この場でのハイブリダイゼーションは、組織における特定の遺伝子のmRNAおよびIncRNA発現パターンを提示するための非常に有益な技術である。本稿の目的は、重要な漁業資源であるSipunculus nudusのコエロミック流体中の特異的mRNA局在を検出するための敏感な方法を開発することです。この方法を用いて、実験成功から得られた代表的な結果を発表しました。
我々の方法は、コエロミック流体中の特定のmRNAおよびIncRNAの発現パターンを同定するための他のSipuncula種に適用されることを期待される。解剖テーブルの上にシプンクルスヌドゥスを修正します。小さなオートクレーブハサミでシプンクルスヌードゥスの体を開きます。
次に、ピペットを用いてコエロミック流体をポリD-リジン処理顕微鏡スライドに集め、軽く広げます。スライドを37°Cで1時間空気乾燥します。DEPC-PBSでスライドを3回、1回5分間穏やかな攪拌で洗います。
PBSを水切りし、室温で5分間スライド上にプロテイナーゼK溶液を加える。プロテイナーゼK溶液を排出します。室温で20分間、スライドにPFA溶液を追加します。
PFA溶液を排出します。DEPC-PBSでスライドを3回、1回5分間穏やかな攪拌で洗います。PBSを排出します。
50マイクロリットルリボプローブを追加します。カバースリップを追加します。スライドを濡れた箱に入れ、パラフィンフィルムでよく密封します。
摂氏60度で一晩ハイブリダイズ。スライドを洗浄バッファーに浸し、カバースリップが自動的に滑り落ちるまで立たせます。予熱洗浄バッファーでスライドを 65°C で 2 回、1 回 30 分間穏やかな攪拌で洗浄します。
予熱したSSC溶液でスライドを摂氏65度で2回、1回30分静かしい攪拌で洗います。MABT溶液でスライドを室温で2回洗います。穏やかな攪拌で洗浄ごとに30分。
MABTを排出します。ブロッキング バッファを追加します。スライドを室温で3~4時間インキュベートします。
ブロッキング バッファをドレインします。抗体を加え、一晩摂氏4度でスライドをインキュベートする。抗体溶液を排出します。
MABT溶液でスライドを4回、1回25分間穏やかな攪拌で洗浄します。MABTを排出します。アルカリホスファターゼバッファーをインキュベーションごとに 3 回 5 分間追加します。
アルカリホスファターゼバッファーを取り外します。BCIP-NBT染色ソリューションを追加します。スライドを暗闇の中に保管してください。
染色時間は、信号強度に依存する夜間でも、数分から数時間まで変化します。染色の開始時に、染色状態をより頻繁にチェックする必要があります。例えば、数分の間隔で、染色の遅い時に数時間。
光への露出による高いバックグラウンドシグナリングの導入を避けるために、チェック時間は短くする必要があります。その場合の代表的なシグナルをその中でハイブリダイゼーションして示す。dmrt1を標的とする抗感覚リボプローブを有するシプンキュラスヌドゥスコエロミック流体のその場でのハイブリダイゼーションでは、精子のトロップブラスト細胞に濃縮された紫色の染色を示し、dmrt1用の図2AおよびB.Senseリボプローブは、ハイブリダイゼーションシグナルを検出しなかった、図2C。
このビデオを見た後、あなたはSipunculus nudusのコエロミック流体中の標的mRNAまたはIncRNAの発現パターンを視覚化する方法を非常によく理解しているでしょう。
