Name: a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung zu DJJ durch DFG-Projekt # JA2108 / 2-1 unterstützt.

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben , unser Verfahren für eine in - situ - Experiment an embryonalen und Larvenstadien von L. Durchführung stagnalis. Wenn ein Schritt , um die Verwendung eines gefährlichen chemischen beinhaltet dies durch das Wort &quot;ACHTUNG&quot; gekennzeichnet ist und alle entsprechenden Sicherheitsverfahren erlassen werden. Links zu repräsentativen Sicherheitsdatenblätter für gefährliche Chemikalien werden in Ergänzungs Datei 1 zur Verfügung gestellt. Rezepte für alle Reagenzien werden in Ergänzungs Datei 2 zur Verfügung gestellt. 1. Montage von Decapsulation Vorrichtung <ol><li> Um dies zu tun, schließen eine 20 ml Einwegspritze auf Silikonschlauch (mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einem Außendurchmesser von 3 mm) , um eine P1,000 Spitze geschnitten auf eine geeignete Länge , wie in 2A gezeigt. </li><li> Band mit einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit einem invertierten großen Petrischale. Band der Silikonschlauch unmittelbar neben der Mikroskop - Objektträger , wie in Abbildung gezeigt60; 2C und 2D. </li><li> Rest ist eine zog Glasnadel auf dem Objektträger und vorsichtig in den Silikonschlauch einführen , bis die Spitze der Nadel etwa 20% des Weges ragt über den Innendurchmesser des Rohres (siehe Abbildung 2C und 2D). Sobald die Nadel darin Position Band auf der Petrischale nach unten. </li><li> Lassen Sie das freie Ende des Silikonschlauch in einer anderen Petrischale ruhen, die die entkapselten Material sammeln. </li></ol> 2. Probenentnahme, Fixierung und Decapsulation HINWEIS: Alle Schritte werden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. <ol><li> Ei Saiten von den Wänden eines Aquariums sorgfältig sammeln. Um dies zu tun, ein flaches Stück aus flexiblem Kunststoff wie einem Spatel verwenden, um die Ei-String aus dem Substrat zu kratzen, und mit einem Kunststoff-Teesieb das schwebende Ei Schnur aus dem Wasser zu fischen. Bühne und sortieren das Material unter einem Mikroskop mit der Führung in Abbildung versehen1. </li><li> Legen Sie das Ei Zeichenfolge auf einem Papiertuch und machen einen Längsschnitt entlang der Eimasse mit Hilfe der Federzange. Rollen Sie die Ei-Kapseln aus dem Ei-String und entfernen Sie so viel von der Jelly-Material wie möglich aus jeder Kapsel durch sie um das Papiertuch drückt die Feder Pinzette. </li><li> Mit Hilfe der Federzange, übertragen Sie die Ei-Kapseln in eine Petrischale mit 5 ml Leitungswasser. Weiter de-Sülze Ei-Kapseln der gewünschten Entwicklungsstadien in diesem Gericht zu sammeln. Sammeln Sie genug Kapseln aus allen Entwicklungsstadien für die geplante WMISH Experiment dann mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Wenn sie mit weiter entwickelten Larven arbeiten (5 Tage nach der ersten Spaltung (DPFC) und älter) betäuben sie vor der Fixierung. HINWEIS: Dadurch werden die Muskeln von Vertrags verhindern , die die Interpretation der in situ Färbemustern sehr schwierig macht. <ol><li> Relax-Larven (während sie noch in ihrer capsu sindles) in einer 2% igen w / v Lösung von MgCl 2 • 6H 2 O für 30 min vor der Fixierung. </li><li> Beurteilen Sie den Grad der Entspannung nach 30 Minuten durch mehrere Larven während Untertauchen noch in ihrer Ei-Kapseln in Fixierungslösung und die Überwachung ihrer Antwort unter dem Mikroskop. Unvollständig entspannt Larven werden in ihren Schalen zurückziehen, während völlig entspannt Larven nicht reagieren. Sobald diese Larven gelockert worden, um mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Ei - Kapseln eine große Bohrung Plastikpipette in ein verschließbares Röhrchen verwenden , das 10 - fache des Volumens von Ei - Kapseln bietet (z. B. 1 ml der abgewickelten Kapseln würden typischerweise mehr als 10 - ml - Röhrchen erfordern). </li><li> Absaugen so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr und ersetzen mit einem Volumen von Fixierungslösung, die 10-fache Volumen der abgesetzten Ei-Kapseln ist. Vorsichtig drehen für jede Entwicklungsstufe für die entsprechende Zeit bei RT (siehe Abbildung 1) , um die Ei - Kapseln in Fixiermittel. </li><li> Discontinue Rotation und lassen Sie die Kapseln die Fixierungslösung in einen geeigneten Abfallbehälter zu sinken und absaugen. </li><li> Waschen Sie die Ei-Kapseln durch die Fixierungslösung mit Phosphat-gepufferte Saline mit 0,1% Tween-20 (PBTw) ersetzt und Drehen bei RT für 5 min. Saugen Sie das PBTw und zweimal wiederholen. </li><li> Entfernen Embryonen und Larven aus ihren Kapseln unter Verwendung der Vorrichtung in 2 gezeigt ist . Zeichnen Sie die Kapseln bis in die 20 - ml - Spritze (Abschnitt 1 für Details), den Schlauch befestigen und zerstreuen dann die Kapseln durch den Schlauch und vorbei an der Glasnadel aus in die Auffangschale. HINWEIS: Normalerweise ist die Mehrheit (&gt; 90%) aller Kapseln sollten nur einen Durchlauf durch das Gerät benötigen. In vielen Fällen wird die Kapselmembran beschädigt, aber Embryonen und Larven bleiben innerhalb der aufgebrochenen Kapsel. Reprocess dieses Material, indem es einfach nach oben in die Spritze aufgezogen und wieder auszuräumen. </li><li> Sammeln Sie die decapsulated Embryonen und Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen ein Mikrofon mitropipette (a P20 für 0 bis 3 Tage alten Larven und eine P200 für ältere Larven mit dem Ende der Spitze abgeschnitten). Hinweis: eine Pause (bis zu mehreren Monaten) in dem Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wenn dies erforderlich ist, sollte die decapsuled Material in ein 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung gesammelt werden (mit dem nächsten Schritt fortgesetzt). Andernfalls sofort weiter zu Protokoll 3. </li><li> Erlauben Embryonen und Larven auf den Boden des Röhrchens zu sinken und den Überstand absaugen. Ersetzen Sie mit 33% Ethanol (EtOH) in PBTw und lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 66% EtOH in PBTw und 100% EtOH. Waschen Larven zweimal in 100% EtOH bei RT. Lagern Sie das Material bei -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Wenn Sie bereit sind, um fortzufahren, rehydrieren die Proben durch die 100% EtOH zu entfernen und mit 66% EtOH in PBTw ersetzt, lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 33% EtOH in PBTw, sitzen lassen 5 - 10 min. Schließlich waschen mit 3x 5 min Wäschen von PBTw, um sicherzustellen, alle EtOH entfernt wird. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA und Post-fixation HINWEIS: Wir finden die folgenden Schritte in kleinen Körben mit einem Gitterboden, die effizienteste und schonende Methode für die schnelle zeitkritische Lösungen auszutauschen. Während diese können zu Hause gemacht werden, verwenden wir Körbe (mittlere Größe) , die mit der Flüssigkeit InSituPro -Vsi Intavis kompatibel sind Handhabungsroboter (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Solche Körbe können schnell und einfach zwischen den Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturschale (TCD), um Lösungen für den Austausch oder die Lösung abgesaugt werden kann, aus dem Bohrloch mit einer Pipette bewegt werden. Alternativ können alle Lösungsaustausch ohne diese Körbe durchgeführt werden, indem man einfach den Überstand aus den Larven Ansaugen. In diesem Fall wird eine sanfte Wirbelbewegung werden alle Embryonen und Larven in die Mitte des Tellers konzentrieren so dass der Überstand aus dem Rand des Brunnens entfernt werden. Im Folgenden wird angenommen der Benutzer Körbe für Lösungsaustausch verwendet wird. <ol><li> Mit einer Pipette, Transfer Embryonen und Larven in einen Korb in einer 12-Well-TCD mit 2 ml PBTw sitzen. . HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen und / oder Larven , die hinzugefügt werden können , hängt von der Entwicklungsphase untersucht, aber eine Faustregel ist , mindestens 25% der Bodenfläche frei von Embryonen / Larven (dh zu halten, nicht überladen Warenkorb). </li><li> Bereiten Sie eine angrenzende gut mit 2 ml der entsprechenden Proteinase-K - Lösung (siehe Abbildung 1), und weitere 2 Brunnen mit 2 ml 0,2% Glycin je. Bewegen Sie jeden Korb in den Brunnen der entsprechenden Konzentration von Proteinase-K enthält, und sofort Timing starten. </li><li> Nach 10 Minuten jeden Korb in ein gut mit 0,2% Glycin bewegen und für 5 min inkubiert. Dann bewegen Sie jeden Korb in die zweite gut mit 0,2% Glycin und Inkubation für 5 min. Waschen Sie die Glycine mit 3x 5 min Austausch von 3 ml PBTw. </li><li> Entfernen Sie die PBTw Lösung und behandeln die Proben einmal mit frisch zubereiteten Triethanolamin (TEA) solution für 5 min ACHTUNG! schütteln Sie nicht. Ersetzen mit 3 ml frisch zubereitete TEA-Lösung für 5 min. Nicht aufregen. Aspirieren die Mehrheit der TEA-Lösung aus den Proben. Fügen Sie den frisch zubereiteten Triethanolamine mit Essigsäureanhydrid (TEAAA) Lösung und Inkubation für 5 min. ACHTUNG! Sie agitieren nicht. </li><li> Optional - Während der obige Schritt brütet, bereiten eine weitere neue Charge von TEAAA Lösung und wiederholen Sie den Schritt. HINWEIS: Diese zweite Behandlung mit TEAAA optional ist, aber helfen kann vollständig alle Hintergrund mit Sonden zu erzeugen, Hintergrund anfällig zu beseitigen. </li><li> Entfernen Sie die TEAAA Lösung, indem sie es aus dem Brunnen Ansaugen und ersetzen mit 3 ml PBTw. Nicht aufregen. Entfernen Sie die PBTw und gelten 3 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw. verwirbeln sanft gelegentlich während einer 30-minütigen Inkubation. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel durch sie aus dem Bohrloch abgesaugt und ersetzen mit 3 ml PBTw. Übertragen Sie das Material in ein 1,5-ml-Röhrchen. REDie PBTw mit Hybridisierungspuffer und Inkubation bei RT für 5 min - VORSICHT. </li><li> Die Röhrchen in einen heißen Block bei RT, und stellen Sie die Temperatur auf die gewünschte Hybridisierungstemperatur. HINWEIS: Die Hybridisierungstemperatur Sonde, die spezifisch und müssen empirisch optimiert werden, jedoch finden wir, 55 ° C, um anfänglich Versuch eine gute Temperatur. Lassen Sie den Block auf die Hybridisierungstemperatur zu kommen, und damit die Proben vorzunehmen hybridisieren ca. 15 min (dh, es ist die Zeit , die Ribosonden vorzubereiten stattfindet, ist nicht länger erforderlich). Bereiten Sie ausreichende Mengen (in der Regel 100 &amp; mgr; l) der verdünnten Riboproben. Wir in der Regel Studie Sondenkonzentrationen von 100 und 500 ng / ml als Anfangsbereich. Wir bereiten Riboproben nach 12. </li><li> Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer aus den Proben und fügen Sie die Sonde in Hybridisierungspuffer zu den Proben. Overlay mit 100 &amp; mgr; l (oder einer ausreichenden Volumen einer Phase über die Hybridisierung buffe zu bildenr) von Mineralöl. HINWEIS: Das Mineralöl umfangreiche Kondensation verhindert, dass während der langen Hybridisierungsschritt bilden. Extensive Kondensations deutlich sowohl die Chemie der Hybridisierungslösung und die Konzentration der Sonde zu verändern. </li><li> Denaturieren der Sonde und der Ziel-RNA durch Erhitzen der Proben auf 75 ° C für 10 min, dann reduzieren die Wärme an die Hybridisierungstemperatur erwünscht. Zulassen der Hybridisierung für mindestens 12 h (O / N) oder länger ablaufen (von 24 bis 48 h). </li><li> Während der Hybridisierung ein einzelnes Rohr aus dem Wärmeblock entfernen, drehen Sie es schnell zwischen Daumen und Zeigefinger die Larven zu suspendieren, ohne die Ölphase zu stören, und ersetzen Sie es in den Wärmeblock. Wiederholen Sie einmal dies jedes von 6 bis 12 Stunden oder so. </li></ol> 4. Hot Wäscht und Immunnachweis HINWEIS: Während wir eine Flüssigkeitshandhabungsroboter für die folgenden Schritte verwenden, können diese auch leicht manuell erfolgen. In diesem Fall, Embryonen und Larven shoULD in den 1,5-ml-Röhrchen gehalten werden, die sie in hybridisiert wurden. Alle nachfolgenden Lösung tauscht werden abgesaugt und mit einer P1,000 Pipette zugegeben. Wenn manuell durchgeführt für jede der folgenden Schritte sollten 1 ml jeder Lösung einzusetzen. <ol><li> Wärme ausreichende Volumina (je 3 ml für jede Probe) des 4x, 2x und 1x Waschlösungen auf die Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen alle Proben dreimal in Waschpuffer 4x für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen alle Proben dreimal in 2x Waschpuffer für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen Sie alle Proben dreimal in 1x Waschpuffer für jeweils 15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen Sie alle Proben einmal mit 1x Natriumchlorid Natriumcitrat Puffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) bei der Hybridisierungstemperatur. Erlauben Proben auf RT abkühlen. </li><li> Waschen Sie alle Proben zweimal in 1x SSC + 0,1% Tween 15 min Ersetzen Sie diese 1x SSC-Lösung mit Maleinsäure-Puffer (MAB) und lassen Sie sich für 10 Minuten sitzen Wiederholen Sie die MAB wAsche. Ersetzen MAB mit Blocklösung und Inkubation für 1,5 Stunden. </li><li> Tauschen Sie die Blocklösung für Antikörperlösung (1: 10.000 Verdünnung des Antikörpers in Blocklösung) und Inkubation für 12 Stunden (O / N) bei RT unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Farbentwicklung und Montage <ol><li> Absaugen der Antikörperlösung und waschen 15-mal mit PBTw für jeweils 10 min. Ersetzen PBTw mit 1x alkalische Phosphatase-Puffer (AP) und für 10 min inkubiert. </li><li> Während die oben genannten Inkubationsschritt fortschreitet, die Färbelösung AP vorbereiten (siehe Zusatz Datei 2) - VORSICHT. Übertragen Sie das Material in einen TCD gut und ersetzen Sie die 1x AP-Lösung mit AP-Färbelösung. Beachten Sie jetzt die Zeit, so dass die Länge der Zeit, die Farbreaktion stattfindet, für aufgezeichnet werden. Überwachen Sie die Entwicklung des Verfärbungsmuster, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis optimal ist. </li><li> Um die Farbentwicklung zu stoppen, entfernen Sie die 1x AP Färbelösung (entsorgen in der entsprechenden waste-Container) und 2 ml PBTw einsetzen und die Zeit jetzt beachten. Spülen Sie zweimal mit PBTw für jeweils 5 Minuten. Verwenden Sie eine dieser Spülungen das Material in einem 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. </li><li> Entfernen Sie die PBTw und anwenden 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw und agitieren oder drehen für mindestens 30 min bei RT (dies auch O getan werden kann / N). </li><li> Waschen Sie die Fixiermittel mit 3 Waschungen von PBT (entsorgen den Abfall Fixiermittel in einem geeigneten Abfallbehälter). Waschen Sie die Proben 3 mal bei 50 ° C in entionisiertem Wasser. Hinweis: Diese Waschungen eliminieren die Ausfällung von Salzen, die während der Clearing- und Visualisierungsschritte sichtbar werden können. </li><li> Entscheiden Sie, ob die Proben sollten in Benzylbenzoat montiert werden: Benzylalkohol (BB: BA, die auch als Murray klar bekannt) oder Glycerin. HINWEIS: Wir bevorzugen die leistungsfähigeren Clearingstelle BB: BA als L. stagnalis Embryonen sind etwas undurchsichtig. Proben in BB montiert werden: BA wird zunächst durch eine Ethanolreihe dehydratisiert werden müssen. Proben in 60% zu montierendenGlycerin kann sofort montiert werden. </li><li> Übertragen Sie die Proben in die Montagelösung (BB: BA oder 60% Glycerin) mit einer Pipette. HINWEIS: Wenn in BB Montage: BA muss dies auch in einem Glas erfolgen (BB: BA wird Polycarbonat-Kunststoff schmelzen). </li><li> Lassen Sie die Proben für 5 zu löschen - 10 min, und dann montieren sie auf einen Objektträger eine entsprechende Anzahl von gestapelten Deckgläser als Abstandshalter unter Verwendung von (1 Deck für Proben &lt;1 DPFC, 2 Deckgläser für Proben&gt; 1 DPFC). HINWEIS: Vollständige Halterungen können nun eine Verbindung Mikroskop mit DIC-Optik abgebildet werden. </li></ol>

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C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA - Transkripte mit vermutlich unterschiedlichen Expressionsniveaus in allen Entwicklungsstadien der Spitzschlammschnecke. Die Embryonen und Larven aus ihren Kapseln entfernen wir eine Vielzahl von chemischen, osmotischen Schock und physikalische Behandlungen trialed für andere encapsulated- berichtet Entwicklung von Modellorganismen. in unseren Händen Allerdings ist die Methode, die wir hier beschreiben, die nur mit hohem Durchsa...

Mollusken sind eine Gruppe von Tieren, die das Interesse einer breiten Vielfalt wissenschaftlicher Disziplinen halten. Trotz ihrer morphologischen Vielfalt 1, Artenreichtum ( an zweiter Stelle nach den Arthropoden in Bezug auf die Artenzahl 2) und der Relevanz für eine breite Palette von kommerziellen 3, medizinischen 4 und wissenschaftlichen Fragen 5-8, gibt es relativ wenige Mollusken - Arten , die zu behaupten kann , sein beide gut ausgestattete wissenschaftliche Modelle und einfach in einer Laborumgebung zu halten. Ein Mollusken , die viel von Disziplinen wie Neurobiologie 9 verwendet wird, Ökotoxikologie 10 und in jüngerer Zeit die Evolutionsbiologie 11,12, ist Spitzschlammschnecke, in erster Linie wegen seiner weiten Verbreitung und extrem einfache Wartung. Trotz seiner Popularität als &quot;Modell&quot; Organismus und seine lange Geschichte der Verwendung von Entwicklungsbiologen 13-19, die Reichweite und Leistung von molekularen Werkzeugen zur Verfügung, die L. StAGNalis wissenschaftliche Gemeinschaft liegt weit hinter der traditionellen Tiermodellen (Drosophila, Maus, Seeigel, Nematoden). Unser Wunsch zu entwickeln Lymnaea als ein molekulares Modell von einem Interesse an den molekularen Mechanismen ergibt sich die Schalenbildung führen. Dies motiviert uns eine Reihe von Techniken zu verfeinern , die für die effiziente, konsistente und sensible Darstellung der Genexpression während der Lymnaea &#39;s Entwicklung ermöglichen würde. Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist weit verbreitet für eine Vielzahl von Modellorganismen eingesetzt und ist seit mehr als 40 Jahren im Einsatz 20. In seinen verschiedenen Ausprägungen können, ISH räumlich eingesetzt werden, um spezifische Loci auf den Chromosomen, rRNA, mRNA und Mikro-RNAs zu lokalisieren. Eine der Herausforderungen , mussten wir vor der Raffination eine WMISH Verfahren zur L. zu adressieren stagnalis war die Frage der sanft und effizient Embryonen und Larven von verschiedenen Stadien von t Extrahierener Ei-Kapseln, in denen sie abgelegt werden. Diese Extraktion oder &quot;decapsulation &#39;muss effizient angemessene Material zu sammeln eine bestimmte in situ - Experiment, während zur gleichen Zeit die Aufrechterhaltung morphologischen und Zellintegrität um erreicht werden. Während andere Modellorganismen auch gekapselter Entwicklung durchlaufen, konnte erfolgreich in L. eingesetzt werden in unseren Händen keine der Methoden für diese Spezies berichtet stagnalis. Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind daher: L. zu extrahieren stagnalis Embryonen und Larven aus ihren Kapseln in einem Hochdurchsatzverfahren , Pre-Hybridisierung Behandlungen anwenden, das den WMISH Signal zu optimieren, Embryonen und Larven mit zufriedenstellender WMISHsignals für die Bildgebung vorzubereiten.

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist eine Technik , die für die räumliche Auflösung von Nukleinsäuremolekülen (oft mRNAs) innerhalb eines &quot;whole mount&quot; Gewebepräparation oder Entwicklungsstadium (wie ein Embryo oder Larve) von Interesse ermöglicht. WMISH ist extrem leistungsfähig, da sie wesentlich zur funktionellen Charakterisierung komplexer Metazoen Genome beitragen kann, eine Herausforderung, die mehr von einem Engpass bei der Flut der nächsten Generation Sequenzdaten immer. Trotz der konzeptionellen Einfachheit der Technik viel Zeit wird häufig benötigt, um die verschiedenen Parameter inhärent WMISH Experimente für neuartige Modellsysteme zu optimieren; subtile Unterschiede in den zellulären und biochemischen Eigenschaften zwischen Gewebetypen und Entwicklungsstadien bedeuten, dass eine einzige WMISH Methode nicht für alle Situationen geeignet sein können. Wir haben eine Reihe von WMISH Methoden für die wieder auftauchende gastropod Modell entwickelt , das Spitzschlammschnecke erzeugen konsistent undklar WMISH Signale für eine Reihe von Genen, und in allen Entwicklungsstadien. Diese Verfahren umfassen die Zuordnung von Larven unbekannter chronologischen Alter zu einem ontogenetischer Fenster die effiziente Entfernung von Embryonen und Larven von ihren Eier Kapseln, die Anwendung eines geeigneten Proteinase-K - Behandlung für jeden ontogenetischer Fenster und Hybridisierung, post-Hybridisierung und Immunnachweis Schritte. Diese Methoden stellen eine Grundlage, das resultierende Signal für eine bestimmte RNA-Transkript verfeinert werden kann weiter mit Sonde spezifische Anpassungen (in erster Linie Sondenkonzentration und Hybridisierungstemperatur).

Die repräsentativen WMISH Färbungsmuster in 3 gezeigt wurden die oben beschriebenen Technik erzeugt wurde, und eine Vielzahl von räumlichen Expressionsmuster für Gene , die in einem Bereich von molekularen Prozessen beteiligt reflektieren Bereich von Schalenbildung (Novel Gen 1, 2, 3 und 4), an Zell-Zell - Signalisierung (DPP) zur Transkriptionsregulation (Brachyurie) in einer Reihe von Entwicklungsstadien. Während wir die Express...

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.8K Aufrufe.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Serie: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Eine nichtinvasive Methode zur<em&gt; In situ</em&gt; Bestimmung des Gegen Erfolg im Frauen amerikanischen Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Forschung

Umwelt

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetik

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Immunologie und Infektion

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Entwicklungsbiologie

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologie

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

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Eine nichtinvasive Methode zur