成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

最近、口腔角化細胞は、そのユニークな性質のために注目を集めています。下流用途に適した幹細胞様の状態でマウス経口角化細胞を培養するためのプロトコルを提供する。マウス経口ケラチノサイトの培養と皮膚ケラチノサイトとは異なる特徴を有する。

このプロトコルでは、一次マウス経口ケラチノサイトの単離に成功し、長期培養技術を開発しました。本培養システムは、経口バジル幹細胞の特徴およびそれらの関連疾患をさらに理解するために、分子および生化学的アッセイに採用することができる。●成人C57BLK6Jマウスを犠牲にした後、口の周りの髪を剃り、はさみを使用して、頬から両側の顎に向かって切り取ります。

次に、鉗子を使って口を広く開き、綿棒を使って血液を吸収し、10%ポビドーネヨウ素を含む綿棒で口の中を拭いてパレットを消毒します。マウスパレットを収穫するには、まず外科用メスブレードを使用して、上顎歯のパレット側に沿って完全な厚さの限界切開を行います。その後、ラパサイトリウムを使用して、慎重にパレット全体を解剖します。

抗生物質と抗ミコティック剤を添加した4ミリリットルの完全な培地を含む15ミリリットルのチューブにパレット組織を素早く移す。インキュベーションの準備ができるまで、組織を氷の上に置いてください。層流フードで、抗生物質および抗ミコティック剤を用いた完全な培地4ミリリットルを含む60ミリメートル皿に組織を移す。

次に、短い鈍い鉗子とメスの刃を使用して、組織から血液をそっと取り除き、完全な媒体で組織を10回洗浄します。最後の洗浄後、抗生物質と抗ミコティック剤を補充した0.025%トリプシンの4ミリリットルを含む35ミリメートル皿に組織を移す。上皮表面を下に向けて組織を置き、培養フードの室温で16時間インキュベートします。

一晩トリプシン消化した後、1組の鈍い鉗子を使用してトリプシン溶液から組織を取り除き、上皮表面を上向きにしたトリプシン阻害剤溶液を含む60ミリメートル皿に移します。次に、鉗子でパレットの端につかまり、メスの刃を使用して、下層の層から上皮層を優しく削り取ります。組織から上皮細胞の最大量を収集するには、完全な培地の4ミリリットルで別の60ミリメートル皿に組織を移し、前述のように掻き取り繰り返します。

次に、50ミリリットル円錐形チューブの上に滅菌100ミクロンの細胞ストレーナーを置きます。そして、滅菌ピペットを使用して、その表面を濡らすためにストレーナーにトリプシン溶液の2ミリリットルを転送します。次にピペットを使用し、60ミリメートル皿に細胞懸濁液を数回混合し、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して細胞を濾過する。

細胞数を数えるには、細胞懸濁液の15マイクロリットルを50マイクロリットルのトリパンブルー溶液に加え、細胞トリパンブルーミックスの10マイクロリットルをヘモサイトメーターに移し、細胞数を数える。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を取り除き、チェレックスFBSを含む完全な培地をチューブに2ミリリットル加える。5ミリリットルのピペットを用いて数回、細胞ペレットを再懸濁する。

その後、1匹のマウスから5番目の細胞をコラーゲンタイプ1であらかじめコーティングされた24ウェルプレートの1つのウェルに2〜5回プレートし、培地を変更することなく2日間摂氏37度で細胞をインキュベートします。原発性経口ケラチノサイトは単層として成長し、石畳の形態を示した。小さなケラチノサイトコロニーは3日と5日後に見えた。

インキュベーションの1週間後、これらのコロニーは大きくなり、きついコロニーを形成した。最初の通路は、最初のめっきから2週間行われ、後の通路では、ケラチノサイトは培養期間が短く安定成長を示した。分離プロセス中に有意な線維芽細胞汚染が発生した場合、ケラチノサイトは成長を停止した。

培養後、ケラチノサイトはケラチン14およびα6-インテグリンを発現した。早期および後期の通過細胞は、それらの茎性を確認するP63の均一な発現を示した。しかし、高カルシウムで処理したケラチノサイトは、高カルシウム処理が幹細胞関連遺伝子を抑制することを示すP63発現の低下を示した。

分化マーカーケラチン13は、初期および後期の通路ではまれまたは全く発現しなかったが、高カルシウム治療において有意な発現を示した。線維芽細胞マーカーPDGFRαは、このプロトコルが基底ケラチノサイトを正常に単離し、未分化状態でこれらの細胞を維持できることを示すケラチノサイト培養で発現しなかった。トラップは硬膜外側から始まり、組織サンプルあたり10分であるべきである。

また、一般的に、細胞のピペット化は、細胞の生存率を向上させる上で重要である。2回または3回の通過後、経口角化細胞はさらなる機能実験のために安定する。重要なことに、このプロトコルは、インビトロで細胞および分子アッセイのためのトランスジェニックマウスの生命と組み合わせることができます。

最近の研究では、口腔バジル幹細胞のダイナミクスと不均一性が報告されています。この方法は、口腔幹細胞生物学の研究を容易にし、口腔疾患のより良い理解につながります。