben. HFs neigen dazu, jede zusammen und bilden kleine Klumpen zu halten; um th zu reduzierene Größe von HF Klumpen versuchen, einen kleinen Bereich zu einer Zeit, abzukratzen. </li><li> Übertragen Sie die unbehaarte Haut auf neue Kulturschale und 10 ml PBS - zu verhindern , dass sie vor dem Austrocknen. Untersuchen Sie die Haut und kratzen alle verbleibenden Haare ab. </li><li> Überwinden Sie die HFs mit einem Skalpell und Pinzette, bis ein einzelner HF Suspension erhalten wird. mit 10 ml Pipette für ein paar Minuten Energisch verreiben die HF Suspension alle Haare Klumpen aufzubrechen. Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie die HF-Suspension in voretikettierten 50-ml-Tube. </li><li> Saugen Sie das PBS - von der Haut und es verwenden , die Zellkulturschale zu spülen, die die HF - Suspension enthalten ist ; Transfer zum 50-ml-Tube. </li><li> Waschen <ol><li> Filtern der Suspension durch Durchleiten durch eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb auf ein Rohr 50 ml ausgestattet. Waschen Sie die ersten 50 - ml - Tube und das Sieb mit 10 ml Färbepuffers (PBS - mit 3% als Chelat FBS). </li><li> Filtern Sie die Suspension durch Einleitenbis 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb auf eine 50-ml-Röhrchen ausgestattet. Waschen des Röhrchens mit 5-10 ml Färbepuffer, um sicherzustellen, daß alle Zellen auf die neue Röhrchen überführt wurden. Halten Sie die Suspension auf Eis, bis alle Tiere verarbeitet wurden. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 300 × g bei 4 ° C. Sorgfältig absaugen Überstand ohne in 5 ml Färbepuffer das Pellet und Pellet zu stören. </li><li> Zentrifuge für 5 min 300 × g bei 4 ° C. vorsichtig absaugen Überstand und Zellpellet in 800 ul Färbepuffers. Hinweis: Die Volumina oben angegebenen genug Zellen für die Färbung, die von zwei erwachsenen Mäusen. </li></ol></li><li> Transfer Suspension in voretikettierten FACS-Röhrchen. <ol><li> Für Kontrollen Rohre nehmen 25-50 ul Zellsuspension (oder jede Rest links aus der Zellsuspension) und bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ul mit Färbepuffers bilden. Hinweis: Bereiten Kontrollröhrchen (Gesamtvolumen 300 ul) für ungefärbte (keine Antikörperund kein DAPI); DAPI nur; Integrin β1; Integrin α6; Sca-1; CD34. </li></ol></li><li> Fügen Sie die primären Antikörper und DAPI (siehe Materialien Tabelle für geeignete Verdünnungen) in den gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Röhrchen. Flick vorsichtig die Schläuche der Zellsuspension zu mischen. Die Rendite auf das Eis und mit Alufolie abdecken, um vor Licht zu schützen. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten auf Eis und sanft die Röhren alle 10 min schnippen, um sicherzustellen, Zellen in Suspension gehalten werden. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch jedes FACS-Röhrchen mit Färbepuffers Auffüllen (ca. 4 ml pro Röhrchen); Zentrifuge für 5 min bei 300 × g bei 4 ° C. </li><li> vorsichtig absaugen Überstand und Zellpellet in 800 ul Färbepuffers. </li><li> Übertragen Zellsuspension in FACS-Röhrchen mit Zellsieb caps Einzelzellsuspension zu gewährleisten. </li></ol> 4. Durchflusscytometrieanalyse <ol><li> Gehen Sie zu der Zelle sofort Sortieren einer Strömung mit Zytometer mit geeigneten Filtern für Signal Erkennung. Verwenden 405 nm violett (für Messungen von DAPI), 488 nm blau (für Messungen von FSC, SSC, PE, PE-Cy7 und FITC) und 633 nm rot-Laser (zur Anregung von APC) Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Gerät von Detektoren für alle drei Fluoreszenzkanäle aufzeichnet. </li><li> Set Fluoreszenz-Gates basierend auf ungefärbten Proben und Kompensation für die spektrale Überlappung einzelnen gefärbten Kontrollen verwenden. Hinweis: Verwenden Sie die einzelnen gefärbten Kontrollen zur Einstellung der Kompensation zwischen den Kanälen, um jegliche Überlappung der Fluoreszenzsignale zu eliminieren. Kompensationseinstellung hängt von der FACS-Sorter verwendet. </li><li> Richten Sie primäre Tore auf DAPI basierend auf tote Zellen auszuschließen. </li><li> Stellen Sie die Streudiagramm (SSC-A gegen FSC-A) für Singulett-Ereignisse auszuwählen. </li><li> Richten Sie FSC und SSC Höhe und Breite Parameter für Dubletten zu eliminieren und für Singulett-Ereignisse unterscheiden. </li><li> Gate-Zellen mit hoher α6 und β1 Expression und aus dieser Population-Gate-Zellen entweder mit CD34 hohe Expression oder Sca1 hohe Expression. </li><li> Sortier Zellen in vormarkiert FACS-Röhrchen. Hinweis: Zwei allgemeine Populationen von Zellen isoliert werden können; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - und α6 + / β1 + / Sca-1 + / CD34 -. Sortierte Zellen sollten zu jeder Zeit auf Eis gehalten werden, bis sie nachgelagerten Anwendungen wie Zellkultur oder RNA-Isolierung verwendet werden, </li></ol>

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The authors have nothing to declare

Das hier beschriebene Protokoll ist gut etabliert für HFSCs aus der Rückenhaut von erwachsenen Mäusen isoliert , sondern kann ebenso für die Isolierung von anderen Populationen innerhalb der HF - Struktur angewendet werden, basierend auf der Auswahl von Markern 2,16,23,28,29. Dieses Verfahren ist insbesondere vorteilhaft gegenüber anderen Verfahren der Zellisolation, wie Gewebe Dissoziation, daß ein spezifischer Zelltyp kann aus einer Mischung aus heterogenen Zellpopulationen, ausgewählt und geerntet w...

Adulte Stammzellen (SCs) sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Homöostase Gewebe durch sterbende Zellen zu ersetzen und beschädigten Gewebe auf Verletzungen zu reparieren. Diese SCs sind definiert durch ihre Fähigkeit , kontinuierliche Selbsterneuerung zu unterziehen und in verschiedene Zelllinien 1-3 zu unterscheiden. Die am besten untersuchten Systeme, die bei Erwachsenen SCs für ihre Nachschub abhängig sind, gehören das hämatopoetische System, den Darm und die Haut 1,2,4. Während der Embryonalentwicklung, beginnt die Haut als eine einzelne Schicht von Epidermiszellen. Morphogenese des Haarfollikels (HF) beginnt , wenn mesenchymalen Zellen der Haut besiedeln und eine darunterliegende Dermis kollagenen 5 bilden. Specialized mesenchymalen Zellen, die später die Hautpapilla bilden (DP), organisieren direkt unter der Epidermis und stimulieren das Epithel Haar Plakoden zu bilden , die nach unten 6 zu wachsen beginnen. proliferierende hochMatrixZellen, am Boden des HF befindet,umhüllen diese mesenchymalen Zellen und bilden die Haarzwiebel, während die innere Schicht in konzentrische Zylinder zu unterscheiden beginnt den Haarschaft (HS) und dem umgebenden inneren Wurzelscheide (IRS) 2,3 zu bilden. In der postnatalen Leben ist die Haut Epidermis aus drei Kammern besteht: die interfollikulären Epidermis (IFE), der Talgdrüse (SG) und dem HF. Im Gegensatz zu der IFE und SG , die in einem ständigen Zustand der Homöostase sind, ist der HF ein dynamischer Mini-Organ , das kontinuierliche Zyklen von Wachstum (Anagen) erfährt, Zerstörung (catagen) und Ruhe (Telogen) 4,7. Die Haarfollikel - Stammzellen (HFSCs) , dass der Kraftstoff dieser ewigen Kreislauf, befinden sich in einer Nische innerhalb der HF als Ausbuchtung bekannt 4. Während Anagen die HFSCs die Beule zu verlassen, nach der Aktivierung Signale von der DP, beginnen wuchernden und absteigen nach unten so einen langen linearen Spur von Zellen als die äußere Wurzelscheide bekannt zu schaffen (ORS) 8-10. Die Matrixzellen, dassumgeben das DP an der Basis des HF, schnell Zyklus und nach oben wandern terminalen Differenzierung erfährt somit die HS und der IRS - 10 (Abbildung 1) zu erzeugen. Die Dauer der Anagenphase bestimmt die Länge des Haares und ist abhängig von der proliferative und Differenzierungsfähigkeit der Matrixzellen 6. Wenn die HF Catagen kommt, die Durchfuhr verstärkenden Matrixzellen in der Birne nicht mehr vermehren, Apoptose und vollständig zurückbilden , während die DP nach oben ziehen , bis sie die nicht- teil Teil des 8,11 HF erreicht. Während dieses Zurückziehens bildet die HF eine temporäre Struktur wie der epithelialen Stranges bekannt, welche aus catagen charakteristisch ist, und enthält viele apoptotische Zellen. Bei Mäusen catagen dauert zwischen 3-4 Tagen und wird in der ersten Haarzyklus hoch synchronisiert. Wenn die HF Telogen alle HFSCs erreicht werden Ruhe. Die unterschiedlichen Stufen des HF-Zyklus werden auch durch Veränderungen in der Farbe der Maushaut durch m gekennzeichnetelanin Produktion. Die Haut von schwarz während Anagen bis dunkelgrau während catagen während Telogen 6,7,12,13 bis rosa. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Abbildung 1: Haarfollikels Zyklus. Die HF besteht aus einem permanenten oberen Teil und einem unteren ständig Umbau, Radfahren Abschnitt, der kontinuierlichen Zyklen des schnellen Wachstums (Anagen) erfährt, Zerstörung (catagen) und einer relativen Ruhe Phase oder Ruhe (Telogen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern Version dieser Figur.</a> Die SCs die HF Aufrechterhaltung wurden zunächst mit Chase - Experimenten identifiziert, mit tritiiertem Thymidin, die eine Bevölkerung von langsamen Radfahren Etiketthaltezellen (LRC) ergab , dass 14 knapp unterhalb der SG in der permanenten Bereich der HF wohnhaft war . Die Fortschritte in der HFSCCharakterisierung ergab eine kleine Anzahl von Markern, die verwendet werden können , spezifische SCs von der HF Nische 15 zu identifizieren und zu isolieren. Vielleicht ist der beste Marker für die Anreicherung von HFSCs ist CD34, ein Zelloberflächenmarker auch als hämatopoetische SC Marker identifiziert beim Menschen 16. Innerhalb dieser CD34 + Populationen zwei unterschiedliche Populationen wurden auf α6 Integrinexpression 2 auch isoliert basiert. Ein weiterer Marker ist Keratin 15 (K15) , die stark in der bauchige Bereich ausgedrückt wird, co-lokalisiert mit CD34 - Expression und eine K15 - Promotor für das Targeting und die Isolierung HFSCs in transgenen Tieren 15,17-19 verwendet. In den letzten zehn Jahren haben mehrere andere unterschiedliche Populationen von HFSCs und Vorläuferzellen auch im HF wohnen 17,20-27 berichtet. Eine weitere spannende Feature von HFSCs ist ihr Beitrag zur Haut zu reparieren. Unter normalen Bedingungen wieder aufzufüllen HFSCs die HF und nehmen nicht an IFE Homöostase. However, als Reaktion auf Verwundung, verlassen diese Zellen ihre SC Nische und die Hilfe bei der IFE 9 repopulating. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Mäuse , die pro-apoptotische SEPT4 / ARTS Gen Anzeige eine erhöhte Anzahl von CD34, K15 und Sox9 + HFSCs, gelöscht , die eine Resistenz gegenüber Apoptose zeigen. HFSCs wurden aus SEPT4 / ARTS isoliert - / - dorsale Haut fluorescence activated cell Verwendung Sortierung (FACS) , und es war mehr als eine zweifache Zunahme in der Anzahl von CD34 + und K15 + HFSCs. Diese SEPT4 / ARTS - / - HFSCs wurden in vitro erweitert und nicht nur gab Anlass zu mehr Kolonien , sondern konnten auch härteren Bedingungen standhalten , im Vergleich zu den Kontrollen 28. Als Folge einer erhöhten Anzahl von HFSCs aufweist, SEPT4 / ARTS - / - -Mäusen signifikant schneller als Reaktion auf Hautexzision Verletzungen geheilt. Auffallender, SEPT4 / ARTS - / - Mäuse displayeda große Anzahl von regenerierten HFs aus dem Wundbett und deutlich kleinere Narben. Weiterhin für XIAP (X-chromosomal - Inhibitor der Apoptose) gelöscht Mäuse, die biochemische Ziel von ARTS, zeigte beeinträchtigte Heilung 28. Unsere Ergebnisse und die Arbeit in anderen Laboratorien haben gezeigt, dass HFSCs als ideales Modell für die Biologie und Funktion von Erwachsenen SCs zu studieren. Hier beschreiben wir die Methodik für die Anreicherung und Isolierung von HFSCs und epidermalen Keratinozyten auf der Grundlage der Expression von vier Marker: Integrin α6; Integrin β1; Sca-1 (ein Marker für den epidermalen Keratinozyten) und CD34. Ähnliche Isolierung von K15 + HFSCs können auch die K15-GFP reporter Maus 19 durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Anreicherung und Isolierung von zwei Arten von Populationen. Ausbuchtung SCs und epidermalen Keratinozyten Abbildung 2 die wichtigsten Schritte des Protokolls darstellt. Unter Verwendung der Haut von der dorsalen entfernt wieder von 8 Wochen alten Mäusen, angereichert wir Ausbuchtung SCs die CD34 Marker, die nur in HFSCs exprimiert wird; und Sca-1, das epidermalen Keratinozyten Etiketten. 3 zeigt unterschiedlich...

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Aufrufe.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Serie: Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Biologie

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...