Name: visualization of il-22-expressing lymphocytes using reporter mice
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

全ての動物は、癌研究のためのフレデリック国立研究所の実験動物委員会の管理と使用に関する2011ガイドに記載の実験手順に従い、適切なケアを受けました。 BAC遺伝子改変によるIL-22-tdTomatoレポーターマウスの1世代注：マウスは無意識であるべきであり、有害な刺激に応答して移動しません。 70％エタノールで手術領域を滅菌し、ガラスビーズ滅菌器を使用して、すべての手術器具を滅菌します。 <ol><li>アルカリ抽出法10、11を用いて、BAC DNA（RP23-401E11、クローン長228391 BPS）を精製します。標的遺伝子の正確なサイズを確認するためにRP23-401E115μgのののSpeI消化によりBACクローンを特徴づけます。注：BAC DNAは14の断片に消化しました。 </li><li> PLD53SC-A-GFP-BシャトルベクターのNot Iで/ SalI部位にTdTomatoレポーター遺伝子を挿入11と同じサイト内のGFP遺伝子を交換してください。その後、PCR（95℃、2分によるIL-22（エクソン1）の最初の翻訳エクソンに相同ボックス（AとB）を増幅、テンプレートとしてBAC RP23-401E11を使用して、30のために95°Cの30サイクル秒、30秒、55℃、および72℃30秒間、および10分間72℃での最終伸長）。 50μlのPCR反応系では、BAC DNA 50ngの（1μl）を、プライマー0.5μlの（10μM）、PCRスーパーミックス高忠実度の40μlの、およびH 2 Oの8μlを添加します 5&#39;- T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAGとリバース：フォワードボックス：注：次のようにAとBの箱のためのプライマーは、5 &#39;CAGAGATCGCACAAGTGTCAACを。 Bボックスフォワード：5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACAとリバース：5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10。制限酵素（ASC IとのPac I）の部位には下線が付されています。 </li><li> Asc I消化Aの500 ngのとのPac I消化B fragm 500ngのを連結1時間16℃でPLD53SC-ATB（tdTomato）ベクター50ngのにエント。 </li><li> 37℃でクロラムフェニコール（20μg/ ml）およびアンピシリン（30μgの/ ml）で寒天プレートルリア-ベルターニ（LB）にBAC-コンピテント細胞に11や文化、それらを精製したPLD53SC-ATBベクトルを変換します。 Chの/アンプのマスタープレートから共同統合の2〜3個のコロニーを選択してください。 </li><li> 20μg/ mlのクロラムフェニコールを補充したLBの1ミリリットル中に各コロニーを植菌し、37℃で1時間および225 rpmのためにそれらをインキュベートします。 LB寒天プレート上に各混合液100μlを広げる（ペプトン140を10g、酵母エキス、寒天12 gであり、水1Lを5g、pH7.5）にクロラムフェニコールおよびスクロースの4〜4.5％の補充。 37℃で一晩培養をインキュベートします。 </li><li>大小両方のコロニーを選択し、クロラムフェニコールを2 LB寒天プレート上にreplate。その後、30秒間UV光の有無にかかわらずどちらかのプレートを公開し、さらなる分析のためのUV感受性コロニーを選択。 </li><li> tdTomato / IL-22ヘテロ接合プライマー（：;：TGT AAT CGG GGA TGT CGG C 5 &#39;5リバースACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT&#39;フォワード）を用いたPCRによる修正されたBAC DNAを識別します。次のようにサーモサイクラー条件は、2分間、95°C; 30秒間、30秒間56℃、30秒間72℃、95℃の30サイクル。そして72℃で10分間の最終伸長。 </li><li>大プレップBAC DNA 12の直接BAC配列決定によりBACの改質領域のシーケンスを確認してください。 </li><li>偽妊娠C57BL / 6（c）マウスにマイクロインジェクション接合体を注入する際に腹腔内に0.25％のトリブロモエタノールの用量でレシピエントマウスを麻酔。 </li><li> IL-22-tdTomato BACは、反応系100μl中制限endonucleasePi-SceIを5μlので消化することにより（10μgの）を構築し、前核期13でC57BL / 6雌の受精卵に線形化されたBAC DNAを顕微注入する線形化。 SCRE標準的な手順を用いて尾の生検から単離されたDNAのサザンブロット分析により、トランスジェニックマウスアン。 </li></ol>脾臓、胸腺、リンパ節、及びパイエル板から2.単一細胞の準備注：IL-22-tdTomatoレポーターマウスは、国立癌研究所（NCI、フレデリック、MD）で維持しました。安楽死の方法は、安楽死の最新AVMAガイドラインに準拠しています。すべてのマウスをCO 2吸入14を使用して安楽死させました。 <ol><li> CO 2チャンバー内でIL-22-tdTomatoマウスを安楽死させるときれいなパッドの上に置きます。 70％アルコールを噴霧することにより、腹部の皮膚を殺菌し、開いたそれをカット。左脇腹と胸骨の背後にある胸腺に脾臓を除去します。 </li><li> mesentericlymphノード（腸間膜組織内）と（小腸の回腸地域全体の小lymphoidnodules）パイエル板を回収するために、真珠のような白い腸間膜はtに近いするノード取ります体の外に全体の小腸および結腸を削除し、最初の細かい点鋸歯状チップを備えた鉗子を分析し、使用して小腸の彼は壁。腸に沿って延びる楕円形のパッチ（パイエル板）を検索し、ハサミでそれらをカット。氷上でPBS緩衝液/ 1％ウシ胎児血清（FBS）中で単一細胞懸濁液に挿入した2つや消しスライド間個別にこれらのリンパ組織（リンパ節およびパイエル板）を挽きます。 </li><li>ステップ2.2と同様の方法を用いて、脾臓または胸腺組織をみじん切りに。遠心分離機500×gで、4℃で8分間、脾臓サスペンション。細胞ペレットに脾臓あたりのACK溶解緩衝液1mlを追加します。 </li><li>よく混合し、それらを1分間放置しました。各サンプルに、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液9 mlで加えます。赤血球を除去するために500×gで、4℃で8分間の遠心分離によってスピンダウン。 注：胸腺細胞にACK溶解バッファを追加しないでください。 </li><li> PBSおよびp 5mlの得られた白血球を再懸濁100μmのセルストレーナーを介して細胞をお尻。 8分間の500×gの遠心分離によって細胞ペレットを収集します。 </li><li> RPMI培地またはFACS緩衝液5ml中に細胞を再懸濁し、0.4％トリパンブルー染料/ PBS溶液を用いて生存細胞を数えます。 </li></ol>腸からの上皮内リンパ球および固有層細胞の単離3 <ol><li>右の肛門の上、（近く付録に）回腸、および結腸全体に十二指腸から（次の胃に）、ステップ2.1のように腹部の皮膚を開き、小腸をカット。鉗子を使用して、余分な脂肪と腸間膜組織を削除します。氷冷PBS中ですぐに腸を入れてください。 </li><li>小腸の遠位領域に沿ってパイエル板（小、ラフ結節）を探してください。はさみを使って縦に腸andopen鉗子を使用して大衆を削除します。徹底的氷冷PBS 10mlで腸を洗浄します。 </li><li>プレ消化緩衝液（5mMのEDTA 20mlの組織をインキュベートそしてシェーカーでゆっくり回転（50 rpm）しながら37℃で30分間、ハンクス平衡塩溶液（HBSS））中に1mMジチオスレイトール。 2インキュベーションのそれぞれの後、激しいボルテックス（12,000 rpmで30秒間）によって、上皮内リンパ球（IELs）を含む、上皮細胞層を除去し、100μmのセルストレーナーを介してすべての組織を通過します。 </li><li> 37℃で30分間の第二のインキュベーションのために組織に新たなEDTA溶液20mlを加えます。 100μmのセルストレーナーを通してIEL画分をパスし、前の画分でそれらをプール。ステップ3.9で扱われることを氷の上に残っている腸の断片を保管してください。 </li><li>遠心機で4℃で5分間、800×gでプールIEL画分。 HBSS / 5％FBSの10ミリリットルと共にプールIEL画分を洗浄し、800×gで4℃で5分間、それらをスピンダウン。 </li><li> 44％のコロイダルシリカ媒体15 8mlに細胞を再懸濁し、67％のコロイダルシリカ培地5mlでそれらを重ねます。遠心分離機44％/ 67室温と1500×gで20分間、0.5パーセントの細胞混合傾斜。 </li><li>界面でのバンドからIEL細胞を収集します。まず、1ミリリットルピペットを用いて上清（約5ml）の最上層を除去します。次に、コロイダルシリカ媒体勾配の間期で収穫IELs。 </li><li> RPMI培地10mlを加えることによって、IEL​​sを洗ってください。 800×gで、4℃で5分間、細胞をスピンダウン。ステップ3.15のためにRPMI 5mlのIELsを再懸濁します。 </li><li>固有層リンパ球（LPLs）の単離のために、はさみを使用して小片（1ミリメートル）にステップ3.4から腸組織断片をミンチし、消化緩衝液の10ミリリットル（コラゲナーゼの0.05グラム、DNアーゼIの0.05グラムと作品ダイジェスト37℃で15〜20分間、RPMI / 5％FBS中でディスパーゼII）を0.3g。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを通して混合物を濾過。フロースルー上清を解放LPLが含まれています。 </li><li>完全に（通常は、彼らがしなければならない手順3.9から3.10を繰り返すことによって、腸の断片を消化）を3回繰り返しました。たびに、LPLsを含む上清をプール。 </li><li> 1,500×gで、室温で5分間の遠心分離によって細胞を収集し、RPMI / 5％FBS中でペレットを再懸濁します。 40μmのセルストレーナーを介してそれらを渡します。 </li><li> 40:80コロイダルシリカ媒体勾配の40％画分10mlに細胞ペレットを再懸濁し、15mlチューブ中の80％の画分5mlの上に重ねます。 </li><li> 1500×gで20分間の遠心分離により密度勾配分離し、室温15を実行します 。 </li><li>ステップ3.7で説明したように、LPLsを収集します。 10mlのPBSで一回、それらを洗浄し、PBS / 1％FBSバッファまたはRPMI培地1ml中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 0.4％トリパンブルー色素/ PBS溶液を用いて、生細胞（IELsとLPLs両方）をカウントします。 </li></ol>大腸炎におけるIL-22-tdTomatoの4式<ol><li> &lt;1×10の濃度でIL-22-TdTomatoマウスから単脾臓細胞懸濁液を準備しますステップ2.1から2.4に記載されているように、滅菌PBS中のsup&gt; 7細胞/ mlで、。 </li><li>マウスCD4細胞陰性単離法10を用いて、CD4 + T細胞を精製します。 、抗CD4-APC（クローンRM4-5、PBS / 1％FBSバッファー中の0.5μL/ 1×10 6細胞）および抗CD45RB-FITC（クローン16Aにラベルを付け、PBS中0.5μL/ 1×10 6個の細胞30分間4℃でインキュベートすることにより/ 1％FBSバッファ）。 </li><li> 500×gで、4℃で5分間、細胞をスピンダウン。 PBS / 1％FBS緩衝液2mlで細胞を洗浄し、PBS / 1％FBS染色緩衝液1mlで再懸濁。 </li><li>マシン16、フローサイトメトリーで標識されたT細胞を実行します。ゲートT細胞集団上のセルとソートCD4 + CD45RB 高の二重陽性細胞（488 nmおよび633 nmのレーザーで検出波長）。 </li><li> 500×gで5分間、4℃の遠心分離により選別された細胞を収穫。 1×10 6で無菌PBS緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁</SUP&gt;細胞/ ml。 - / -レシピエントマウスRAG1 ofeach腹膜への細胞（0.5×10 6）を注入します。 </li><li>種々の時点でCO 2下、レシピエントマウスを生け贄に捧げます。ステップ2.1および2.2に記載したように、腸間膜リンパ節および小腸および大腸を収穫。各腸間膜リンパ節を入れ、カットオープン腸（紙/腸/紙サンドイッチ）4％パラホルムアルデヒド中で（PFA;ヒュームフードの下で扱う）組織を固定する一夜。 16-24時間、18％スクロースをPFAを交換した後、切片のための組織を凍結します。 </li><li>組織17、18、19をカットするクライオスタットのマシンを使用してください。約60分間室温に組織切片を温め、室温で10分間アセトン中にそれらを置きます。約5分間、室温でそれらを乾燥させます。 </li><li>過剰にFBSを追加ピペットでそれを削除し、1の抗RFPを追加します。0.1％BSA / 1×Pで200希釈BS。 37℃で60分間抗体をインキュベートします。 </li><li>室温で30分間、1％BSA / 1×PBS中で300：10分間、1×PBSで切片を洗浄し、組織に対応する二次抗体（ヤギ抗ウサギ568）を適用し、1に希釈しました。 </li><li> 10分間、1×PBS中でスライドを洗浄し、乾燥し、それらを拭いて、カバースリップを追加します。 </li><li> 40Xの対物レンズを使用して：一貫性の照明下での蛍光顕微鏡（励起フィルター540から580 nmのRFP）を持つすべてのサンプルを視覚化します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

IL-22は、先天性宿主防御と組織リモデリングに重要な役割を果たしています。 IL-22産生細胞は、細胞内染色によってエキソビボで同定されています。しかし、それはまだ正常な状態または炎症状態のいずれかで、 その場での IL-22の発現を追跡することが困難なままです。このプロトコルは、 生体内でのレポーター発現細胞を局在化することを可能にIL-22レポーターマウス...

レポーター遺伝子の細胞型特異的発現を積極的恒常性と摂動状態の下で組織に標的を発現する細胞を同定するのに有用です。また、そのほかの特性を研究するために、生存したままでこれらの細胞の精製を可能にします。レポーターマウスは、特定のサイトカイン、転写因子、および調節要素の作用機序の解明に利用されています。以前の戦略1、2、3は、主にマウス染色体、時間とコストのかかる手順で標的遺伝子座にレポーターをノッキングに頼ってきました。したがって、レポーターマウスを生成するための簡単な方法が望ましいです。 サイトカインは、細胞間のシグナル伝達を介して免疫応答を調節する小、分泌タンパク質/ペプチドの幅広いクラスです。インターロイキン22（IL-22）障壁のfuを含む多く報告された活動、とサイトカインでありますnction、組織修復、及び炎症4。 IL-22は当初、T細胞の生成物5として発見されたものの、その後のレポートは人間6およびマウス7で先天性リンパ球8の他のクラスにナチュラルキラー（NK）細胞におけるその発現を示しました。 IL-22産生細胞の広範囲観察にもかかわらず、IL-22の可視化は、以前に抗体を用いた汚れにex vivoで刺激し、透過処理を必要としました。そのため、新規のIL-22レポーターマウスは、恒常性と発病過程におけるIL-22の機能を調べるために非常に有用なツールになります。 ここでは、in vivoおよびin vitroで IL-22産生細胞を観察するために簡略化されたトランスジェニックレポーターマウスモデルを開発しました。 BACのコンビニアリング法9を使用して、我々は、IL-22 LOCにポリ信号断片とtdTomato cDNA配列を挿入しました私たちと私たちはできるだけIL-22の自然調節を模倣したいと思いますので、他の非翻訳領域、エクソン、および調節要素は、乱されていなかったエクソン1を取り替えました。レポーターの挿入部位を急速に分泌されるIL-22自体とは異なり、生細胞内部のレポーターの蓄積をもたらす、シグナル配列を破壊します。この新しい方法はまた、他の分泌タンパク質のためのレポーターマウスの作製に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23.C</td><td>Need gene ID: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Dynal shaker</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>LSRII SORP/flow cytometry</td><td>Becton, Dickinson and Company&amp;nbsp;</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr></tbody></table>

visualization of il-22-expressing lymphocytes using reporter mice

レポーターマウスを広く標的遺伝子の発現の局在を観察するために使用されています。このプロトコルは、新しいトランスジェニックレポーターマウスモデルを確立するための戦略に焦点を当てています。我々は、このサイトカインが炎症によって損傷を受けた組織を修復するために寄与する腸における重要な活性を有するので、インターロイキン（IL）22遺伝子の発現を可視化することを選択しました。レポーター系は、 インビボの製品を特定する他の方法に比べてかなりの利点を提供します。 IL-22の場合には、他の研究は、最初の組織から細胞を単離した、その後、インビトロで細胞を再刺激しました。 IL-22、通常は分泌され、薬剤を使用して細胞内に閉じ込められた、そして細胞内染色は、それを視覚化するために使用されました。この方法は、IL-22を産生する能力を有する細胞を識別し、それは彼らが、in vivoでそのようにやっていたかどうかを決定するものではありません。レポーターのデザインは、ワシントン州にあるIL-22遺伝子に蛍光タンパク質（tdTomato）の遺伝子を挿入するステップを含みます蛍光タンパク質を分泌することができないため、 生体内での産生細胞の中に閉じ込められたままであることのy。蛍光の生産は、フローサイトメトリーを介して組織切片またはエキソビボ分析によって可視化することができます。レポーターのための実際の建設プロセスは、IL-22遺伝子を含む細菌人工染色体をコンビニアリング含まれています。この操作された染色体は、その後、マウスゲノムに導入しました。恒常的なIL-22レポーターの発現は、フローサイトメトリー分析により、脾臓、胸腺、リンパ節、パイエル板、および腸を含む種々のマウス組織において観察されました。大腸炎は、T細胞（CD4 + CD45RBhigh）転写によって誘導し、そしてレポーター発現を可視化しました。陽性のT細胞は、腸間膜リンパ節内の最初に存在した後、それらは、遠位小腸および結腸組織の固有層内に蓄積しました。 BACを用いた戦略は、IL-22 EXPRESに比べて良好な忠実度のレポーター発現を与えましたシオン、それがノックイン手順よりも簡単です。

マウスIL-22レポーター導入遺伝子は、IL-22遺伝子座を保有する細菌人工染色体を変更するには、コンビニアリングを使用して作成されました。 図1は、sacBII遺伝子を含むpBACe3.6ベクター、ポジティブ選択マーカー、およびクロラムフェニコール抗生物質耐性遺伝子11の図を示しています。 図2に示すように、エクソン1にtd...

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Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K ビュー.  National Cancer Institute, National Institutes of Health. We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse. 

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

生物学

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

免疫・感染学

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

リステリア単球遺伝子感染症後のマウス脾臓におけるインシチュインターフェロンガンマ産生のイメージング

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...