This work was supported by a Howard Hughes Medical Institute Education Grant and an internal grant from the Saint Joseph's University chapter of Sigma Xi. We would also like to thank the three anonymous reviewers who helped strengthen the protocol and interpretations.

ゼブラフィッシュのハウジング、ケア、および研究のための以下の方法論は、セントジョセフ大学IACUCによって承認されています。 1.ゼブラフィッシュの住宅とケア<ol><li>地元のサプライヤーからの、または野生キャッチ集団から被写体のゼブラフィッシュを入手します。ゼブラフィッシュは、ハウジング野生キャッチ集団のために必要とされるIACUCガイドラインおよび追加の許可の対象となる住宅を注意してください。 </li><li>性別に応じて特定し、独立したゼブラフィッシュ。また、このステップをスキップしたり、研究仮説に基づく分離の異なる方法で交換してください。 注：セックス特性は、特に女性では、ゼブラフィッシュで決定することは困難です。性別を区別するために、これらのガイドライン10または有用なオンラインマニュアルを参照してください。 </li><li>ランダムに魚を刺激するために、焦点魚の適切な比率へのさらなる集団を分離します。注：焦点魚を被験者はbehavio一連の続いていますRALアッセイ、および刺激魚は侵略と浅水アッセイにおける刺激室を占有する個人です。 注：伝統的に、浅水アッセイにおける焦点魚あたりの刺激の魚と1 1〜5：1の刺激：侵略アッセイ14,17における焦点魚の割合が使用されています。しかし、研究者は、具体的には（ すなわち、適切なランダム化を確実にするために、各アッセイの間で回転させることが焦点魚の行動の一貫性を維持するために一定に保つこと、または魚を刺激すべきである魚を刺激する必要があります）心の中で仮説と研究を設計する必要があります。 </li><li>厳密12時12明/暗サイクルの下でゼブラフィッシュの住宅ラック内のすべての魚（27.5から28.5°C）で保管してください。非研究日に、すべての毎日の焦点と刺激魚のフレーク食品やブラインシュリンプを毎週フィード。 </li><li>すべてのテストは、概日リズムの影響26を回避するために、ZT1とZT5（zeitgeber時間）の間に行われていることを確認してください。 </li></ol> 2.無作為化とタンクのセットアップ<ol><li> Raは行動アッセイの特定の配列にすべての個人に先験的に ndomize。オンラインランダム・シーケンス発生器27または統計ソフトウェアパッケージ（R）からのランダムシーケンス発生器を使用して、一貫性のあるランダム化方式を設定します。 <ol><li> 1から3までの各アッセイにラベルを付け、一貫性のあるこの割り当てを維持します。各個人にランダム系列を割り当て、行動アッセイラベルに従ってシーケンスをマッピングします。例えば、（攻撃にマップされた大胆にマッピング浅水、2にマッピングされた1、及び3）は、3つの合計アッセイのために、与えられた個人が特定を行うためにそれらを必要とするであろう、「2,3,1」のランダム化配列を有してもよいです指定された順序で行動アッセイ。 </li></ol></li><li>不利な外部刺激の可能性を最小限に抑え、タンク全体をキャプチャするビデオカメラのための十分な部屋を持っているようにしてください場所に実験室でのアッセイタンク（太さ、攻撃性、および浅水）を設定します。ビデオカメラがenougていることを確認しますこの位置にビデオカメラをタンクのラベルを表示するだけでなく、焦点魚の微妙な行動を区別することができ、セットアップする時間明快。 </li><li>記録したカメラを持つすべての行動アッセイは、差動録音の結果として行動得点で意図しない差異を最小化するために指定されたタンクの完全なビューと同じ位置に維持しました。 注：動きと音がゼブラフィッシュの行動に影響を与えるように重い人身売買の分野で、ドアによってタンクを配置しないでください。 </li><li>各行動アッセイをスコアリングするためのユニークなJWatcherプロトコル24を確立します。収集したデータを要約するキーストロークと焦点解析ファイルに動作を割り当てるために焦点マスターファイルを作成する方法については、JWatcherのマニュアルを参照してください。 注：JWatcherは、カスタマイズされた信頼性と再現性行動得点24を可能にする行動スコアリングソフトウェアです。 </li><li> 例えば （すべての行動アッセイの日付、魚の数、およびアッセイの数を追跡するためにラベル付けスキームを定義し、12月31日ST、2015年の「F5-B-123115」を暗示魚5、大胆アッセイ、）とビューとカメラの焦点にテープでタンクの外側にラベルを付けます。保ち、クイックリファレンスと今後の品質管理のための実験ノートにこの情報を記録します。 </li><li>個人が住宅のラックから削除された後、直接、すべてのアッセイ間で使用されるだけでなく、される順化タンクを設定します。 注：順化タンクと端末戦車が小さな水槽砂利と（40センチメートルのx 20センチメートル×25センチ）と密接に収納ラックに似ているフィルターです。 </li><li>アッセイが全て完了した後、すべての使用焦点個人のための最終的な目的地タンクとして機能する別の端末タンクに個人を移します。自分たちの生活の残りの個体（ 例えば、25ガロン）のグループを収容するのに十分な大きさのタンクを使用してください。 注：一貫して同様の水の温度と条件のアクロスを維持することは非常に重要ですsのすべてのタンク。これは、ハウジングと、順化、およびすべてのテストのタンクを備えています。 </li></ol> 3.アグレッションアッセイを実施<ol><li> 30センチメートル×15センチ×10センチを測定する19 Lの長方形のタンクに侵略のアッセイを行います。望ましくない外部の刺激を低減するために、閲覧のために露出前部を残して、侵略タンクの三方を囲む外部不透明なパーティション内のタンクを服。 4つの等しい長方形の象限に外部マーキングタンクを分割し、タンクの左端に対して直角三角形を形成する22.5°傾斜左下の象限内に、（シリコーンコーキングで）永久的にミラーを固定します。 </li><li>順化タンクと侵略タンク内の水の温度は、ハウジングラックの2℃以内であることを確認してください。これを行うには、新鮮な、高齢者の水は侵略タンクに追加する準備ができて27.5から28.5℃に予熱したしました。不当な排除するために、各アッセイの間に水を変更することが重要であることに注意してください嗅覚。 </li><li>それが10分間順応されます別々の馴化タンクに収納ラックから、カッピングにより、焦点魚を移します。 注：これは、不適切な取り扱いを通して魚に導入された刺激を低減することが重要です。転送個体は、先27が記載されています。 <ol><li>具体的には、手動で、慎重に関心のタンクに小さい、透明なプラスチックカップを置きます。ネットを使用して転送する限り魚を中断することなく、ゆっくりとカップに魚をすくい上げます。 </li></ol></li><li>ビデオカメラは、攻撃性アッセイタンクは（ステップ3.1参照）焦点が合っていることを確認することにより、すぐにデバイス上の侵略タンク、プレスレコードに個人を転送する前に録音する準備ができていることを確認してください。順化タンクからの侵略タンクにカッピングを介して焦点魚を移します。 注：これは、前のエントリの正確な時刻を追跡するために侵略タンクに入る魚に記録することが重要です。 </li><li> AGGRを記録しますその後、10分30秒とカップバック順化タンクへの攻撃タンクからの焦点魚用essionタンク。 </li><li>記録を見ているときに、魚が行動を採点する前に、追加の順応期間としてタンクに導入された後、30秒待ってください。 </li><li>積極的な行動のために定義されJWatcherスコアリングシステムを使用して、10分間、次の行動を定量化：ミラーの近くに費やした時間を、ミラーアプローチ、ダーツの数、試行さ咬傷（ミラーの方向に口を開ける）の数の数、および横方向の表示数（背、胸、肛門、および尾鰭勃起）9。 </li><li>アッセイは反復間の高い契約に得点されるまで、少なくとも2倍、単一の攻撃性アッセイをスコア。 </li></ol> 4.大胆アッセイを行います<ol><li> 15センチメートル（高さ）×26.5センチメートルトップのx 22.5センチメートル底×6センチ幅を測定する、小型の1.5 Lの台形タンクに大胆アッセイを実施します。すべての側面の周りに不透明な紙を包むOタンクFが、視聴のために露出したフロントを残します。タンクの底部から上部を区別するためにタンクに外部テープの単一の薄片を置きます。 </li><li>大胆タンク内の水の温度は、ハウジングラックの2℃以内であること（ステップ3.2参照）を確保します</li><li>順化タンクに収納ラックから焦点魚を移す（ステップ3.3を参照）、10分間順応させて。 </li><li>ビデオカメラは、デバイスに焦点魚、プレスレコードを転送する準備ができたら、大胆アッセイを記録し、準備ができていることを確認してください。 8分30秒のための大胆タンクやレコードに順化タンクから焦点魚を移します。 </li><li>記録を見ているときに魚が得点する前にタンクに導入された後、さらに30秒の順応期間を可能にします。 </li><li> JWatcherソフトウェアを使用して、8分間の大胆行動を定量化します。具体的には、以下の行動を定量化：表面近くの時間を、待ち時間はトラの上部​​、番号を入力します上部にnsitions、および不安定な動き（ダーツ）の数29。 </li><li>アッセイは反復間の高い契約に得点されるまで、少なくとも2倍、単一の大胆アッセイをスコア。 </li></ol> 5.浅水アッセイを実施<ol><li>シリコーンコーキング（結果として得られる3つの区画は、2つの刺激ゾーンと1焦点の区画で構成さ）で密閉二枚のガラスの分周器で割った3つの区画を持つ76 Lタンク内の浅水アッセイを行います。外部的には、マーク2優先ゾーンが2体30を長さの指標で、刺激ゾーン「ガラス分周器のそれぞれから6.35センチメートルを指定します。外部浅水タンクの三辺の周りに不透明なパーティションを適用しますが、閲覧のために露出フロントを残します。 注：この環境ゾーンは、異なるサイズの種のための特定の仮説をテストするためにカスタマイズすることができます。 </li><li>試験の性質に応じて、選択刺激群れは、少なくとも12時間befor順応さ電子テストと実験の過程を通して浅水タンク内に残っています。 注：刺激群れは、焦点魚はこれらの群れの存在下または非存在下でどのように振る舞うかを評価するために使用される個々の魚のコレクションです。異なる刺激浅瀬の組み合わせが多様浅水仮説の数を試験するために選択することができます。刺激群れは側バイアスを回避するために、各刺激のゾーンとの間で回転され、また、試験前に少なくとも12時間順応させることを確認してください。 </li><li>前述したように順化タンクに焦点魚を移す（ステップ3.3を参照してください） </li><li>浅水タンク内の中央コンパートメントに中間順化タンクから、焦点魚をすくうことによって、転送します。 </li><li> 10分のライブスコアの観察期間の10分前の順応期間を可能にします。また、後でJWatcherを使用して、浅水アッセイとスコアを記録。それらは、チャンバ内の優先ゾーン内にあるとき魚は浅水であると判定されますターゲット浅瀬を収容します。 </li><li>中央のボリュームに費やされた各優先ゾーンと時間に費やされた時間を定量化します。 </li><li>追加の説明対策として、「浅水の強さ」（SOS）を計算します。大きさはどのくらいの頻度で、個々の魚の群れを説明どこ-1と1の間の値を割り当てます。 </li><li>浅水域の面積で割った時間を過ごした浅水の比率を計算し、時間の比率を引く浅水と非浅水ゾーンの領域ではない過ごしました。個別に各ゾーンの体積で割った各ゾーンで費やした時間の合計にわたってこの量を置きます。この計算の詳細については、以前の研究14で見つけることができます。 </li></ol> 6.データ品質管理<ol><li>従来のデータ分析ツール31-32を使用してデータを分析します。 </li><li>すべての行動のためのノンパラメトリックレーベン検定を用いて分散の均一性のためのテスト。動作は不均質である場合は、ログ変換を実行33。 </li><li>均質なデータ34にクラスカル・ウォリスANOVAを使用しないシーケンスの影響（ すなわち、ランダム化の順序は個人の行動に影響を与えなかったこと）がないことを確認してください。 </li><li>固定係数35としてサイドでのSOS指標に単変量一般線形モデルを作成することで、浅水アッセイのための側バイアスがないことを確認してください。 注：データと無問題へのほとんどがある場合は、下流の分析を行うことができます。問題がある場合は、生物学的にもっともらしい説明で合理化、追加の変換で和解、および/またはサンプルサイズを増加させます。 </li></ol> 7.データの分析<ol><li>両側スピアマンの順位相関を大胆さと攻撃性アッセイ内の別々のすべての行動のために36を計算します。 </li><li>複数のティムを実施した行動アッセイのための一貫性と双方向混合モデルとして内相相関係数（ICC）を計算します与えられた個々の36の電子。この設定では、ICCは、所与のアッセイで挙動魚が複数回測定方法一貫の測定値です。 </li><li>主成分分析（PCA）25への入力のために準備するために、すべての行動を中心とnormingによってプリプロセスの大胆さと攻撃性行動。 注：センタリングとnormingによって測定の前処理は不可欠なステップです。この前処理することなく、複数の周波数とよりで発生ステップの動作は、可変過度に抽出された成分の解釈に影響を与えるであろう。センタリングとnormingのプロセスは、このバイアスを除去します。 </li><li>大胆さと攻撃性を行動症候群として一緒にリンクされているかどうかを判断するために相関行列とPCAを実行します。 0.6&gt;での重要な各コンポーネントの行動の負荷を解釈します。行動研究のためにPCAを報告するための総合的なガイドのためBudaev 2010 24を参照してください。スクリープロットは、どのeigenve有益になりますctorsは、解釈のために維持されるべきです。 </li><li>このようなRやSPSS 31,32として統計ソフトウェアパッケージを使用して、各個体の各コンポーネントのスコアを抽出します。スコアは、指定された個人の行動は、特定のコンポーネントによって説明することができるどのくらい表します。 </li><li>要因回帰スコアと浅水36の強度とのスピアマンの順位相関を計算します。 注：重要な解釈負荷を持つすべてのコンポーネントは、浅水の強さと相関する場合大胆さと侵略行動が、同じコンポーネントにロードした場合、または行動症候群は存在であると考えられます。また、浅水の強度は、より複雑な行動の定量化（大胆さと攻撃性）のより良い解釈を可能にするためにPCAに含まれていないことに注意してください。 PCAは直角に説明し、これらの複雑な測定に適しています変化量を最大化するために、固有ベクトルに大胆さと攻撃性の機能を崩壊します。通訳固有ベクトルをもたらし、複雑な振る舞い（大胆さと攻撃性）のそれぞれが、より明確に定義されたバイナリ浅水測定にどのように関係するかのはるかに直感的な解釈を与え、それらのそれぞれに浅水測定の強みを退行（ すなわち、魚が浅水されますか）浅水ありません。 </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boldness+and+behavioral+syndromes+in+the+bluegill+sunfish,+Lepomis+macrochirus.">Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus.</a> Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).</li><li>Brodin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+syndrome+over+the+boundaries+of+life--carryovers+from+larvae+to+adult+damselfly.">Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly.</a> Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).</li><li>Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EthoVision:+a+versatile+video+tracking+system+for+automation+of+behavioral+experiments.">EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments.</a> Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).</li><li>Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personality+traits+and+dispersal+tendency+in+the+invasive+mosquitofish+(Gambusia+affinis).">Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis).</a> Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).</li><li>Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+leptokurtic+movement+distributions:+intrapopulation+variation+in+boldness+and+exploration.">Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration.</a> Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).</li><li>Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+syndromes+differ+predictably+between+12+populations+of+three-spined+stickleback.">Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback.</a> J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).</li></ol>

The authors (GW and SPM) have no competing financial interests or conflicts of interest.

ゼブラフィッシュにおける一貫した大胆さ、攻撃性で団体、および浅水行動があるかどうプロトコルが決定されます。一貫性のある団体は、これらの動作のいずれかの間の所定の集団である場合は、その後の行動症候群が存在しています。人口の自然な行動症候群を研究することによって、研究者はその行動のダイナミックな、人口構造、およびおそらく進化の歴史3のより完全な理?...

一定の集団から個々の動物内の個別の行動との関連を調査文学の成長体があります。これらの団体は、行動症候群と呼ばれており、測定値は、通常、大胆さ、攻撃性、探索行動、および社交性1-5が含まれます。行動症候群は、直接的および間接的の両方の理由で価値があります。直接、行動症候群の知識は進化論、人口構造、および人口動態3のより完全なビューを提供することができます。間接的に、行動の関連性についての知識は、このような薬理6、毒物学7、行動遺伝学8,9、および内分泌学10として行動を定量化するフィールドを通知することができます。そのため、これらの直接的および間接的なメリットの、行動症候群の増加知識は、ゼブラフィッシュのような一般的に使用されるモデル生物では特に貴重です。ゼブラフィッシュを用いた研究が発見された私行動症候群11-13の分析などの分野の様々な、ナ。行動症候群の研究で知識を進めるために、および他の分野でも仮説検証のための行動の測定値を使用しているため、動作の信頼性と簡潔な説明が有効な分析や解釈や標準化されたプロトコルのために必要とされると、種内間の研究の比較を容易にします。私たちのプロトコルは、ラボ飼育ゼブラフィッシュ14の集団での大胆さ、攻撃性、浅水行動症候群を測定するために開発されました。ただし、（、個々の魚を追跡し、適切なランダム化を確保し、適切な分析）プロトコルの基本は、簡単に代替行動測定の様々な変更することができます。さらに、大胆さ、攻撃性、または浅水アッセイは、明確な仮説をテストするため、個別に実行することができます。したがって、それは私たちの目標ですしながら行動症候群の研究と成功個々リットル用のプロトコルを実施する方法について説明しますEVEL行動測定は、この手順の各ファセットは、一人で立つことができます。 行動症候群に関する文献は行動症候群を測定するために、人間4に節足動物から、いくつかの分類群にまたがると、少なくとも二つの行動の文脈を定量化する必要があります。残念ながら、行動の軸を横切って行動測定を定量化するために使用されるアッセイはほとんど一貫性がしばしばあります。例えば、魚、大胆はT迷路アッセイ、オープンフィールドアッセイ、または新規のまたは外来の刺激15の導入を用いて測定することができます。魚類の攻撃性の研究はダイアドの相互作用、ビデオ刺激アッセイ、またはクレイモデルアッセイ12,16,17を伴う可能性があります。同様に、典型的にshoalmate好みの測定を含む浅水挙動の分析は、会合時間21〜23を決定するために、さまざまな方法で、タンクの異なるタイプで実行されてもよいです。このプロトコルではOveraのの特定のサブセットLL行動アッセイレパートリーが提示されています。具体的には、このプロトコルは、比較が集団内の全個体間で整合性がとれているかどうかを判断するために、個人内比較を容易にするように大胆さ、攻撃性、および浅水アッセイを通じて個人を追跡するための方法論を提示します。我々は以前の研究14,18にゼブラフィッシュとコンビクトシクリッド（Amatitlaniaのnigrofasciata）で、このプロトコルを実行した、それは任意の同様のサイズの淡水魚で動作します。 大胆アッセイは、タンクの上部と下部に同じ大きさの領域の輪郭を描く水平線を有する1.5 L台形槽で行われます。定量化された行動は、タンクの上部と下部に、それぞれの部分で費やされた時間の間、試験魚によって遷移の数、ダーツの数、および上部を入力するための待ち時間が含まれます。攻撃性アッセイは含まれ19L、矩形タンク内で行われます3インチ×5インチのミラーは、タンク19の左下隅に位置する約22度傾斜します。定量化された行動は、特定の攻撃的な指標とともに、ミラー20と相互作用するターゲット魚が費やした時間の合計を含む-刺さ数、横表示され、試験魚とその反射の間にダーツを。これらの特定の指標については、刺さは開いた口と鏡に向かって素早く突進のように定義され、横方向の表示は、ミラーの方向の横、胸、肛門と背側フィンのフレアとして定義され、ダーツがある任意の不安定な動きをされています鏡に向かうありません。最後に、浅水アッセイは三室のタンクの中央室での試験魚の挙動を定量化します。タンクの側室は、空であるか、または魚の「目標浅瀬&quot;を含む、および試験魚は、各側室の近くに費やす時間は、21から23を測定しました。 STRENと呼ばれる単一の複合スコア、浅水のGTH（SOS）は、刺激に対する特定の、各個別の試験魚に対して計算され、下流側14を分析に使用することができます。すべての行動がJWatcher 24として知られている自由行動定量化ソフトウェアを使用して、単一の視聴者、または複数の視聴者によって採点されます。 行動症候群の存在をテストすることは、主に統計的な努力であり、Budeav 2010年25によって提示されるようなガイドラインに従うことが賢明である。具体的には、中を中心とノルムデータに主成分分析（PCA）を実行することをお勧めします入力は、複数の行動の測定値（ すなわち、大胆さと攻撃性）を持つアッセイにおける個人の行動のベクトルです。相関行列に対して実行PCAは、行動測定の次元を減少させ、したがって、変化の大部分を説明し、最も重要な知識を抽出します。抽出された成分は、その後、BASを解釈することができます関心と回帰スコアの個人の行動のための高い因子負荷上のedは説明コンポーネントに基づいて各個人のために抽出することができます。これらの回帰スコアはその後、SOSの測定と、そのような魚のサイズや性別などの他の種々の非行動の測定値と比較することができます。 このワークフローでは、大胆さと浅水14との間に存在する性別の特定の行動症候群が発見されたゼブラフィッシュの行動症候群の研究で実装されています。この状況では、大胆なゼブラフィッシュ雄は大きく、より積極的な種（D. albolineatus）に関連付けるする可能性が高いですが、この協会は、女性で失われています。このワークフローはまた、行動症候群は、潜在的に種の行動の可塑性を示し、発見されなかった少年囚人シクリッド親族（Amatitlaniaのnigrofasciata）18の研究で実装されました。したがって、以下のプロトコルがwが提示されています個人レベルの行動症候群を研究の枠組みの中で3つの特定のアッセイ（太さ、攻撃性、および浅水）の性質を描写するという目標i番目。

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Rack System</td><td>Aquaneering Inc</td><td>Cat. # ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g</td><td>Pet Valu</td><td>Cat. # 31700</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Trapezoidal Tank</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>Cat. # itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi KP-D20A CCD Camera</td><td>Prescott&#039;s, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3&quot; x 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>Cat. # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

boldness, aggression, and shoaling assays for zebrafish behavioral syndromes

特定の挙動が異なる状況の下で相互に作用するときの行動症候群が存在します。ゼブラフィッシュは、最近の研究では被験者となっている、適切な分析や解釈を確保するためのプロトコルを標準化することが重要です。私たちの以前の研究では、我々は、1.5 Lの台形タンク内の挙動（表面近くの時間、トランジションでの待ち時間、遷移の数、およびダーツ）のシリーズを監視することによって大胆さを測定しました。同様に、我々は、長方形19 Lタンクに傾斜ミラーの近くに刺され、横方向のディスプレイ、ダーツ、および時間を観察することによって侵略を定量化しました。三分のに76 Lタンクを分割することにより、我々はまた、浅水好みを調べました。浅水アッセイは、高度にカスタマイズアッセイであり、特定の仮説のために調整することができます。しかし、このアッセイのためのプロトコルが標準化され、まだカスタマイズのために十分に柔軟でなければなりません。以前の研究では、末端室は空のいずれかであった、5又は10ゼブラフィッシュ、または5パールdanios（D. albolineatus）を含有しました 。 FOLで牛の鳴き声の原稿は、私たちは詳細なプロトコルおよび行動症候群実験の複製を可能にするプロトコルの成功のアプリケーションを伴う代表的なデータを提示します。

試験の性質に応じて、特定のプロトコルの使用は、いくつかの異なる結果は、行動症候群実験が可能です。以下の表と示された数字は、雑誌に掲載された私たちの以前の研究から適応される行動は、14とジャーナルゼブラフィッシュ17を処理します。提案は、（上述のように）、その全体で行う場合、および「アッセイ相関以内&#39;結果、二組?...

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Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

ゼブラフィッシュ行動症候群のための大胆、攻撃的、および浅水アッセイ

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

boldness-aggression-shoaling-assays-for-zebrafish-behavioral

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K ビュー.  Saint Joseph’s University. This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

生物学

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

ゼブラフィッシュの先天性ストレスを研究する行動的アプローチ

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

行動学

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

神経科学

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

成体ゼブラフィッシュの神経毒性影響を評価するための行動試験バッテリー

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

著者スポットライト:成体ゼブラフィッシュにおける環境および薬物誘発性行動変化の評価 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

ゼブラフィッシュ行動症候群のための大胆、攻撃的、および浅水アッセイ

要約

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光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

ゼブラフィッシュの先天性ストレスを研究する行動的アプローチ

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

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ゼブラフィッシュ行動症候群のための大胆、攻撃的、および浅水アッセイ

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複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価