Name: synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry
Uploaded: 2016-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

注： 図1に示すように、以下のプロトコルは、タンパク質-色素バイオコンジュゲートの合成のために設計されているノートが挿入されて膜タンパク質を支援するために、該当する場合それは、自由表面システイン含有タンパク質とのマレイミドの反応のための一般的なプロトコルです。バイオコンジュゲートは、タンパク質 - ポリマーバイオコンジュゲート、および合成タンパク質の二量体（タンパク質 - タンパク質）バイオコンジュゲート。この特定の場合において、タンパク質アイソ1シトクロムcは、高度に特異的な標識化が発生することを可能にする反応に利用できる一面のシステイン残基を有します。目的のタンパク質が複数のシステイン残基を有する場合は、同じプロトコルは、特異性と製品の均一性の損失にもかかわらず、適用されます。特異性は要求されない場合、表面リジン残基を標的とする化学的性質は、N -hydroxysuccinimidylエステルまたはイソチオシアネートを使用して、単純なアプローチであり得ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt;図1. バイオコンジュゲーションの反応スキーム。例の場合、光収穫としては、ルテニウム系アンテナ分子は、（CYS102）ルテニウム系アンテナ分子上のペンダントマレイミドと露出したシステイン残基のマイケル付加を介してシトクロムcに添付されますタンパク質上。チトクロームcの表面の赤い部分は、ヘム基を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> シトクロムcの1精製注：このステップはすべてのタンパク質には適用されません。しかし、商業的供給業者から得られたタンパク質は、さらに精製13によって除去する必要があるかもしれない他の、望ましくないタンパク質アイソフォームを含むことができることを知っておくことが重要です。 <ol><li> PRに超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム（= 120 gでモル-1 W M）を2.4g溶解20mMのNaH 2 PO 4を含む緩衝液をepare。 pH7に1 M NaOHでpHを調整します。 注意：このプロトコルで使用されるリン酸緩衝液は、毎日新たに調製し、使用前に、0.2μmのセルロース膜フィルターを通して濾過されるべきです。 </li><li> 20 mMののNaH 2 PO 4および1 M NaCl緩衝液を作るために、塩化ナトリウムの29.22グラム（ ワット M = 58.44グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは）、ステップ1.6において精製のための溶出緩衝液です。 </li><li> pHが7〜20 mMリン酸緩衝液の6ミリリットルで凍結乾燥したシトクロムc（のcyt c）は 12.0ミリグラムを溶解させます。 </li><li>別々に1 Mのストック溶液を調製し、超純水を95.3μlのジチオスレイトール14.7ミリグラム（DTT、M W = 154.25グラム/モル）を溶解します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようにDTTストック溶液を、新たに調製しなければなりません。 </li><li>ピップタンパク質溶液に1 M DTT溶液60μlのETTEは、チトクロームcを低減することができます。溶液の色は混合時に光赤に暗赤色に変わります。 </li><li>任意のクロマトグラフィー媒体に注入する前に、0.22μmの低タンパク質結合PVDFシリンジフィルターに通して減少したタンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li>注入ループと高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）装置の紫外可視検出器との間に3.3ミリリットルの強い陽イオン交換カラムを取り付けます。 </li><li> 1ml /分の流速を用いて、20mMのpH7のリン酸緩衝液の3カラム体積、続いて超純水の3カラム容量でカラムを平衡化。 </li><li>注入ループへの負荷減少粗チトクロームcの1ミリリットルを、そして328から勾配法開始- 5カラム容量を超える450のNaClを、。紫外可視検出器の280 nmおよび410 nmのチャネルを監視し、最大ピークを収集します。 </li><li> ISO-2チトクロムを溶出するために2カラム体積のために1 Mに塩濃度を増加させますE cおよびカラムをフラッシュした後、次の粗アリコートを注入する前に、リン酸緩衝液を20mMの2カラム容量でカラムを再平衡化。 </li><li>すべての粗タンパク質が精製されている繰り返して、1.9から1.10を繰り返します。 </li><li>プールイソ-1画分を含有し、それらは3.5 kDaの分子量カットオフ（MWCO）スピンフィルターを使用し、3000×gで遠心分離集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮タンパク質をロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li> 、10μLを取って超純水で100μlにそれを希釈し、吸光度スペクトルを取ることにより、純粋な濃縮タンパク質溶液の濃度を決定します。少量を使用し、100μlの石英キュベットは、タンパク質吸収スペクトルを得ました。 100μM - 一般的に、希釈していないタンパク質濃度は50程度です。 <ol><li> concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル-1 mMの-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して： A =ε×C×ι Aは吸光度であり、εはモル吸光係数は、cはミリモルでの濃度であり、ιは、CM 13におけるキュベットの経路長です。 </li></ol></li><li>この時点で、1mLのアリコートにタンパク質を分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 CYT cは凍結し、解凍した構造または機能を失うことなく、しかし、繰り返しサイクルは、タンパク質を変性し始めることができます。 注：タンパク質は、異なる程度に凍結耐えます。例えば、緑色蛍光タンパク質5,9の代わりに冷蔵庫に保存し、凍結されるべきではありません。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの2合成<ol><li>ルテニウムの0.9 mgのディゾルブ（II）bisterpyridine maleimIDEルテニウム（Ru（II）（TPY）2 -マレイミド、0.975マイクロモル、6当量）のアセトニトリル600μlのインチ 注：使用マレイミドは水溶性である場合、水の代わりに、アセトニトリル中のストック溶液を調製します。マレイミドは、反応緩衝液中で可溶性であることが重要です。ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリルは、低分子量12、多くの場合、疎水性のマレイミド反応物の溶解を助けるためにすべての一般的に使用されるアジュバントです。 </li><li> 20mMに希釈したときにEDTAが溶解するまで、典型的には（数グラムを固体水酸化ナトリウムを加えてpH 7で100 mMリン酸緩衝液および100mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、M W = 292.24グラム/モル）を含む緩衝液を調製）と、pHを7に調整します。 </li><li> 10mMのストック溶液を調製し、超純水1ml中のトリスの2.87 mgの（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP 15、M W = 286.65グラム/モル）を溶解させます。このステップは、インポートされアリは、タンパク質上のシステインが完全に15を連結するマレイミドの前に低減されることを保証します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようTCEP原液は、それぞれの反応のために新たに調製しなければなりません。 </li><li> 50ミリリットルプラスチックチューブで100 mMリン酸/ EDTAストック溶液3mlで超純水11.4ミリリットルを兼ね備えています。タンパク質およびマレイミド原液でさらに希釈すると緩衝液濃度を20mMになります。 注：標識されたタンパク質は膜貫通タンパク質である場合、適切な界面活性剤は、タンパク質を可溶化するために緩衝液に添加されていることを確認します。洗剤を使用しない場合は、膜タンパク質が徐々にマイナスの反応収率に影響を与えるであろう、沈殿ができます。すべての後続の精製工程で洗剤を使用してください。 </li><li>リン酸EDTA緩衝液に精製されたチトクロームcの0.15マイクロモル（50μM溶液3ml、1当量）を追加します。 </li><li> TCEPストックsolutの7.5μLを追加タンパク質溶液にイオン（0.075マイクロモル、0.5当量）とは、システイン酸化による二量化している可能性のあるタンパク質を減らすために5分間攪拌したままにしておきます。 注意：目的のタンパク質が容易に二量体化していない場合TCEPを追加しないでください。非還元条件下でタンパク質ゲルを実行することによってこれを確認してください。 </li><li> 24時間、室温で、暗所でのRu（II）（TPY）のcyt cの減少、緩衝溶液に2 -マレイミドのアセトニトリル溶液600μlを添加し、反応混合物の攪拌を残します。 </li><li>ろ液が透明に実行されるまで、新鮮な20mMのリン酸緩衝液で2〜​​3回繰り返し、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを用いて反応混合物を濃縮します。精製の次の段階の前に、可能な限り、反応混合物からできるだけ多くの未反応のマレイミドを削除します。 注：この時点で、粗製のバイオコンジュゲーション混合物を、暗所で、冷蔵庫で保存することができます。 CENTRにより未反応のマレイミド色素を除去することが重要です保存前の透析ifugeマレイミドのようにゆっくりと非特異的にタンパク質の表面上のリジン残基と反応することができます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの3精製<ol><li> 20mMのNaH 2 PO 4、0.5 M NaClを含む緩衝液を調製し、超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム2.4gの塩化ナトリウムの29.22グラム溶解します。これは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製のためのランニングバッファーです。 </li><li>イミダゾールの17グラム（ ワット M = 68.077グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4および0.5MのNaCl緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは、IMAC精製の溶出緩衝液です。 </li><li> 1 M NaOHまたはHClを用いてpH7に両方のバッファのpHを調整し、FPLCで使用する前に0.22μmの再生セルロース膜を介してそれらをフィルタリングします。 </li><li>購入したIMACカラムは、COL上にロードされた任意の金属イオンなしで出荷されているようにUMN、Niのためにカラムを準備2+ベースの超純水を3ml、100mMの酢酸ニッケル溶液3mlでカラムを洗浄することによって精製し、超純水6mLを。カラムをすぐに使用しない場合の20％エタノール3mlのを通して洗浄し、細菌の増殖を防ぐために冷蔵庫に列を格納します。 </li><li> Ni 2+を取り付け注入ループとUV-Visの検出器との間FPLCに1ミリリットルIMACカラムを-loaded。 </li><li> 20mMのリン酸の3カラム体積、0.5ml /分の流速を用いて0.5 M NaCl緩衝液でカラムを平衡化します。 </li><li>負荷のNi 2+ IMACカラム（0.22μmのシリンジフィルターで濾過）粗反応混合物100μlの。 （C -cytのRu（II））ルテニウムbisterpyridineシトクロムCのバイオコンジュゲートを溶出するために、3カラム容量にわたって0からmMの125にイミダゾール勾配が続く未反応のチトクロームcを溶出するためにランニングバッファーの3カラム容量でカラムを洗浄。 </li><li> Cを洗いますすべての粗バイオコンジュゲートを精製されるまでolumn 5カラム容量のための250 mMのイミダゾール緩衝液で、その後、20 mMのリン酸、0.5 M NaClおよび繰り返しステップ3.7でカラムを再平衡化。 </li><li>バイオコンジュゲートの画分をプールし、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを使用してそれらを集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮されたバイオコンジュゲートをロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li>純粋の濃度を決定し、410 nmでISO-1シトクロムc（97.6 mMの-1 cm -1 で ）同じモル吸光値を使用して、UV-Visのことでバイオコンジュゲート液を濃縮しました。 100μM - 一般的に、バイオコンジュゲートの濃度が50程度です。 </li><li> 25μlのアリコートにバイオコンジュゲートを分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの4キャラクタリゼーション<ol><li> 抑止しますMALDI-TOF MSによるバイオコンジュゲートの質量のmination <ol><li>アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸溶液1mlにカフェー酸10mgを溶解し（80：20：0.1、v / v / v）です。 </li><li>コー​​ヒー酸溶液5μlの濃縮タンパク質溶液5μlを希釈します。 </li><li> MALDIターゲットプレート上のコーヒー酸溶液0.5μLを発見し、解決策を乾燥させます。 </li><li>スポット0.5は、このカフェー酸スポットの上にサンプル/マトリックス溶液μL、スポットが乾燥することができます。マトリックスの層の間のサンプル「サンドイッチ」にこの上にサンプルマトリックスの別の0.5μLをスポットし、乾燥させます。 </li><li>タンパク質16に適した機器の設定を使用してリニアモードで質量スペクトルを取得します。 </li></ol></li><li> ゲル電気泳動によるバイオコンジュゲートの調査 <ol><li>予混合ドデシル硫酸リチウム（LDS、pHは8.4）緩衝液（4×）トンでタンパク質試料を希釈することによって実行されるように、各タンパク質試料を10μlの準備OAウェルあたり約20μgのの最終濃度。条件を減らす必要が井戸の場合、エージェント（10倍）を低減500mMのジチオスレイトール（DTT）の1μlを添加します。 </li><li> 10分間70℃で熱サンプル。 </li><li>ゲルランニングバッファーを準備するために予混合の50mlの1M MES、1Mトリス塩基、2％SDS、20mMのEDTA（pHは7.7）の超純水950ミリリットルに商業的供給源から緩衝液混合物（20倍）を実行を追加します。 </li><li>ゲルからプラスチック製の櫛を削除し、ゲルランニングタンク内のゲルを置きます。ウェルを緩衝液で覆われているように、ゲルランニング緩衝液でタンクを埋めます。 </li><li>慎重にプレキャスト12％ビス - トリス、1ミリメートル、ロードを支援するために、長いピペットチップを用いて10ウェルのゲル上にロードしたサンプル。分析を助けるために、ゲルの中央のウェルに予備染色10タンパク質分子量マーカー（3から188キロダルトン）をロードします。 </li><li> 35分間200 Vの定電圧でゲルを実行します。 </li><li> 2時間商用クマシーブルー溶液でゲルを染色し、ultrapで洗浄48時間URE水。 </li></ol></li><li> 紫外可視分光法によるバイオコンジュゲートの純度の決意 <ol><li> Ruを5μMソリューション（II）（TPY）2 -マレイミド、イソ-1のcyt c、およびルテニウム（II）-cyt C120μlのを準備します。 </li><li> 250 nmのから650 nmまで、唯一の超純水を含む石英キュベットのベースラインスペクトルを測定します。 </li><li>キュベットは、各測定間ですすぎ、乾燥されることを保証、各成分のスペクトルを測定します。 </li><li>波長の関数としての各成分の吸光度をプロットし、そして1かどうかを決定するために、最終製品に、出発物質の線形和を比較：ルテニウム（II）（TPY）CYTのC 2 -マレイミドの1比率が反応しました。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの 12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2および...

バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 ​​（抗体）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体4,5の合成、ナノメディシン8およびシステム化学9で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド6,7に至ります。 標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学10の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M -1秒を超える-1 11いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒12の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換13を防止するために、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。 ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。

<table><tbody><tr><td>sodium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71691</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>cytochrome &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;, from saccaromyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2436</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Tosoh SP-5PW, 07161</td><td>3.3 ml strong cation exchange column</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15&amp;nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC900308</td><td>3.5 kDa spin filter</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td><td>Thermo Scientific</td><td>66333</td><td>3.5 kDa dialysis cassetes</td></tr><tr><td>Ru(II) bisterpyridine maleimide</td><td>Lab made</td><td></td><td>see ref (14)</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3396</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93284</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>nickel acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244066</td><td></td></tr><tr><td>AcroSep IMAC Hypercell column</td><td>Pall</td><td>via VWR: 569-1008</td><td>1 ml IMAC column</td></tr><tr><td>0.2 micron cellulose membrane filter</td><td>Whatman</td><td>Z697958</td><td>47 mm filter for buffers</td></tr><tr><td>0.2 micron PVDF membrane filter</td><td>Merck-Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>syringe filters for proteins</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84426</td><td>Extremely corrosive! Use caution.</td></tr><tr><td>caffeic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60018</td><td>MALDI matrix</td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td>extremely corrosive! Use caution</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC6060</td><td>Coomassie blue solution</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0342BOX</td><td>precast protein gels</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td>premade protein ladder</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td>premade gel sample buffer</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0004</td><td>premade gel reducing agent</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0002</td><td>premade gel running buffer</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acta FPLC</td><td>GE</td><td></td><td>Fast Protein Liquid Chromatography</td></tr><tr><td>Cary 50 Bio Spectrophotometer</td><td>Varian-Agilent</td><td></td><td>UV-Vis</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water dispenser</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>ultrapure water</td></tr><tr><td>Low volume UV-Vis Cuvette</td><td>Hellma</td><td>105-201-15-40</td><td>100 microliter cuvette</td></tr></tbody></table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

図2に示すように 、飛行質量分析（MALDI-TOF MS）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および紫外-可視（UV-Vis）で分光法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間：バイオコンジュゲートの合成は、3つの主要な方法によって確認されます3,4。添付の小分子の質量に対応する質量の増加、および未反応のタンパ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

synthesis-of-protein-bioconjugates-via-cysteine-maleimide-chemistry

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Chemical Applications of Statistical Analyses

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38.4K ビュー.  The University of New South Wales. このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。 

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

固相樹脂系の方法論を経由して、非対称フェロセン派生バイオコンジュゲートシステムのための合成方法論

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

化学

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; Nicotiana benthamianaの</emVLPは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

免疫・感染学

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different positions. Preclinical studies have shown that the therapeutic index of these traditional ADCs can be improved by the site-specific linkage of toxins. However, current approaches to produce homogeneous ADCs have several limitations, such as low protein expression and slow reaction kinetics. In this protocol we describe how to set up an expression system to incorporate a cyclopropene derivative of lysine (CypK) into antibodies using genetic code expansion. This minimal bioorthogonal handle allows rapid conjugation of tetrazine derivatives through an inverse-demand Diels-Alder cycloaddition. The expression system here reported enables the facile production and purification of trastuzumab bearing CypK in each of the heavy chains. We explain how to link the antibody to the toxin monomethyl auristatin E and characterize the immunoconjugate by hydrophobic interaction chromatography and mass spectrometry. Finally, we describe assays to assess the stability in human serum of the dihydropyridazine linkage resulting from the conjugation and to test the selective cytotoxicity of the ADC for breast cancer cells with high levels of HER2 receptor.

Incorporating a cyclopropene derivative of lysine into antibodies allows the site-specific, rapid and efficient linkage of tetrazine-bearing molecules to generate antibody-drug conjugates.

高速 Bioorthogonal 反応により抱合体の新世代抗体医薬の非標準アミノ酸の遺伝的符号化

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

生化学

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

生物工学

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成

要約

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この動画の章

固相樹脂系の方法論を経由して、非対称フェロセン派生バイオコンジュゲートシステムのための合成方法論

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析

チオエーテル/ビニール硫化テザーヘリカルペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

高速 Bioorthogonal 反応により抱合体の新世代抗体医薬の非標準アミノ酸の遺伝的符号化

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成

要約

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固相樹脂系の方法論を経由して、非対称フェロセン派生バイオコンジュゲートシステムのための合成方法論

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

高速 Bioorthogonal 反応により抱合体の新世代抗体医薬の非標準アミノ酸の遺伝的符号化

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

チオエーテル/ビニール硫化テザーヘリカルペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。