Name: isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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この研究は、潰瘍性大腸炎（R01AR069653〜Zhang LJ）および国立衛生研究所（5T32AR062496-03〜CA）によって支持された。

すべての動物実験は、UCSD機関動物管理および使用委員会の承認を受けています。 1.新生児皮膚由来の初代マウスKC単離および培養<ol><li> C57B / 6野生型マウス系統の生後0-2日の新生児をハサミを用いた断頭により犠牲にする。手首と足首の関節のすぐ上の手足を切断し、小さな穴を残して尻尾を完全に切断します。 </li><li> 皮膚全体を剥がすには、まず鋭いはさみを尾の穴に挿入し、身体の背中の中央線に沿って首の開口部に皮膚を切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した身体と他の鉗子で皮膚をつかみ、身体から皮膚全体を1つの連続した動きで脚の切り株に静かに引き剥がします。 <ol><li>損傷のない部分として皮膚を剥がし、皮膚を破片に分解しないように注意してください。これは、ディスパーゼ工程中に細胞が失われるためです。 </li></ol></li> &lt;10cmのペトリ皿中の15mLの滅菌PBSで剥離した皮膚をすすぎ、次にKC増殖培地中に4mg / mLのディスパーゼを含む氷冷ディスパーゼ消化緩衝液を充填した2mLのチューブに各仔の皮膚を入れる（KC基礎培地は0.06mMのCaCl 2 、dGSおよび抗生物質/抗真菌薬を有する）。 注：複数の皮膚分離株を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり最大5つのスキン）でインキュベートすることができます。ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。 <ol><li>皮膚が折り畳まれていないことを確認してください。折り畳まれた部分がディスパーゼ溶液に不十分に曝されることになります。 </li></ol></li><li>翌日（ディスパーゼで12〜18時間後）、ディスパーゼ溶液と共に皮膚をペトリ皿に移す。過剰のディスパーゼを洗い流すために、15mLの滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に各組織片を移す。 </li><li> 2対の鉗子を使用して、PBSから皮膚をつかみ、皮膚を持ち上げ、表側を下に、真皮側を上にして新しいペトリ皿に移す。肌のひだを注意深く引き伸ばし、ペトリ皿に完全に引き伸ばす。 </li><li> 新しいペトリ皿に各皮膚のためのトリプシンベースの消化溶液500μLを置きます。鉗子を使用して、表皮を下にして、表皮から真皮をゆっくり持ち上げます。生物を危険な物質として真皮を処分する。分離した表皮を移し、基底層を下にしてトリプシン溶液の各滴に浮遊させる。 <ol><li>表皮がトリプシン溶液で折りたたまれている場合は、上皮からの基底KCの効率的な消化を確実にするために、鉗子を使用して折り畳みを除去します。 </li></ol></li><li>穏やかに攪拌しながら水平シェーカー上で20分間室温（蓋を覆った状態）でトリプシン溶液中のペトリ皿上の皮膚をインキュベートする。 </li><li> 表皮あたり2mLの補充KC増殖培地（1平方インチあたり約1平方インチ表皮）をペトリ皿に加える。鉗子を使用して表皮を把握し、表皮を前後に激しくこすって表皮シートから単一細胞を放出させる。 <ol><li>細胞が表皮から分離するにつれて、中程度の濁りがますます激しくなるのを見てください。ペトリ皿を傾けて収集し、細胞懸濁液を新しいチューブに移し、残りの表皮シートを皿上に残す。 </li></ol></li><li> 2mLのKC増殖培地を添加した後、表皮シートをこすって2回以上繰り返し、同じチューブ内の細胞懸濁液を合わせる。 </li><li>適切な血清学的ピペットを使用して細胞塊を壊すために、細胞溶液を上下に穏やかに数回ピペットし、100μmフィルターに通して新しい50mL遠心チューブに移す。 </li><li>ろ過した細胞を180 x gで5分間遠心分離する。 </li><li>上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの冷たいKC増殖培地/表皮に静かに再懸濁する。 </li><li>血球計数器で細胞を数える。 <br/&gt;注意：KCは懸濁液中で自発的に分化することができるので、細胞をできるだけ早く播種して細胞の最適な性能を確保する必要があります。細胞を氷上に置くことを推奨します。これは、KC自発分化の速度を低下させるためです。 </li><li> 細胞接着を促進する細胞外マトリックス（ECM）産物で予め被覆した培養皿中のKC増殖培地で5×10 4 / cm 2の密度で細胞を播種する。 注：我々は、市販のものを使用しています（例：ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子（詳細については表を参照）。5％CO 2の加湿インキュベーターで37℃で細胞を培養し、一日おきに補充する。 <ol><li>コーティングのために、細胞播種前に10分〜2時間室温に加温された細胞付着コーティング材料で培養皿をコートする。直前のアタッチメント係数を削除する細胞懸濁液を添加する。 </li></ol></li><li>初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。 </li></ol> 2.成体テールスキンからの一次マウスKC単離<ol><li>動物施設の規定に従って、成体C57BL / 6マウス（好ましくは、6〜15週齢、男性または女性）を屠殺する。テールベースから身体の尾を切り取り、先端に目に見える穴ができるように尾の先端を〜2 mmカットします。 </li><li>尾の皮を剥がすには、まず鋭い刃を使って裾の皮を基部から尾の先端まで切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した尾骨と他の鉗子で皮膚をつかみ、穏やかに1つの連続した動きで骨から尾の皮膚を剥がします。ミッドラインから剥がした肌を切り取って、各部分の長さが2〜3cm未満になるようにします。 </li><li> 剥がした肌をすすいでください10cmのペトリ皿に15mLの滅菌PBSを入れ、次に氷冷ディスパーゼ消化緩衝液（KC増殖培地中の4mg / mLディスパーゼ）で満たした2mLチューブに各尾から皮膚を置く。 注：複数の皮膚片を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり5テールまで）でインキュベートすることもできます。 <ol><li>ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。 </li></ol></li><li>単一の細胞懸濁液を尾の表皮から単離するために、ステップ1.4からステップ1.13を実行する。 </li><li>コラーゲンでプレコートした培養皿中のKC増殖培地中で10×10 4 / cm 2 （血球計算盤で計数）の密度で成体細胞を播種する。 注：市販のコラーゲンベースのコーティングキットを使用しています（詳細については、 表を参照）。細胞を37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターで培養し、1日おきに新鮮な培地を補充した。一般に、c最終的な皿は、細胞播種の30分から1時間前にコラーゲンでコーティングされるべきである。本発明者らは、ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子と比較して、コラーゲンでコーティングした場合、皿に成人のKC付着が有意に増強することを観察する。 </li><li>初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。 </li></ol> 3.高カルシウムによるKCのin vitro分化<ol><li>最終分化を誘導するために、培地中に0.2mMまでCaCl 2を添加する。 </li><li>あるいは、高カルシウムを添加する前に、低カルシウムKC基礎培地に増殖補助剤を添加せずに、一晩培養したKCを飢餓状態にする。 注：成長因子飢餓は早期分化への細胞のコミットメントを高め、早期分化マーカー、例えばK10 5 </。 </li></ol> 4.KBからのUVB照射細胞致死およびTNFα放出<ol><li> KC増殖培地（37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中）でマウスKCを培養し、細胞がコンフルエンシーに達するまで毎日培地を交換する。 UVB照射の直前に、増殖培地を除去し、500μLのPBSと交換する。次に、細胞を25mJ / cm 2 UVBまたはモックコントロール（UVBなし）に付す。 注：UVB照射は、以前10に記載されているように2個の8 W電球（312 nm）を有するハンドヘルドUVBランプを用いて行われます。 UVB照射後、PBSを吸引し、新鮮な培地を加える。 </li><li>測定及び6,8でCCK-8細胞生存率アッセイによって細胞生存率を定量化し、製造業者の説明書11以下の24時間後UVB治療。 </li><li>所望の時点でUVBで処理したKCから馴化培地を収集し、放出されたTNFαを測定する製造業者の指示7、12以下マウスTNF（モノ/モノ）ELISAキットによって馴化培地です。 </li></ol>

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	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent.">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. 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著者は何も開示することはない。

皮膚の表皮は、身体を外部環境から分離し保護し、水分喪失、病原体、熱およびUV照射からの損傷に対する重大な障壁として機能する。 KCは表皮の優勢な細胞系統であり、表皮KCの初代培養は、インビトロでの障壁形成の生物学的プロセスおよび環境傷害に対するKCの応答を研究および理解するのに有用なツールである。 ここでは、初代表皮KCを新生児および成体マ...

皮膚は体の最も大きな臓器であり、最も外側の層は表皮である。表皮は、身体を環境から分離する無傷の表皮障壁を形成する上で決定的に重要な役割を果たし、したがって水分喪失を防ぎ、アレルゲン、病原体およびUVB曝露などの環境傷害から防御する。表皮は、未分化基底ケラチノサイト（KC）の単一層から基底層、棘突起層、顆粒層および角質層からなる多層重層化上皮に発達する。表皮幹細胞および中継増幅細胞の両方からなる基底KCは、増殖性および未分化性である。基本的なKCが細胞周期を終了すると、細胞は分化に拘束され、細胞 - 細胞接合の成熟および表皮透過障壁（EPB）の形成を伴って、表皮の表面に向かって徐々に移動する。棘状層のKCは、早期の差異を示すケラチン10（K10）のようなイオンマーカー; KCが顆粒層に移動すると、細胞はフィラグリン（FLG）、ロリクリン（LOR）およびインボルクリン（INV）などの後期分化マーカーを発現する。角質層では、KCは最終的に分化した角質細胞になり、最終的に新しい細胞がそれらに取って代わると落屑から流出する。 カルシウムは、表皮において最も生理学的に作用する物質であると考えられ、 インビトロおよびインビボで同様の方法で分化を誘発する。正常な皮膚表皮において、カルシウムイオンは、皮膚表面1、2、3に向かって濃度が増加し、特徴的な「濃度勾配」を形成します。カルシウム濃度は、最も低い副層（基底および棘の層）の低レベルから上部の顆粒層のピークまで上昇し、次いで最も表面の層（角質層）において無視できるレベルまで低下する。<html>カルシウム勾配は、カルシウム透過性がKC分化の重要な役割を果たすことを裏付ける成分透過性障壁の出現と同時に発生する。 インビトロでは 、低カルシウム（0.02-0.1mM）は単層としての基底KCの増殖を維持するが、高カルシウム（&gt; 0.1mM）はタイトジャンクション形成および誘導によって示されるように細胞の最終分化への迅速かつ不可逆的なコミットメントを誘導する基底KCS 4、5〜高カルシウム処理時LOR及びINVの。 障壁形成に加えて、表皮KCも皮膚の先天性免疫系の重要な構成要素である。 UVB照射または傷害時に放出される病原体または損傷関連分子パターン（DAMP）に応答して、KCはTNFα、IL6およびIFNβのような大量の炎症性サイトカインを産生し、免疫系の活性化をもたらす&gt; 6、7、8、9。 KCSから適切な炎症性シグナル伝達は、病原体のクリアランスに必要であるが、制御されない炎症性応答は、乾癬および酒6,8として自己炎症性皮膚疾患の発生をトリガすることができます。 全体として、KCは、無傷の皮膚バリアを維持し、病原体侵襲または環境傷害に対する免疫応答を開始する上で重要な役割を果たす。したがって、表皮KCの初代培養は、上皮生物学、KC分化、およびKC刺激による自然免疫応答を研究するための有用な技術である。主要マウス表皮KCの単離および培養は、KCの感受性および様々な外部刺激剤に対する感受性のために、困難なプロセスであり得る。ここでは、新生仔マウスの皮膚からKCを単離して培養する方法を説明します。成体マウスの尾の皮膚。成人のKC単離では、以下の理由により、この組織から十分な量の生存可能なKCを単離することが困難なため、マウス背側皮膚を使用しない：第1に、毛周期（休止期）の休止期における成人背側皮膚は、真皮からの表皮の非効率的な分離をもたらし、これは成功したKC単離のための重要なステップである。第2に、成人の背部皮膚上に存在する高い毛嚢密度は、真皮から表皮を分離することの困難さにさらに寄与する。その代わりに、我々は成体マウスKCsの供給源として尾皮膚を日常的に使用する。なぜなら、この上皮は表皮のKCの3〜5層でより厚いからである。それはまた、表皮の分離を妨げない、より低い毛嚢密度を有し、したがって、マウスの年齢および毛髪サイクリング段階に関係なく、成体マウス尾皮膚からのKC単離を可能にする。孤立した新生児タルKCをゼラチンコート培養皿に播種し、新生児対応細胞と比較して成体細胞が接着する能力が損なわれているため、コラーゲン被覆皿を用いて単離された成体KCを播種する。マウスKCを培養するために、低カルシウム基礎培地に、表皮成長因子（EGF）、ウシトランスフェリン、インスリン様増殖因子c1（IGF1）、プロスタグランジンE2（PGE2）、ウシ血清アルブミン（BSA）およびヒドロコルチゾンを含むdGSを補充する。最初の播種後2〜4日の間に、分化したKCの大部分は毎日の培地交換の間に洗い流すことができ、残りの接着細胞は典型的な敷石形態4を示し 、増殖し、早期分化マーカーK10を発現しない。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td></tr><tr><td>KC basal medium (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>defined growth supplements for culture medium</td></tr><tr><td>Dispase powder</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td></tr><tr><td>Attachment Factor</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>gelatin-based coating material</td></tr><tr><td>Coating Matrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Collagen-based coating material</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell Strainer Nylon mesh</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 cell viability Kit</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Corded Hand-Held UV Lamps</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-watt UV tubes</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Light Inverted Microscope for cell culture</td><td>ZEISS, Jena, Germany</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

ケラチノサイト（KC）は、皮膚の最外層である表皮の優勢な細胞型である。上皮KCは、UVB照射または病原体などの環境傷害に対するインタクトな皮膚バリアを形成することによって、またそれらの傷害に対して炎症反応を開始することによって、皮膚防御を提供する上で重要な役割を果たす。ここでは、新生児マウス皮膚および成体マウス尾皮膚からKCを単離する方法を説明する。本発明者らはまた、キレキシブウシ胎児血清（cFBS）と比較して規定された成長補助剤（dGS）を用いて培養条件を記載する。機能的には、新生児および成人の両方のKCが、高カルシウム誘発性の分化、タイトジャンクションの形成および層別化に対して高い応答性を有することを示す。さらに、培養された成体KCは、UVB誘発細胞死に感受性であり、UVB照射の際に大量のTNFを放出し得る。一緒に、ここに記載された方法は、インビトロモデルの設定のための研究者にとって有用であろう新生児マウスおよび/または成体マウスの表皮生物学を研究する。

高カルシウムは、新生児および成人のKCの最終分化を誘導した。 0.06mM CaCl 2で平板培養し維持した初代マウス表皮KCは、単層として増殖し、個々の細胞は、明確な細胞間空間を有する多角形を有し、コンフルエントになると、石畳の外観を示した（ 図1Aおよび図2A ）。 CaCl 2を0.2mMまで上昇させる...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

上皮ケラチノサイトは、機能的な皮膚バリアを形成し、外部環境傷害に対する宿主防御の最前線に位置付けられる。ここでは、新生児および成体マウスの皮膚からの表皮ケラチノサイトの単離および初代培養、およびケラチノサイトからの最終分化およびUVB誘発性炎症反応の誘導のための方法を記載する。

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.7K ビュー.  UC San Diego. 上皮ケラチノサイトは、機能的な皮膚バリアを形成し、外部環境傷害に対する宿主防御の最前線に位置付けられる。ここでは、新生児および成体マウスの皮膚からの表皮ケラチノサイトの単離および初代培養、およびケラチノサイトからの最終分化およびUVB誘発性炎症反応の誘導のための方法を記載する。 

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

発生生物学

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

生物学

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

生物工学

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

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背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

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世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法