This work was supported by a Howard Hughes Medical Institute Education Grant and an internal grant from the Saint Joseph's University chapter of Sigma Xi. We would also like to thank the three anonymous reviewers who helped strengthen the protocol and interpretations.

Die folgenden Methoden für das Gehäuse, Pflege und Studium der Zebrabärbling wurden von der St.-Josephs-Universität IACUC genehmigt. 1. Zebrabärbling Unterbringung und Pflege <ol><li> Beziehen Sie das Thema Zebrabärbling von einem lokalen Anbieter oder von wild gefangenen Populationen. Bitte beachten Sie, dass Gehäuse der Zebrabärbling zu IACUC Richtlinien unterliegt und zusätzliche Genehmigungen für den Wohnungsbau Populationen wild gefangenen erforderlich sind. </li><li> Identifizieren und separater Zebrabärbling nach Geschlecht. Alternativ, diesen Schritt überspringen oder ersetzen Sie sie durch eine andere Methode der Trennung auf der Studie Hypothese basiert. HINWEIS: Sex Eigenschaften nur schwer in Zebrabärbling, um zu bestimmen, vor allem bei Frauen. Wenden Sie sich an diese Richtlinien 10 oder nützliche Online - Handbücher Sex zu unterscheiden. </li><li> trennen Randomly die Bevölkerung weiter in das entsprechende Verhältnis von Brenn Fisch Fisch auf Reize. Hinweis: Focal Fische sind die Probanden durch die Reihe von behavio gefolgtral-Assays und Stimulus Fisch sind die Personen, die die Reizkammern in den Aggressionen und shoaling Tests belegen wird. HINWEIS: zwischen 1 und 5 Stimulus Fisch pro Brenn Fisch in shoaling Assays und einem 1 Traditionell: 1 Reiz: sind fokale Fisch Verhältnis in Aggression Assays 14,17 verwendet. Allerdings muss sich die Forscher speziell mit der Hypothese der Studie Design im Auge (dh sollte Reiz Fisch konstant gehalten werden Konsistenz bei fokalen Fischverhalten zu halten, oder sollte Reiz Fisch zwischen jedem Test gedreht werden , um korrekte Randomisierung zu gewährleisten). </li><li> Bewahren Sie alle Fische in Zebrabärbling Gehäuse Racks (27,5-28,5 ° C) unter einer strengen 12.12 Hell / Dunkel-Zyklus. Führen Sie alle fokale und Stimulus Fisch Flockenfutter täglich und Artemia wöchentlich, auf Nicht-Forschung Tage. </li><li> Achten Sie darauf , dass alle Tests zwischen ZT1 und ZT5 (Zeitgeber - Zeit) zu vermeiden , zirkadianen Rhythmus - Effekte 26 durchgeführt wird. </li></ol> 2. Die Randomisierung und Tank-Setup <ol><li> Randomize alle Individuen , a priori zu einer spezifischen Sequenz von Verhaltenstests. Stellen Sie eine konsistente Randomisierung Schema eines Online - Zufallsgenerator 27 oder einen Zufallsgenerator aus einer statistischen Softwarepaket (R) zu verbrauchen. <ol><li> Beschriften Sie jedes Assay von 1 bis 3 und halten diese Zuordnung konsistent. Zuweisen einer Zufallssequenz für jeden einzelnen Karte und die Sequenz entsprechend dem Verhaltenstest Label. Beispielsweise für drei Gesamtassays (1 bis Shoaling kartiert, 2 bis Mut kartiert, und 3 bis Aggression abgebildet), eine bestimmte Person haben eine randomisierte Sequenz von &quot;2,3,1&quot; kann, die sie erfordern die spezifische auszuführen Verhaltenstests in der angegebenen Reihenfolge. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Testtanks (Kühnheit, Aggression und shoaling) im Labor an Orten, die die Möglichkeit für widrige äußere Reize zu minimieren und sicher sein, genug Platz für einen Video-Camcorder haben den gesamten Tank zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass der Camcorder hat enough Klarheit zu sehen Tank Etiketten sowie der Lage sein, den Camcorder in dieser Position subtile Verhaltensweisen des Fokus Fisch und Setup zu unterscheiden. </li><li> Notieren Sie alle Verhaltenstests mit der Kamera in der gleichen Position mit einem vollen Blick auf den angegebenen Tank gehalten unbeabsichtigte Unterschiede in Verhaltensanalyse als Ergebnis unterschiedlicher Aufnahmen zu minimieren. HINWEIS: Vermeiden Sie Tanks in schweren Verkehrsflächen und durch Türen als Bewegung setzen und klingen Zebrabärbling Verhalten beeinflussen. </li><li> Stellen Sie einzigartige jWatcher Protokolle 24 für jedes Verhaltenstest Scoring. Beachten Sie die jWatcher Handbuch zu lernen, wie fokale Master-Dateien zu erstellen gesammelt zuweisen Verhaltensweisen zu Tastatureingaben und Fokus-Analyse-Dateien zusammenfassen Daten. HINWEIS: jWatcher ist eine Verhaltensanalyse - Software , die 24 für eine zuverlässige und wiederholbare maßgeschneiderte Verhaltens - Scoring ermöglicht. </li><li> Definieren Sie ein Kennzeichnungssystem , das Datum zu verfolgen, Fisch Nummer und Assay - Nummer für alle Verhaltenstests (zB&quot;F5-B-123115&quot; was bedeutet , Fisch 5, mut - Test, am 31. Dezember st, 2015) und die Außenseite des Tanks mit Band im Blick und im Fokus der Kamera kennzeichnen. Halten Sie und notieren Sie diese Informationen in einem Labor-Notebook zum schnellen Nachschlagen und zukünftigen Qualitätskontrolle. </li><li> Richten Sie eine Akklimatisierung Tank, sowie direkt zwischen allen Tests verwendet werden, nachdem die Personen aus dem Gehäuse Rack entfernt werden. HINWEIS: Die Akklimatisierung Tanks und Klemmen tanks sind kleine Aquarien (40 cm x 20 cm x 25 cm) mit Kies und ein Filter, der eng an die Gehäusegestell ähneln. </li><li> Nachdem die Tests alle abgeschlossen sind, übertragen die einzelnen in einem separaten Terminal Tank, der als endgültige Zieltank für alle verwendeten Brenn Personen dienen. Verwenden Sie einen Tank, der groß genug ist , eine Gruppe von Personen für den Rest ihres Lebens zu beherbergen (zB 25 Gallone). HINWEIS: Es ist sehr wichtig, konsequent und ähnliche Wassertemperaturen und Bedingungen aufrechtzuerhalten across alle Tanks. Dazu gehören Gehäuse, Akklimatisation, und alle Testtanks. </li></ol> 3. Durchführung der Aggression Assay <ol><li> Führen Sie die Aggression Test in einem 19 L rechteckigen Behälter der Größe 30 cm x 15 cm x 10 cm. Ausstatten, den Tank in externen opaque Trennwänden umgeben drei Seiten des Angriffstank, so dass die Vorderseite für Betrachtungs ausgesetzt, um unerwünschte äußere Reize zu reduzieren. Teilen Sie den Tank mit externen Markierungen in vier gleich große rechteckige Quadranten und einen Spiegel fixieren permanent (mit Silikon abdichten) im unteren linken Quadranten, geneigt bei 22,5 ° ein rechtwinkliges Dreieck gegen den äußersten linken Seite des Tanks zu bilden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Wassers in der Akklimatisierung Tank und Aggression Tank innerhalb von 2 ° C des Gehäuses Rack eingesetzt wird. Dazu haben frisch, im Alter von Wasser vorgewärmt auf 27,5 bis 28,5 ° C bereit zum Angriff Tank hinzuzufügen. Bitte beachten Sie, dass es wichtig ist, das Wasser zwischen den einzelnen Test zu ändern unberechtigt zu beseitigenolfaktorischen Signale. </li><li> Übertragen, durch Schröpfen, einen Schwerpunkt Fisch aus dem Gehäuse Rack in einen separaten Akklimatisierung Tank, wo es für 10 Minuten akklimatisieren wird. HINWEIS: Es ist wichtig, Anreize für die Fische durch unsachgemäße Handhabung eingeführt zu reduzieren. Transfer Individuen wie zuvor beschrieben 27. <ol><li> Genauer gesagt, manuell und vorsichtig mit einem kleinen, transparenten Plastikbecher in den Tank in der Nähe platzieren. die Fische so viel wie die Übertragung durch ein Netz verwenden, schöpfen langsam den Fisch in die Tasse ohne zu stören. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass die Video-Camcorder bereit ist, indem bestätigt wird, dass die Aggression Testtank (siehe Schritt 3.1) ist im Fokus und unmittelbar vor der Übertragung des einzelnen in den Angriffstank, drücken Sie Aufzeichnung auf dem Gerät zu speichern. Übertragen Brenn Fisch über Schröpfen von Akklimatisierung Tank Aggression Tank. HINWEIS: Es ist wichtig, bevor der Fisch zur Aufzeichnung der Aggression Tank Eingabe der genaue Zeitpunkt des Eintritts zu verfolgen. </li><li> Notieren Sie sich die aggrITZUNG Tank für 10 Minuten und 30 Sekunden und dann Tasse im Mittelpunkt Fisch aus dem Angriffstank zurück in die Akklimatisierung Tank. </li><li> Wenn die Aufzeichnung beobachten, warten Sie 30 Sekunden nach der Fisch in den Tank als zusätzliche Akklimatisierungszeit vor Scoring Verhaltensweisen eingeführt. </li><li> Mit dem jWatcher Scoring-System für aggressives Verhalten definiert, quantifizieren die folgenden Verhaltensweisen für 10 Minuten: Zeit in der Nähe von Spiegel verbracht, die Anzahl der Spiegel Ansätze, die Anzahl der Pfeile, die Anzahl der versuchten Bissen (Mund in Richtung der Spiegelöffnung) und die Anzahl der Seitenanzeigen (Rücken-, Brust-, analen und Schwanzflosse Erektion) 9. </li><li> Ergebnis eine einzige Aggression Test mindestens zweimal, bis der Test mit hoher Vereinbarung zwischen Iterationen erzielt wird. </li></ol> 4. Die Durchführung der Mut Assay <ol><li> Führen Sie die Kühnheit Test in einem kleinen 1,5 l trapez Tank, Mess 15 cm hoch x 26,5 cm x 22,5 cm oben unten x 6 cm Breite. Wickeln Sie undurchsichtiges Papier um alle Seiten of den Tank, aber lassen Sie die Front für die Betrachtung ausgesetzt. Legen Sie eine einzelne, dünne Stück Band außerhalb des Tanks den oberen von dem unteren Abschnitt des Behälters zu demarkieren. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Wassers in der Kühnheit Tank innerhalb von 2 ° C des Gehäuses Rack ist (siehe Schritt 3.2) </li><li> Übertragen Sie die Brenn Fisch aus dem Gehäuse Rack zur Akklimatisierung Tank (siehe Schritt 3.3) und lassen Sie sich für 10 Minuten akklimatisieren. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Camcorder ist bereit, die Kühnheit Test zu erfassen und, einmal bereit, den Schwerpunkt Fisch, drücken Sie Aufzeichnung auf das Gerät zu übertragen. Übertragen Sie die Brenn Fisch aus dem Akklimatisierung Tank zum Kühnheit Tank und Rekord für 8 Minuten und 30 Sekunden. </li><li> Wenn die Aufzeichnung beobachtet, ermöglichen weitere 30 sec Akklimatisierungszeit nachdem der Fisch in den Tank, bevor scoring eingeführt wird. </li><li> Mit jWatcher Software, zu quantifizieren Dreistigkeit Verhaltensweisen für 8 min. Insbesondere quantifizieren die folgenden Verhaltensweisen: Zeit nahe der Oberfläche, Latenz oberen Bereich, die Anzahl der tra eingebennsitions in den oberen Bereich und die Anzahl der erratischen Bewegungen (Pfeile) 29. </li><li> Ergebnis einen einzigen Kühnheit Test mindestens zweimal, bis der Test mit hoher Vereinbarung zwischen Iterationen erzielt wird. </li></ol> 5. Die Durchführung der Shoaling Assay <ol><li> Führen Sie den shoaling Test in einem 76 l-Tank, der drei Kammern, die durch zwei Glasteiler versiegelt mit Silikon abdichten (die resultierenden drei Kammern bestehen aus zwei Reizzonen und ein Brennraum) geteilt hat. Äußerlich kennzeichnen zwei Präferenzzonen 6,35 cm aus jedem der Reizzonen &quot;Glasteiler bezeichnet, was auf zwei Körper 30 Längen. Wenden Sie undurchsichtigen Partitionen außen um drei Seiten des shoaling Tank, aber lassen Sie die Front für die Betrachtung ausgesetzt. HINWEIS: Diese Präferenzzone für spezifische Hypothesen für unterschiedlich große Arten zu testen gestalten können. </li><li> Je nach der Art der Untersuchung, massen select Stimulus für mindestens 12 h vor dem akklimatisierene Testen und bleiben im Verlauf des Experiments im shoaling Tank. HINWEIS: Stimulus shoals sind Ansammlungen einzelner Fische, die verwendet werden, zu beurteilen, wie die Brenn Fisch verhält, in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Untiefen. Verschiedene Stimulus Schwarm Kombinationen können eine Reihe von unterschiedlichen shoaling Hypothesen zu testen ausgewählt werden. Achten Sie darauf, dass die Reiz Untiefen zwischen jedem Stimulus Zone gedreht Seite um Verzerrungen zu vermeiden und auch für mindestens 12 Stunden vor dem Test akklimatisieren. </li><li> Übertragen Sie die Brenn Fisch in die Akklimatisierung Tank, wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 3.3) </li><li> Übertragen, durch Schröpfen, den Schwerpunkt Fisch aus dem Zwischen Akklimatisierung Tank zu der mittleren Kammer im shoaling Tank. </li><li> Lassen Sie für 10 Minuten Eingewöhnungszeit vor 10 Minuten Live-Scoring-Beobachtungszeitraum. Alternativ notieren Sie die shoaling Assays und später jWatcher mit punkten. Die Fische werden bestimmt shoaling zu sein, wenn sie innerhalb der Präferenzzone in der Kammer sindGehäuse, das Ziel Schwarm. </li><li> Quantifizieren Zeit in jeder Präferenzzone und Zeitaufwand in der Mitte Volumen ausgegeben. </li><li> Als zusätzliche beschreibende Messung, Berechnung &#39;Stärke von shoaling &quot;(SoS). Weisen Sie einen Wert zwischen -1 und +1, wenn der Betrag, wie oft eine einzelne Fischschwärmen beschreibt. </li><li> Berechnen Sie das Verhältnis von Zeit verbrachte shoaling durch den Bereich der shoaling Zonen und subtrahieren das Verhältnis von Zeit geteilt verbrachte nicht shoaling und den Bereich der nicht-shoaling Zonen. Legen Sie diese Menge über die Summe der Zeit in jeder Zone verbracht durch das Volumen jeder Zone aufgeteilt einzeln. Weitere Informationen zu dieser Berechnung kann 14 in einer früheren Studie gefunden werden. </li></ol> 6. Datenqualitätskontrolle <ol><li> Analysieren von Daten unter Verwendung von traditionellen Datenanalysetools 31-32. </li><li> Test auf Homogenität der Varianz nichtparametrischer Levene-Test für alle Verhaltensweisen verwenden. Wenn ein Verhalten nicht homogen ist eine Log-Transformation durchführen33. </li><li> Bestätigen Sie, dass es keine Sequenzeffekte (dh, dass die Randomisierung um nicht die individuellen Verhaltensweisen nicht beeinträchtigte) 34 einen Kruskal-Wallis ANOVA auf den homogenen Daten. </li><li> Bestätigen Sie, dass es keine Neben Vorurteile für die shoaling Assay sind durch univariate allgemeine lineare Modelle auf SoS - Indizes mit Seiten als festen Faktor 35 zu schaffen. HINWEIS: Wenn es zu keinen Problemen mit der Daten wenig sind, können Downstream-Analysen durchgeführt werden. Wenn es Probleme gibt, versöhnen mit zusätzlichen Transformationen, rationalisieren mit biologisch plausible Erklärungen und / oder Stichprobengrößen zu erhöhen. </li></ol> 7. Analysieren von Daten <ol><li> Berechnen two-tailed Spearman Rangkorrelation 36 für alle Verhaltensweisen separat innerhalb der Kühnheit und Aggression Assays. </li><li> Berechnen Intrakorrelationskoeffizienten (ICC) als Zwei-Wege-Mischmodell mit Konsistenz für Verhaltenstests, die mehr als ein tim durchgeführt wurden,e für eine gegebene Einzel 36. Bei dieser Einstellung ist das ICC ein Maß dafür, wie konsequent ein Fisch in einem gegebenen Assay artig gemessen mehr als einmal. </li><li> Preprocess Kühnheit und Aggression Verhaltensweisen durch Zentrieren und Normierungs alle Verhaltensweisen zur Eingabe in einen Hauptkomponentenanalyse (PCA) 25 vorzubereiten. HINWEIS: Vorverarbeitung der Messungen durch das Zentrieren und Normierungs ist ein wichtiger Schritt. Ohne diese Vorverarbeitung Verhaltensweisen, die mit mehr Frequenz auftreten und unterschiedlich stark die Interpretationen der extrahierten Komponenten beeinflussen. Der Prozess der Zentrierung und Normierungs wird dieses Vorurteil zu entfernen. </li><li> Durchführen einer PCA mit einer Korrelationsmatrix, um zu bestimmen, ob Mut und Aggression miteinander verbunden sind, als ein Verhaltenssyndrom. Interpretieren Verhaltens Belastungen der einzelnen Komponenten signifikant bei&gt; 0,6. Siehe Budaev 2010 24 für einen umfassenden Leitfaden für die PCA Berichterstattung für Verhaltensstudien. Ein Screeplot wird informativ sein, auf dem eigenvectors sollte für die Interpretation gehalten werden. </li><li> Mit Hilfe statistischer Software - Paket wie R oder SPSS 31,32, extrahieren Scores für jede Komponente für jeden Einzelnen. Die Noten repräsentieren, wie viel der gegebenen individuellen Verhalten von der speziellen Komponente erklärt werden kann. </li><li> Berechnen Spearman Rangkorrelationen zwischen Faktor Regression Scores und der Stärke von 36 shoaling. HINWEIS: Ein Verhaltenssyndrom ist vorhanden betrachtet, wenn Mut und Aggression Verhalten auf der gleichen Komponente geladen werden oder, falls ein Bauteil mit einer signifikanten interpretierbar Beladungen mit einer Stärke von shoaling korreliert. Beachten Sie auch, dass die Festigkeit von shoaling nicht im PCA enthalten für eine bessere Interpretation der komplexeren Verhaltens Quantifizierungen (Kühnheit und Aggression) zu ermöglichen. Die PCA wird orthogonal kollabieren Kühnheit und Aggression Funktionen in Eigenvektoren die Variations zu maximieren erklärt und ist gut geeignet für diese komplexen Messungen. Dolmetschendie resultierende Eigenvektoren und unsere Stärke shoaling Messungen regredieren auf jedem von ihnen eine viel intuitiver Interpretation, wie jede der komplexen Verhaltensweisen (Kühnheit und Aggression) beziehen sich auf eine gut definierte binäre shoaling Messung (dh der Fisch shoaling oder shoaling nicht). </li></ol>

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The authors (GW and SPM) have no competing financial interests or conflicts of interest.

Das Protokoll wird entscheiden, ob es im Einklang Vereinigungen in Kühnheit, Aggression und shoaling Verhaltensweisen in Zebrabärbling. Wenn es konsistente Verbände in einer bestimmten Population zwischen diesen Verhaltensweisen sind, dann ist ein Verhaltenssyndrom vorhanden. Bevölkerung eines natürlichen Verhaltenssyndrom Durch das Studium können die Forscher ein besseres Verständnis ihrer Verhaltens dynamisch, Bevölkerungsstruktur, und möglicherweise Evolutionsgeschichte 3. Darüber hinaus die Umwe...

Es gibt eine wachsende Menge an Literatur, die Assoziationen zwischen unterschiedlichen Verhalten in den einzelnen Tieren aus einer gegebenen Population zu untersuchen. Diese Verbände sind Verhaltenssyndrome bezeichnet, und die Messungen typischerweise Kühnheit, Aggression, Erkundungsverhalten und Kontaktfreudigkeit 1-5. Verhaltenssyndrome sind wertvoll für die direkten und indirekten Gründen. Direkt, Wissen über Verhaltenssyndrome kann eine vollständigere Sicht der Evolutionstheorie liefern, Bevölkerungsstruktur und Bevölkerungsdynamik 3. Indirekt Wissen Verhaltens Assoziationen in Bezug auf möglicherweise Felder informieren , dass das Verhalten quantifizieren wie Pharmakologie 6, Toxikologie 7, Verhaltensgenetik 8,9 und Endokrinologie 10. Aufgrund dieser direkten und indirekten Vorteile, ist ein besseres Wissen über Verhaltenssyndrome besonders wertvoll in häufig verwendeten Modellorganismen wie der Zebrabärbling. Studien Zebrabärbling Verwendung gefunden ina Vielzahl von Disziplinen, einschließlich der Analyse von Verhaltenssyndrome 13.11. Um vorab Wissen in Forschung Verhaltenssyndrom, und weil andere Disziplinen auch Verhaltensmessungen zur Überprüfung der Hypothese, zuverlässig und prägnante Beschreibungen des Verhaltens verwenden müssen für gültige Analysen und Interpretationen und standardisierte Protokolle inter Studie Vergleiche innerhalb der Arten erleichtern. Unser Protokoll wurde entwickelt , eine Kühnheit-Aggression-shoaling Verhaltenssyndrom in einer Population von Labor aufgezogen Zebrabärbling 14 zu messen. die Grundlage des Protokolls (Tracking einzelner Fisch, richtige Randomisierung und entsprechende Analysen zu gewährleisten) jedoch für eine Vielzahl von alternativen Verhaltensmaßnahmen leicht modifiziert werden kann. Zusätzlich Kühnheit, Aggression oder shoaling Assays können individuell für die Prüfung von verschiedenen Hypothesen ausgeführt werden. Daher wird, während es unser Ziel ist, zu beschreiben, wie ein Verhaltenssyndrom Studie durchzuführen, und das Protokoll für die erfolgreiche Einzel level Verhaltensmessung, jede Facette dieses Verfahrens kann allein stehen. Die Literatur über Verhaltenssyndrome mehrere taxonomischen Gruppen umfasst, von Arthropoden auf den Menschen und 4, um ein Verhaltenssyndrom, mindestens zwei Verhaltens Kontexten zu messen müssen quantifiziert werden. Leider gibt es oft wenig Konsistenz in den Assays, die die Verhaltensmessung über den Achsen des Verhaltens verwendet werden, um zu quantifizieren. Zum Beispiel in Fisch kann Kühnheit T-Labyrinth - Tests unter Verwendung von Open-Feld - Assays oder Einführung eines neuen oder fremden Reiz 15 gemessen werden. Aggression Studien bei Fischen könnte Dyade Interaktionen beinhalten, Stimulus Video - Assays oder Tonmodell Assays 12,16,17. Ebenso Analyse shoaling Verhalten, das typischerweise die Messung von shoalmate bevorzugt handelt, kann in verschiedenen Arten von Behältern mit unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden 21-23 Assoziationszeit zu bestimmen. In diesem Protokoll eine bestimmte Teilmenge der Marktpreisefürll Verhaltensrepertoire Assay dargestellt. Insbesondere stellt dieses Protokoll eine Methodik Individuen durch Kühnheit, Aggression und shoaling Assays in einer Weise zu verfolgen, die Vergleiche innerhalb der Individuen erleichtert, um zu bestimmen, ob die Vergleiche in allen Individuen innerhalb einer Population konsistent sind. Wir haben dieses Protokoll mit Zebrabärbling und Sträfling Cichliden ausgeführt (Amatitlania nigrofasciata) in früheren Studien 14,18, und es wird mit jedem ähnlich großen Süßwasserfische arbeiten. Verwegenheit Assays werden in einem 1,5 L trapezTank durchgeführt, die eine horizontale Linie begrenze gleich große Bereiche in den oberen und unteren Abschnitt des Tanks aufweist. Quantifizierten Verhaltensweisen beinhalten die Anzahl der Übergänge durch den Test Fisch zwischen dem oberen und unteren Abschnitt des Tanks, der Zeit, in jedem Abschnitt, die Anzahl der Pfeile ausgegeben, und die Latenzzeit den oberen Abschnitt ein. Die Aggression Assay wird in einem 19L rechteckigen Behälter durchgeführt, der Folgendes beinhaltetein 3 Zoll x 5 Zoll Spiegel in der unteren linken Ecke des Behälters 19 befindet sich bei ca. 22 ° geneigt ist . Quantifizierte Verhaltensweisen gehören die Gesamtmenge der Zeit durch den Zielfisch verbrachte mit dem Spiegel 20, zusammen mit spezifischen aggressiven Indikatoren interagieren - die Zahl der Bisse, seitliche Displays, Darts zwischen dem Test Fisch und seine Reflexion. Für diese spezifische Indikatoren, Bisse so schnell lunges auf den Spiegel mit offenem Mund definiert sind, werden seitliche Displays als Abfackeln von lateral, Brust, analen und Rückenflossen in Richtung des Spiegels definiert, und Darts sind alle erratische Bewegungen, die sind nicht auf den Spiegel gerichtet ist. Schließlich quantifiziert die shoaling Test das Verhalten eines Versuchsfische in Mittelkammer eines Tri-Kammer-Tank. Die Seitenkammern des Tanks sind entweder leer oder enthält ein &quot;Ziel Schwarm&quot; von Fischen, und die Zeit , die Versuchsfische in der Nähe von jeder Seite Kammer verbringt wird 21-23 gemessen. Eine einzelne Composite-Score, bezeichnet als Strength von Shoaling (SoS), wird für jeden einzelnen Test Fisch, spezifisch auf die Reize , berechnet, und kann in nachfolgenden Analysen 14 verwendet werden. Alle Verhaltensweisen werden von einem einzigen Betrachter hat, oder mehrere Zuschauer frei Verhaltensquantifizierungssoftware bekannt als jWatcher 24 verwendet wird . Das Vorhandensein eines Verhaltenssyndrom Testen ist in erster Linie ein statistisches Fangen, und es ist ratsam , die Richtlinien zu folgen , wie 25 durch Budeav 2010 vorgelegt. Insbesondere wird empfohlen , eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) auf zentriert und normierter Daten durchzuführen , in denen die Eingänge sind die Vektoren der individuellen Verhaltensweisen in Tests mit mehreren Verhaltensmessungen (dh Kühnheit und Aggression). Der PCA auf einer Korrelationsmatrix durchgeführt wird, reduziert die Dimensionalität der Verhaltensmessungen und damit extrahiert die wichtigste Erkenntnis, dass eine Mehrheit der Variation erklärt. Die extrahierten Komponenten können dann interpretiert werden, based auf hohe Faktorladungen für das individuelle Verhalten von Interesse und Regressions Scores können für jeden einzelnen auf der Grundlage der erläuternden Komponenten extrahiert werden. Diese Regressions Scores können dann auf die SoS Messung und andere verschiedene nicht-Verhaltensmessungen verglichen werden wie Fisch Größe oder Geschlecht. Dieser Workflow wurde in einer Studie von Zebrabärbling Verhaltenssyndrome , bei dem ein geschlechtsspezifische Verhaltenssyndrom implementiert , die 14 zwischen Kühnheit und shoaling existiert entdeckt wurde. In dieser Situation kühner Zebrabärbling Männchen sind eher mit einem größeren, aggressive Arten (D. albolineatus) zu assoziieren, aber diese Assoziation ist bei Frauen verloren. Dieser Workflow wurde auch in einer Studie von jugendlichen Verurteilten Cichlide kin (Amatitlania nigrofasciata) 18 , in dem ein Verhaltenssyndrom wurde nicht entdeckt, die möglicherweise auf eine Verhaltensplastizität der Spezies umgesetzt. Daher wird das folgende Protokoll vorgestellt wit einem Ziel, die Natur von drei spezifischen Assays von begrenze (Kühnheit, Aggression und shoaling) im Rahmen Verhaltenssyndrom des Studiums eine individuelle Ebene.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Rack System</td><td>Aquaneering Inc</td><td>Cat. # ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g</td><td>Pet Valu</td><td>Cat. # 31700</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Trapezoidal Tank</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>Cat. # itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi KP-D20A CCD Camera</td><td>Prescott&#039;s, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3&quot; x 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>Cat. # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

boldness, aggression, and shoaling assays for zebrafish behavioral syndromes

Ein Verhaltenssyndrom besteht, wenn bestimmte Verhaltensweisen unter verschiedenen Kontexten interagieren. Zebrabärblinge wurden in den letzten Studien Testpersonen gewesen, und es ist wichtig, Protokolle zu standardisieren richtigen Analysen und Interpretationen zu gewährleisten. In unseren früheren Untersuchungen haben wir eine Freudigkeit gemessen, indem eine Reihe von Verhaltensweisen, die Überwachung (Zeit nahe der Oberfläche, Latenz bei Übergängen, die Anzahl der Übergänge und Darts) in einem 1,5 L Trapez Tank. Ebenso quantifiziert wir Aggression durch die Beobachtung Stiche, seitliche Displays, Darts, und die Zeit in der Nähe von einem geneigten Spiegel in einem rechteckigen 19 L Tank. ein 76 l-Tank in Drittel Durch die Aufteilung, die wir untersucht auch shoaling Vorlieben. Der shoaling Assay ist ein hochgradig anpassbarer Test und kann für spezifische Hypothesen angepasst werden. Allerdings Protokolle für diesen Test muss auch sein, standardisierte und dennoch flexibel genug, die individuell gestaltet werden. In früheren Studien waren Ende Kammern entweder leer, enthielt 5 oder 10 Zebrabärbling oder 5 Schillerbärbling (D. albolineatus). Im folManuskript genden stellen wir ein detailliertes Protokoll und repräsentative Daten, die erfolgreiche Anwendungen des Protokolls begleiten, die für die Replikation von Verhaltenssyndrom Experimente erlauben.

Je nach der Art der Untersuchung, und die spezifischen Protokoll verwendet wird, sind mehrere unterschiedliche Ergebnisse möglich, in einem Experiment Verhaltenssyndrome. Die folgenden Tabellen und Abbildungen, in denen angegeben ist , aus unserer früheren Studie angepasst sind , veröffentlicht in der Zeitschrift Behavioral Prozesse 14 und die Zeitschrift Zebrabärbling 17. Wenn der Vorschlag (wie oben beschrieben) ist in seiner Gesamtheit durchgeführt, zwei Sä...

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Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Mut, Aggression, und Shoaling Assays für Zebrabärblinge Behavioral Syndromes

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

boldness-aggression-shoaling-assays-for-zebrafish-behavioral

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Aufrufe.  Saint Joseph’s University. This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Serie: Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Forschung

Biologie

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Verhaltensweisen für den Studierenz-Stress in Zebrafischen

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Verhalten

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neurowissenschaften

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

Die Dreikammer-Wahl-Verhaltensaufgabe mit Zebrafisch als Modellsystem

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Verhaltenstestbatterie zur Bewertung neurotoxischer Wirkungen bei adulten Zebrafischen

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor im Rampenlicht: Bewertung umwelt- und arzneimittelinduzierter Verhaltensänderungen bei adulten Zebrafischen 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.