Name: a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di DJJ attraverso il progetto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Le seguenti operazioni delineano il nostro metodo per condurre un esperimento in situ su stadi embrionali e larvali di L. stagnalis. Qualora un passo prevede l&#39;utilizzo di un prodotto chimico pericoloso questo è indicato dalla parola &#39;ATTENZIONE&#39; e tutte le procedure di sicurezza appropriate devono essere adottate. Collegamenti a fogli rappresentative scheda di sicurezza per sostanze chimiche pericolose sono forniti in file supplementare 1. Ricette per tutti i reagenti sono forniti in file integrativa 2. 1. Assemblea dei Decapsulation Apparato <ol><li> Per fare questo, collegare un 20 siringa monouso ml a tubo in silicone (con diametro interno di 1 mm e un diametro esterno di 3 mm) utilizzando un taglio punta P 1.000 a una lunghezza appropriata come mostrato nella Figura 2A. </li><li> Nastro un vetrino da microscopio standard per un grande piatto di Petri invertita. Nastro il tubo in silicone immediatamente adiacente al vetrino da microscopio, come mostrato in figura60; 2C e 2D. </li><li> Riposo un ago di vetro tirato sul vetrino e delicatamente inserirla nel tubo di silicio fino a che la punta dell&#39;ago sporge circa il 20% del modo attraverso il diametro interno del tubo (vedere la Figura 2C e 2D). Una volta che l&#39;ago è in posizione del nastro verso il basso al piatto Petri. </li><li> Lasciare che l&#39;estremità libera del tubo di silicio di riposare in un altro piatto di Petri che raccoglierà il materiale decapsulated. </li></ol> 2. Raccolta dei campioni, Fissazione e Decapsulation NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. <ol><li> Raccogliere accuratamente stringhe di uova dalle mura di un acquario. Per fare questo, utilizzare un pezzo di plastica flessibile come una spatola per raschiare la stringa uovo fuori dal substrato, e utilizzare un setaccio del tè di plastica a pescare la stringa uovo galleggiante fuori dall&#39;acqua. Stage e ordinare il materiale sotto un microscopio utilizzando la guida fornita in Figura1. </li><li> Posizionare la stringa uovo su un tovagliolo di carta e fare una incisione longitudinale lungo la massa delle uova usando le pinze piuma. Arrotolare le capsule uovo fuori della stringa uovo e rimuovere la maggior quantità di materiale gelatinoso possibile da ogni capsula spingendoli intorno al tovagliolo di carta utilizzando le pinze piuma. </li><li> Utilizzando le pinze piuma, trasferire le capsule a base di uova in una capsula di Petri contenente 5 ml di acqua di rubinetto. Continuare a raccogliere de-gelatina capsule uovo degli stadi di sviluppo desiderati in questo piatto. Raccogliere abbastanza capsule da tutti gli stadi di sviluppo per l&#39;esperimento WMISH previsto quindi procedere alla fase successiva. </li><li> Quando si lavora con le larve più sviluppati (5 giorni dopo prima scissione (dpfc) e più anziani) anestetizzare loro prima della fissazione. NOTA: Questo consentirà di evitare i muscoli dal contraente che fa l&#39;interpretazione in situ pattern di colorazione molto difficili. <ol><li> Relax larve (mentre sono ancora nella loro capsules) in una soluzione al 2% w / v di MgCl 2 • 6H 2 O per 30 minuti prima della fissazione. </li><li> Valutare il grado di rilassamento dopo 30 min immergendo diverse larve, pur nelle loro capsule uovo in soluzione fissativo e monitorare la loro risposta al microscopio. Incompleto larve rilassato si ritrae nel loro guscio, mentre le larve completamente rilassato non risponderà. Una volta che queste larve sono state rilassato procedere alla fase successiva. </li></ol></li><li> Trasferire le capsule uovo usando un&#39;ampia pipetta di plastica foro in un tubo sigillato che fornisce 10 volte il volume di capsule uovo (per es., 1 ml di capsule regolate richiederebbe un tubo 10+ ml). </li><li> Aspirare il più liquido possibile dal tubo e sostituirlo con un volume di soluzione di fissativo che è 10 volte il volume delle capsule uovo stanziali. Ruotare delicatamente le capsule a base di uova in fissativo a temperatura ambiente per il momento opportuno per ogni fase di sviluppo (vedi Figura 1). </li><li> DiscontinRotazione ue e consentire le capsule per affondare e aspirare la soluzione fissativo in un contenitore per i rifiuti appropriato. </li><li> Lavare le capsule uovo sostituendo la soluzione fissativa con tampone fosfato con 0,1% Tween-20 (PBTw) e rotante a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare il PBTw e ripetere due volte. </li><li> Rimuovere embrioni e larve di loro capsule utilizzando l&#39;apparecchiatura (vedi paragrafo 1 per i dettagli) mostrata nella Figura 2. Disegnare le capsule nella siringa 20 ml, collegare il tubo e poi dissipare le capsule attraverso il tubo e passato il ago di vetro fuori in il piatto di raccolta. NOTA: In genere, la maggior parte (&gt; 90%) di tutte le capsule dovrebbe essere necessario solo un passaggio attraverso il dispositivo. In molti casi la membrana capsula è danneggiato ma embrioni e larve rimangono all&#39;interno della capsula rottura. Rielaborare questo materiale semplicemente la sua elaborazione nella siringa e dissipare nuovo. </li><li> Raccogliere gli embrioni decapsulate e larve in una provetta da 1,5 ml con un microfonoropipette (a P20 per sul 0 - 3 giorno di età larve, e P200 per le larve anziani con l&#39;estremità della punta tagliati). NOTA: Una pausa (fino a diversi mesi) nel protocollo può essere fatta in questa fase. Se ciò è necessario, il materiale decapsuled dovrebbe essere raccolto in una provetta da 1,5 ml per immagazzinaggio (continua alla fase successiva). In caso contrario, continua immediatamente al protocollo 3. </li><li> Lasciare embrioni e larve a depositarsi sul fondo del tubo e aspirare il surnatante. Sostituire con 33% di etanolo (EtOH) in PBTw e lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 66% EtOH in PBTw e il 100% EtOH. Lavare larve due volte in 100% EtOH a RT. Conservare il materiale a -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Quando si è pronti per continuare, reidratare i campioni rimuovendo il 100% EtOH e la sua sostituzione con il 66% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 33% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Infine lavare con 3x 5 min lavaggi di PBTw per garantire che tutti EtOH viene rimosso. </li></ol> 3. proteinasi-K, TEA e Post-fifissazione NOTA: Troviamo eseguire le seguenti operazioni in piccole ceste con un pavimento a rete il metodo più efficace e delicata per lo scambio rapido di soluzioni critiche di tempo. Mentre questi possono essere fatti in casa, usiamo i cestini (di medie dimensioni) che sono compatibili con il Intavis InSituPro -Vsi movimentazione liquido robot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tali cesti possono essere rapidamente e facilmente spostati tra i pozzetti di una ben coltura tissutale piatto 12 (TCD) per soluzioni di cambio, oppure la soluzione può essere aspirati dal pozzetto con una pipetta. In alternativa, tutti gli scambi di soluzioni possono essere effettuate senza questi cestini semplicemente aspirare il surnatante dal larve. In questo caso un delicato movimento rotatorio si concentrerà tutti gli embrioni e larve al centro del piatto permettendo il surnatante viene rimosso dal bordo del pozzo. Di seguito si presuppone che l&#39;utente sta impiegando cestini per lo scambio di soluzioni. <ol><li> Usando una pipetta, Embrioni e larve di trasferimento in un cesto seduto in un 12 ben TCD con 2 ml di PBTw. NOTA:. Il numero di embrioni e / o larve che possono essere aggiunti dipende dallo stadio di sviluppo in fase di studio, ma una regola generale è quello di mantenere almeno il 25% dello spazio al suolo privo di embrioni / larve (vale a dire, non lo fanno sovraffollamento nel carrello). </li><li> Preparare un adiacente bene con 2 ml di soluzione di proteinasi-K appropriata (vedi Figura 1), e un altro 2 pozzetti con 2 ml di 0,2% Glycine ciascuna. Spostare ogni canestro nel pozzo contenente la concentrazione appropriata di proteinasi-K ed iniziare immediatamente la tempistica. </li><li> Dopo 10 min spostare ciascun cestello in un pozzetto contenente 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Quindi spostare ciascun cestello nella seconda sacca con 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Lavare la glicina con 3x 5 min scambi di 3 ml PBTw. </li><li> Rimuovere la soluzione PBTw e trattare i campioni una volta con trietanolammina (TEA) sol preparati al momentoution per 5 min ATTENZIONE! Non agitare. Sostituire con 3 ml di soluzione di tè appena preparato per 5 min. Non agitate. Aspirare la maggior parte della soluzione di TEA dai campioni. Aggiungere il Trietanolammina appena preparato con la soluzione di anidride acetica (TEAAA) e incubare per 5 min. ATTENZIONE! Non si agita. </li><li> OPTIONAL - Mentre il passo precedente è in incubazione, preparare un altro lotto fresco di soluzione TEAAA e ripetere il passo precedente. NOTA: Questo secondo trattamento con TEAAA è facoltativo, ma può aiutare a eliminare completamente tutti i sfondo con sonde inclini a generare sfondo. </li><li> Rimuovere la soluzione TEAAA aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Non agitate. Rimuovere il PBTw e applicare 3 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw. Mescolare delicatamente di tanto in tanto nel corso di un 30 minuti di incubazione. </li><li> Rimuovere il fissativo aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml. REPosizionare il PBTw con tampone di ibridazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente - ATTENZIONE. </li><li> Porre i tubi in un blocco a caldo a temperatura ambiente, e impostare la temperatura alla temperatura desiderata ibridazione. NOTA: La temperatura di ibridazione è sonda specifica e dovrà essere empiricamente ottimizzati, tuttavia troviamo 55 ° C per essere una buona temperatura di processo inizialmente. Lasciare il blocco di venire alla temperatura di ibridazione, e permettere ai campioni di pre-ibridano per circa 15 min (cioè, il tempo necessario per preparare le riboprobes, più non è necessario). Preparare volumi adeguati (normalmente 100 mL) dei riboprobes diluiti. Abbiamo concentrazioni sonda genere di prova di 100 e 500 ng / ml come una gamma iniziale. Prepariamo riboprobes secondo 12. </li><li> Rimuovere il tampone di ibridazione dai campioni e aggiungere la sonda nel tampone di ibridazione ai campioni. Overlay con 100 microlitri (o un volume sufficiente per formare una fase sopra la buffe ibridazioner) di olio minerale. NOTA: L&#39;olio minerale impedisce vasta condensa che si forma durante l&#39;ibridazione lunga. condensa Extensive altererà significativamente sia la chimica della soluzione di ibridazione e la concentrazione della sonda. </li><li> Denaturare la sonda e RNA bersaglio riscaldando i campioni a 75 ° C per 10 minuti, poi ridurre il calore alla temperatura di ibridazione desiderata. Lasciare ibridazione di procedere per un minimo di 12 ore (O / N) o più a lungo (24-48 ore). </li><li> Durante l&#39;ibridazione rimuovere un singolo tubo dal blocco di calore, ruotare rapidamente tra pollice e indice di sospendere le larve senza disturbare la fase oleosa, e sostituirlo nel blocco di calore. Ripetere questa volta ogni 6-12 ore o giù di lì. </li></ol> 4. Hot Lava e immunorilevazione NOTA: Oltre ad utilizzare un robot di movimentazione liquido per le seguenti operazioni, queste possono facilmente essere fatto manualmente. In questo caso, gli embrioni e larve shoULD essere conservato in provette da 1,5 ml sono stati ibridati in. Tutti gli scambi di soluzioni successive vengono aspirati e ha aggiunto con una pipetta P 1.000. Quando eseguito manualmente ognuno dei seguenti passaggi dovrebbero impiegare 1 ml di ciascuna soluzione. <ol><li> Calore volumi adeguati (3 ml ciascuno per ogni campione) del 4x, 2x e 1x soluzioni di lavaggio alla temperatura di ibridazione. </li><li> Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 4x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 2x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 1X per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. </li><li> Lavare tutti i campioni una volta con 1x Sodio cloruro Sodio Citrato tampone + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) alla temperatura di ibridazione. Lasciare che i campioni raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tutti i campioni due volte in 1x SSC + 0,1% Tween per 15 min Sostituire questa soluzione SSC 1x con maleica Acid Buffer (MAB) e lasciate riposare per 10 minuti Ripetete il MAB wcenere. Sostituire MAB con la soluzione di blocco e incubare per 1,5 ore. </li><li> Sostituire la soluzione di blocco per soluzione di anticorpi (1: 10.000 diluizione degli anticorpi in soluzione di blocco) e incubare per 12 ore (O / N) a temperatura ambiente con agitazione. </li></ol> 5. Colore di sviluppo e di montaggio <ol><li> Aspirare la soluzione di anticorpi e lavare 15 volte con PBTw per 10 minuti ciascuno. Sostituire PBTw con 1x fosfatasi alcalina Buffer (AP) e incubare per 10 min. </li><li> Mentre i suddetti proventi fase di incubazione, preparare la soluzione colorante AP (vedi file supplementare 2) - ATTENZIONE. Trasferire il materiale in un TCD bene e sostituire la soluzione 1x AP con la soluzione AP colorazione. Si noti il ​​tempo in modo che la lunghezza del tempo di reazione di colore avviene per può essere registrato. Monitorare lo sviluppo del pattern di colorazione finché il rapporto segnale sfondo è ottimale. </li><li> Per fermare lo sviluppo del colore, rimuovere la soluzione colorante 1x AP (smaltire nel eri appropriatae container), e applicare 2 ml di PBTw e prendere nota del tempo. Lavare due volte con PBTw per 5 minuti ciascuna. Utilizzare uno di questi risciacqui per trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Rimuovere il PBTw e applicare 1 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw e agitare o ruotare per almeno 30 min a RT (ciò può essere fatto anche O / N). </li><li> Lavare il fissativo con 3 lavaggi di PBT (smaltire il fissativo rifiuti in un contenitore per i rifiuti appropriato). Lavare i campioni 3 volte a 50 ° C in acqua deionizzata. NOTA: Questi lavaggi eliminano la precipitazione dei sali che può diventare visibile durante la compensazione e passaggi di visualizzazione. </li><li> Decidere se i campioni devono essere montati in benzoato benzilico: Alcool benzilico (BB: BA, noto anche come chiaro di Murray) o glicerolo. NOTA: Preferiamo il più potente agente di compensazione BB: BA come L. embrioni stagnalis sono un po &#39;opaco. I campioni per essere montati in BB: BA in primo luogo bisogno di essere disidratati attraverso una serie di etanolo. I campioni da montare nel 60%glicerolo può essere montato immediatamente. </li><li> Trasferire i campioni nella soluzione di montaggio (BB: BA o 60% glicerolo) con una pipetta. NOTA: Durante il montaggio in BB: BA questo deve essere fatto in un bicchiere ben (BB: BA si scioglierà policarbonato). </li><li> Consentire ai campioni di chiaro per 5 - 10 minuti, e poi montarli su un vetrino con un numero adeguato di vetrini accatastati come distanziatori (1 vetrino per i campioni &lt;1 dpfc, 2 lamelle per campioni&gt; 1 dpfc). NOTA: i supporti interi possono ora essere ripreso con un microscopio composto con ottica DIC. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invertebrates. , (2002).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+in+2011.">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li><li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula.:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc,+Crepidula+fornicata.">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li><li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+gene+expression+with+larval+competence,+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina.">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li><li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel,+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance.">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li><li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology.">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li><li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+set+of+maternal+genes?+Insights+from+a+molluscan+transcriptome.">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li><li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis.">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage.">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage,+with+special+reference+to+its'+chemical+embryology.">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium.">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea.">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li><li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod,+Lymnaea+palustris.,+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments.">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li><li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea.">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li><li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis.">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling.">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li><li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina.">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li><li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria.">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li><li>Jackson, D. J., W&#246;rheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions.">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).</li><li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development.">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li><li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto permette la visualizzazione efficiente dei trascritti di RNA con presumibilmente diversi livelli di espressione all&#39;interno di tutte le fasi di sviluppo di Lymnaea stagnalis. Per rimuovere gli embrioni e larve dalle loro capsule abbiamo trialed una varietà di sostanze chimiche, shock osmotico e trattamenti fisici riportati per altri encapsulated- lo sviluppo di organismi modello. Tuttavia, nelle nostre mani il metodo che descriviamo qui è l&#39;unica tecnica high-throughput che rim...

I molluschi sono un gruppo di animali che tengono l&#39;interesse di una vasta diversità di discipline scientifiche. Nonostante la loro diversità morfologica 1, ricchezza di specie (secondo solo a Artropodi in termini di numero di specie 2) e rilevanza per una vasta gamma di commerciali 3, 4 medici e scientifici questioni 5-8, ci sono relativamente poche specie di molluschi che possono vantare di essere entrambi i modelli scientifici ben attrezzate e facili da mantenere in un ambiente di laboratorio. Un mollusco che è molto utilizzato da discipline come la neurobiologia 9, ecotossicologia 10 e la biologia evolutiva, più recentemente 11,12, è Lymnaea stagnalis, soprattutto a causa della sua distribuzione capillare ed estrema facilità di manutenzione. Nonostante la sua popolarità come un organismo &#39;modello&#39; e la sua lunga storia di utilizzo da parte di biologi dello sviluppo 13-19, la gamma e la potenza di strumenti molecolari a disposizione del L. stagnalis comunità scientifica si trova molto indietro che di più modelli tradizionali animali (Drosophila, il mouse, ricci di mare, nematodi). Il nostro desiderio di sviluppare Lymnaea come un modello molecolare deriva da un interesse per i meccanismi molecolari che guidano la formazione del guscio. Questo ci ha spinto a perfezionare un insieme di tecniche che permettano per la visualizzazione efficiente, coerente e sensibile dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo Lymnaea s &#39;. Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è ampiamente utilizzato per una varietà di organismi modello ed è stato in uso per più di 40 anni 20. Nelle sue varie forme, ISH può essere impiegato per localizzare spazialmente loci specifici sui cromosomi, rRNA, mRNA e micro-RNA. Una delle sfide che abbiamo bisogno di affrontare prima di perfezionare un metodo per WMISH L. stagnalis è stata la questione degli embrioni estrazione dolcemente e in modo efficiente e larve di varie fasi, dalla tsi capsule uovo in cui sono depositati. Questa estrazione, o &#39;decapsulation&#39;, deve essere realizzato in modo efficiente per raccogliere materiale adeguato per un dato esperimento in situ, mentre allo stesso tempo mantenere l&#39;integrità morfologica e cellulare. Mentre altri organismi modello subiscono anche lo sviluppo incapsulato, nelle nostre mani nessuno dei metodi riportati per quelle specie potrebbe essere impiegato con successo in L. stagnalis. Gli obiettivi generali di questo metodo sono quindi: per estrarre L. stagnalis embrioni e larve dalle loro capsule in un modo high-throughput, di applicare i trattamenti pre-ibridazione che ottimizzano il segnale WMISH, per preparare gli embrioni e larve con WMISHsignals soddisfacenti per l&#39;imaging.

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è una tecnica che consente la risoluzione spaziale di molecole di acido nucleico (spesso mRNA) all&#39;interno di una preparazione dei tessuti &#39;intero monte&#39;, o stadio di sviluppo (ad esempio, un embrione o larva) di interesse. WMISH è estremamente potente, perché può contribuire in modo significativo alla caratterizzazione funzionale di genomi complessi metazoi, una sfida che sta diventando sempre più di un collo di bottiglia con il diluvio di dati di sequenza di prossima generazione. Nonostante la semplicità concettuale della tecnica molto tempo è spesso necessaria per ottimizzare i vari parametri inerenti esperimenti WMISH per sistemi modello nuovi; sottili differenze nelle proprietà cellulari e biochimiche tra tipi di tessuto e le fasi di sviluppo significa che un singolo metodo WMISH potrebbe non essere adatto per tutte le situazioni. Abbiamo sviluppato una serie di metodi WMISH per il modello gasteropode Lymnaea stagnalis riemergenti che generano coerente esegnali WMISH chiari per una serie di geni, e in tutte le fasi di sviluppo. Questi metodi includono l&#39;assegnazione di larve di sconosciuto età cronologica a una finestra ontogenetica, la rimozione efficiente di embrioni e larve dalle loro capsule uovo, l&#39;applicazione di un idoneo trattamento con proteinasi-K per ogni finestra ontogenetica e ibridazione, post-ibridazione e immunolocalizzazione gradini. Questi metodi forniscono una base da cui il segnale risultante per un dato trascrizione di RNA può essere ulteriormente raffinato con aggiustamenti specifici sonda (principalmente sondare concentrazione e temperatura di ibridazione).

I pattern di colorazione WMISH rappresentante mostrato in Figura 3 sono stati generati utilizzando la tecnica sopra descritta, e riflettono una varietà di modelli di espressione spaziale per geni coinvolti in una serie di processi molecolari che vanno dalla formazione del guscio (gene Novel 1, 2, 3 e 4), alla segnalazione cellula-cellula (DPP) del regolamento di trascrizione (Brachyury) in una serie di fasi di sviluppo. Anche se non a...

Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A monte intero<em&gt; In Situ</em&gt; Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K Views.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Video: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Un metodo non invasivo per<em&gt; In situ</em&gt; Determinazione del successo di accoppiamento in americano femminile Aragoste (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ricerca

Ambiente

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Biologia dello sviluppo

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologia

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

A monte intero

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Un metodo non invasivo per