We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

注： 図1に示すように、以下のプロトコルは、タンパク質-色素バイオコンジュゲートの合成のために設計されているノートが挿入されて膜タンパク質を支援するために、該当する場合それは、自由表面システイン含有タンパク質とのマレイミドの反応のための一般的なプロトコルです。バイオコンジュゲートは、タンパク質 - ポリマーバイオコンジュゲート、および合成タンパク質の二量体（タンパク質 - タンパク質）バイオコンジュゲート。この特定の場合において、タンパク質アイソ1シトクロムcは、高度に特異的な標識化が発生することを可能にする反応に利用できる一面のシステイン残基を有します。目的のタンパク質が複数のシステイン残基を有する場合は、同じプロトコルは、特異性と製品の均一性の損失にもかかわらず、適用されます。特異性は要求されない場合、表面リジン残基を標的とする化学的性質は、N -hydroxysuccinimidylエステルまたはイソチオシアネートを使用して、単純なアプローチであり得ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt;図1. バイオコンジュゲーションの反応スキーム。例の場合、光収穫としては、ルテニウム系アンテナ分子は、（CYS102）ルテニウム系アンテナ分子上のペンダントマレイミドと露出したシステイン残基のマイケル付加を介してシトクロムcに添付されますタンパク質上。チトクロームcの表面の赤い部分は、ヘム基を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> シトクロムcの1精製注：このステップはすべてのタンパク質には適用されません。しかし、商業的供給業者から得られたタンパク質は、さらに精製13によって除去する必要があるかもしれない他の、望ましくないタンパク質アイソフォームを含むことができることを知っておくことが重要です。 <ol><li> PRに超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム（= 120 gでモル-1 W M）を2.4g溶解20mMのNaH 2 PO 4を含む緩衝液をepare。 pH7に1 M NaOHでpHを調整します。 注意：このプロトコルで使用されるリン酸緩衝液は、毎日新たに調製し、使用前に、0.2μmのセルロース膜フィルターを通して濾過されるべきです。 </li><li> 20 mMののNaH 2 PO 4および1 M NaCl緩衝液を作るために、塩化ナトリウムの29.22グラム（ ワット M = 58.44グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは）、ステップ1.6において精製のための溶出緩衝液です。 </li><li> pHが7〜20 mMリン酸緩衝液の6ミリリットルで凍結乾燥したシトクロムc（のcyt c）は 12.0ミリグラムを溶解させます。 </li><li>別々に1 Mのストック溶液を調製し、超純水を95.3μlのジチオスレイトール14.7ミリグラム（DTT、M W = 154.25グラム/モル）を溶解します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようにDTTストック溶液を、新たに調製しなければなりません。 </li><li>ピップタンパク質溶液に1 M DTT溶液60μlのETTEは、チトクロームcを低減することができます。溶液の色は混合時に光赤に暗赤色に変わります。 </li><li>任意のクロマトグラフィー媒体に注入する前に、0.22μmの低タンパク質結合PVDFシリンジフィルターに通して減少したタンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li>注入ループと高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）装置の紫外可視検出器との間に3.3ミリリットルの強い陽イオン交換カラムを取り付けます。 </li><li> 1ml /分の流速を用いて、20mMのpH7のリン酸緩衝液の3カラム体積、続いて超純水の3カラム容量でカラムを平衡化。 </li><li>注入ループへの負荷減少粗チトクロームcの1ミリリットルを、そして328から勾配法開始- 5カラム容量を超える450のNaClを、。紫外可視検出器の280 nmおよび410 nmのチャネルを監視し、最大ピークを収集します。 </li><li> ISO-2チトクロムを溶出するために2カラム体積のために1 Mに塩濃度を増加させますE cおよびカラムをフラッシュした後、次の粗アリコートを注入する前に、リン酸緩衝液を20mMの2カラム容量でカラムを再平衡化。 </li><li>すべての粗タンパク質が精製されている繰り返して、1.9から1.10を繰り返します。 </li><li>プールイソ-1画分を含有し、それらは3.5 kDaの分子量カットオフ（MWCO）スピンフィルターを使用し、3000×gで遠心分離集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮タンパク質をロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li> 、10μLを取って超純水で100μlにそれを希釈し、吸光度スペクトルを取ることにより、純粋な濃縮タンパク質溶液の濃度を決定します。少量を使用し、100μlの石英キュベットは、タンパク質吸収スペクトルを得ました。 100μM - 一般的に、希釈していないタンパク質濃度は50程度です。 <ol><li> concentratioを定量化するためのcyt cの特性410 nmのピークを使用しますnは97.6センチメートル-1 mMの-1のモル吸光係数の値とランベルト・ベールの法則を使用して： A =ε×C×ι Aは吸光度であり、εはモル吸光係数は、cはミリモルでの濃度であり、ιは、CM 13におけるキュベットの経路長です。 </li></ol></li><li>この時点で、1mLのアリコートにタンパク質を分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 CYT cは凍結し、解凍した構造または機能を失うことなく、しかし、繰り返しサイクルは、タンパク質を変性し始めることができます。 注：タンパク質は、異なる程度に凍結耐えます。例えば、緑色蛍光タンパク質5,9の代わりに冷蔵庫に保存し、凍結されるべきではありません。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの2合成<ol><li>ルテニウムの0.9 mgのディゾルブ（II）bisterpyridine maleimIDEルテニウム（Ru（II）（TPY）2 -マレイミド、0.975マイクロモル、6当量）のアセトニトリル600μlのインチ 注：使用マレイミドは水溶性である場合、水の代わりに、アセトニトリル中のストック溶液を調製します。マレイミドは、反応緩衝液中で可溶性であることが重要です。ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリルは、低分子量12、多くの場合、疎水性のマレイミド反応物の溶解を助けるためにすべての一般的に使用されるアジュバントです。 </li><li> 20mMに希釈したときにEDTAが溶解するまで、典型的には（数グラムを固体水酸化ナトリウムを加えてpH 7で100 mMリン酸緩衝液および100mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、M W = 292.24グラム/モル）を含む緩衝液を調製）と、pHを7に調整します。 </li><li> 10mMのストック溶液を調製し、超純水1ml中のトリスの2.87 mgの（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP 15、M W = 286.65グラム/モル）を溶解させます。このステップは、インポートされアリは、タンパク質上のシステインが完全に15を連結するマレイミドの前に低減されることを保証します。 注：この試薬は、水溶液中の酸化失活の影響を受けやすいようTCEP原液は、それぞれの反応のために新たに調製しなければなりません。 </li><li> 50ミリリットルプラスチックチューブで100 mMリン酸/ EDTAストック溶液3mlで超純水11.4ミリリットルを兼ね備えています。タンパク質およびマレイミド原液でさらに希釈すると緩衝液濃度を20mMになります。 注：標識されたタンパク質は膜貫通タンパク質である場合、適切な界面活性剤は、タンパク質を可溶化するために緩衝液に添加されていることを確認します。洗剤を使用しない場合は、膜タンパク質が徐々にマイナスの反応収率に影響を与えるであろう、沈殿ができます。すべての後続の精製工程で洗剤を使用してください。 </li><li>リン酸EDTA緩衝液に精製されたチトクロームcの0.15マイクロモル（50μM溶液3ml、1当量）を追加します。 </li><li> TCEPストックsolutの7.5μLを追加タンパク質溶液にイオン（0.075マイクロモル、0.5当量）とは、システイン酸化による二量化している可能性のあるタンパク質を減らすために5分間攪拌したままにしておきます。 注意：目的のタンパク質が容易に二量体化していない場合TCEPを追加しないでください。非還元条件下でタンパク質ゲルを実行することによってこれを確認してください。 </li><li> 24時間、室温で、暗所でのRu（II）（TPY）のcyt cの減少、緩衝溶液に2 -マレイミドのアセトニトリル溶液600μlを添加し、反応混合物の攪拌を残します。 </li><li>ろ液が透明に実行されるまで、新鮮な20mMのリン酸緩衝液で2〜​​3回繰り返し、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを用いて反応混合物を濃縮します。精製の次の段階の前に、可能な限り、反応混合物からできるだけ多くの未反応のマレイミドを削除します。 注：この時点で、粗製のバイオコンジュゲーション混合物を、暗所で、冷蔵庫で保存することができます。 CENTRにより未反応のマレイミド色素を除去することが重要です保存前の透析ifugeマレイミドのようにゆっくりと非特異的にタンパク質の表面上のリジン残基と反応することができます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの3精製<ol><li> 20mMのNaH 2 PO 4、0.5 M NaClを含む緩衝液を調製し、超純水1Lにリン酸二水素ナトリウム2.4gの塩化ナトリウムの29.22グラム溶解します。これは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）精製のためのランニングバッファーです。 </li><li>イミダゾールの17グラム（ ワット M = 68.077グラムのモル-1）を20mMのNaH 2 PO 4および0.5MのNaCl緩衝液の500ミリリットルで溶解します。これは、IMAC精製の溶出緩衝液です。 </li><li> 1 M NaOHまたはHClを用いてpH7に両方のバッファのpHを調整し、FPLCで使用する前に0.22μmの再生セルロース膜を介してそれらをフィルタリングします。 </li><li>購入したIMACカラムは、COL上にロードされた任意の金属イオンなしで出荷されているようにUMN、Niのためにカラムを準備2+ベースの超純水を3ml、100mMの酢酸ニッケル溶液3mlでカラムを洗浄することによって精製し、超純水6mLを。カラムをすぐに使用しない場合の20％エタノール3mlのを通して洗浄し、細菌の増殖を防ぐために冷蔵庫に列を格納します。 </li><li> Ni 2+を取り付け注入ループとUV-Visの検出器との間FPLCに1ミリリットルIMACカラムを-loaded。 </li><li> 20mMのリン酸の3カラム体積、0.5ml /分の流速を用いて0.5 M NaCl緩衝液でカラムを平衡化します。 </li><li>負荷のNi 2+ IMACカラム（0.22μmのシリンジフィルターで濾過）粗反応混合物100μlの。 （C -cytのRu（II））ルテニウムbisterpyridineシトクロムCのバイオコンジュゲートを溶出するために、3カラム容量にわたって0からmMの125にイミダゾール勾配が続く未反応のチトクロームcを溶出するためにランニングバッファーの3カラム容量でカラムを洗浄。 </li><li> Cを洗いますすべての粗バイオコンジュゲートを精製されるまでolumn 5カラム容量のための250 mMのイミダゾール緩衝液で、その後、20 mMのリン酸、0.5 M NaClおよび繰り返しステップ3.7でカラムを再平衡化。 </li><li>バイオコンジュゲートの画分をプールし、3,000×gで遠心分離し、3.5 kDaのMWCOスピンフィルターを使用してそれらを集中。 </li><li> 3.5 kDaのMWCO透析カセットに濃縮されたバイオコンジュゲートをロードし、水の2の変更で、超純水に対して一晩透析します。 </li><li>純粋の濃度を決定し、410 nmでISO-1シトクロムc（97.6 mMの-1 cm -1 で ）同じモル吸光値を使用して、UV-Visのことでバイオコンジュゲート液を濃縮しました。 100μM - 一般的に、バイオコンジュゲートの濃度が50程度です。 </li><li> 25μlのアリコートにバイオコンジュゲートを分割し、それらが必要とされるまで-20℃で凍結しておきます。 </li></ol> シトクロムcバイオコンジュゲートの4キャラクタリゼーション<ol><li> 抑止しますMALDI-TOF MSによるバイオコンジュゲートの質量のmination <ol><li>アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸溶液1mlにカフェー酸10mgを溶解し（80：20：0.1、v / v / v）です。 </li><li>コー​​ヒー酸溶液5μlの濃縮タンパク質溶液5μlを希釈します。 </li><li> MALDIターゲットプレート上のコーヒー酸溶液0.5μLを発見し、解決策を乾燥させます。 </li><li>スポット0.5は、このカフェー酸スポットの上にサンプル/マトリックス溶液μL、スポットが乾燥することができます。マトリックスの層の間のサンプル「サンドイッチ」にこの上にサンプルマトリックスの別の0.5μLをスポットし、乾燥させます。 </li><li>タンパク質16に適した機器の設定を使用してリニアモードで質量スペクトルを取得します。 </li></ol></li><li> ゲル電気泳動によるバイオコンジュゲートの調査 <ol><li>予混合ドデシル硫酸リチウム（LDS、pHは8.4）緩衝液（4×）トンでタンパク質試料を希釈することによって実行されるように、各タンパク質試料を10μlの準備OAウェルあたり約20μgのの最終濃度。条件を減らす必要が井戸の場合、エージェント（10倍）を低減500mMのジチオスレイトール（DTT）の1μlを添加します。 </li><li> 10分間70℃で熱サンプル。 </li><li>ゲルランニングバッファーを準備するために予混合の50mlの1M MES、1Mトリス塩基、2％SDS、20mMのEDTA（pHは7.7）の超純水950ミリリットルに商業的供給源から緩衝液混合物（20倍）を実行を追加します。 </li><li>ゲルからプラスチック製の櫛を削除し、ゲルランニングタンク内のゲルを置きます。ウェルを緩衝液で覆われているように、ゲルランニング緩衝液でタンクを埋めます。 </li><li>慎重にプレキャスト12％ビス - トリス、1ミリメートル、ロードを支援するために、長いピペットチップを用いて10ウェルのゲル上にロードしたサンプル。分析を助けるために、ゲルの中央のウェルに予備染色10タンパク質分子量マーカー（3から188キロダルトン）をロードします。 </li><li> 35分間200 Vの定電圧でゲルを実行します。 </li><li> 2時間商用クマシーブルー溶液でゲルを染色し、ultrapで洗浄48時間URE水。 </li></ol></li><li> 紫外可視分光法によるバイオコンジュゲートの純度の決意 <ol><li> Ruを5μMソリューション（II）（TPY）2 -マレイミド、イソ-1のcyt c、およびルテニウム（II）-cyt C120μlのを準備します。 </li><li> 250 nmのから650 nmまで、唯一の超純水を含む石英キュベットのベースラインスペクトルを測定します。 </li><li>キュベットは、各測定間ですすぎ、乾燥されることを保証、各成分のスペクトルを測定します。 </li><li>波長の関数としての各成分の吸光度をプロットし、そして1かどうかを決定するために、最終製品に、出発物質の線形和を比較：ルテニウム（II）（TPY）CYTのC 2 -マレイミドの1比率が反応しました。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの 12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2および...

バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 ​​（抗体）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体4,5の合成、ナノメディシン8およびシステム化学9で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド6,7に至ります。 標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学10の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M -1秒を超える-1 11いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒12の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換13を防止するために、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。 ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71496</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">dithiothreitol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">TSKgel SP-5PW</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Tosoh SP-5PW, 07161</td>
			<td>3.3 mL strong cation exchange column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">UFC900308</td>
			<td>3.5 kDa spin filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">66333</td>
			<td>3.5 kDa dialysis cassetes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ru(II) bisterpyridine maleimide</td>
			<td style="width:196px;">Lab made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>see ref (14)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">03609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">93284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">imidazole</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">nickel acetate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">244066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">AcroSep IMAC Hypercell column</td>
			<td style="width:196px;">Pall</td>
			<td style="width:151px;">via VWR: 569-1008</td>
			<td>1 mL IMAC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron cellulose membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Whatman</td>
			<td style="width:151px;">Z697958</td>
			<td>47 mm filter for buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron PVDF membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td>syringe filters for proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hydrochloric acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">84426</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">caffeic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">60018</td>
			<td>MALDI matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">91707</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC6060</td>
			<td>Coomassie blue solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0342BOX</td>
			<td>precast protein gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC5925</td>
			<td>premade protein ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0008</td>
			<td>premade gel sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0004</td>
			<td>premade gel reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>premade gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Acta FPLC</td>
			<td style="width:196px;">GE</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cary 50 Bio Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Varian-Agilent</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Milli-Q ultrapure water dispenser</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Low volume UV-Vis Cuvette</td>
			<td style="width:196px;">Hellma</td>
			<td style="width:151px;">105-201-15-40</td>
			<td>100 microliter cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

図2に示すように 、飛行質量分析（MALDI-TOF MS）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および紫外-可視（UV-Vis）で分光法のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間：バイオコンジュゲートの合成は、3つの主要な方法によって確認されます3,4。添付の小分子の質量に対応する質量の増加、および未反応のタンパ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Chemical Applications of Statistical Analyses

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38.2K ビュー.  The University of New South Wales. このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。 

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Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order to streamline synthesis by saving steps, time and material compared to conventional methods that require the introduction and removal of activating or directing groups. Therefore, the functionalization of C-H bonds is also attractive for green chemistry. Under oxidative conditions, two C-H bonds or one C-H and one heteroatom-H bond can be transformed to C-C and C-heteroatom bonds, respectively. Often these oxidative coupling reactions require synthetic oxidants, expensive catalysts or high temperatures. Here, we describe a two-step procedure to functionalize indole derivatives, more specifically tetrahydrocarbazoles, by C-H amination using only elemental oxygen as oxidant. The reaction uses the principle of C-H functionalization via Intermediate PeroxideS (CHIPS). In the first step, a hydroperoxide is generated oxidatively using visible light, a photosensitizer and elemental oxygen. In the second step, the N-nucleophile, an aniline, is introduced by Br&#248;nsted-acid catalyzed activation of the hydroperoxide leaving group. The products of the first and second step often precipitate and can be conveniently filtered off. The synthesis of a biologically active compound is shown.

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

A two-step procedure for the synthesis of pharmaceutically active indole-derivatives by C-H functionalization with anilines is described, using photo- and Br&#248;nsted acid catalysis.

中間過酸化物を介した光化学および酸触媒CH機能化による抗ウイルステトラヒドロカルバゾール誘導体の合成（チップ）

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

化学

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

官能化有機金属構造体の合成とキャラクタリゼーション

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the material with Au(III) ions. The synthesis method was derived from a sol-gel process used to produce micron-sized monosodium titanate (MST), with several key modifications, including altering reagent concentrations, omitting a particle seed step, and introducing a non-ionic surfactant to facilitate control of particle formation and growth. The resultant nMST material exhibits spherical-shaped particle morphology with a monodisperse distribution of particle diameters in the range from 100 to 150&#160;nm. The nMST material was found to have a Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area of 285 m2g-1, which is more than an order of magnitude higher than the micron-sized MST. The isoelectric point of the nMST measured 3.34 pH units, which is a pH unit lower than that measured for the micron-size MST. The nMST material was found to serve as an effective ion exchanger under weakly acidic conditions for the preparation of an Au(III)-exchange nanotitanate. In addition, the formation of the corresponding peroxotitanate was demonstrated by reaction of the nMST with hydrogen peroxide.

The surfactant mediated sol-gel synthesis of nanosized monosodium titanate is described, along with preparation of the corresponding peroxide modified material. An ion-exchange reaction with Au(III) is also presented.

ナノサイズ一ナトリウムチタン酸の合成と反応化学

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

The Synthesis of [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- Using a Metastable Sn(I) Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a sterically demanding ligand, has increased in recent years. The metastable Sn(I) halide is synthesized at&#160;&#34;outer space conditions&#34; via the preparative co-condensation technique. Thereby, the subhalide is synthesized in an oven at high temperatures, around 1,300 &#176;C, and at reduced pressure by the reaction of elemental tin with hydrogen halide gas (e.g., HCl). The subhalide (e.g., SnCl) is trapped within a matrix of an inert solvent, like toluene at -196 &#176;C. Heating the solid matrix to -78 &#176;C gives a metastable solution of the subhalide. The metastable subhalide solution is highly reactive but can be stored at -78 &#176;C for several weeks. On heating the solution to room temperature, a disproportionation reaction occurs, leading to elemental tin and the corresponding dihalide. By applying bulky ligands like Si(SiMe3)3, the intermediate metalloid cluster compounds can be trapped before complete disproportionation to elemental tin. Hence, the reaction of a metastable Sn(I)Cl solution with Li-Si(SiMe3)3 gives [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- 1 as black crystals in high yield. 1 is formed via a complex reaction sequence including salt metathesis, disproportionation, and degradation of larger clusters. Further, 1 can be analyzed by various methods like NMR or single crystal X-ray structure analysis.

The Synthesis of [Sn10SiSiMe334]2- Using a Metastable SnI Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The disproportionation reaction of a metastable Sn(I) chloride solution, obtained via the preparative co-condensation technique, is used for the synthesis of a metalloid tin cluster compound.

[Snとの合成<sub&gt; 10</sub&gt;シリコン（Si（サイム<sub&gt; 3</sub&gt;）<sub&gt; 3</sub&gt;）<sub&gt; 4</sub&gt;]<sup&gt; 2</sup<sup&gt; -</sup&gt;準安定のSn（I）の共縮技術を介して合成ハロゲン化物溶液を使用しました

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

2 &#39;末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール<em&gt; O</em&gt;チオフェンメチル修飾と環状二色性によるキャラクタリゼーション

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

アクティブな表面の成長メカニズムを介して基質結合 Au ナノワイヤの作製

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Au、Pd、およびソリューションに基づく還元を介して Pt エアロゲルの迅速合成法

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

アセトニ トリル中で環境に優しい転移エステルを介してエステルの合成

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock copolymers are produced by one of three techniques: thin film rehydration, solvent switching or polymerization-induced self-assembly, and produce only flexible, polydisperse cylinders. Crystallization-driven self-assembly (CDSA) is a method which can produce cylinders with these properties, by stabilizing structures of a lower curvature due to the formation of a crystalline core. However, the living polymerization techniques by which most core-forming blocks are formed are not trivial processes and the CDSA process may yield unsatisfactory results if carried out incorrectly. Here, the synthesis of cylindrical nanoparticles from simple reagents is shown. The drying and purification of reagents prior to a ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone catalyzed by diphenyl phosphate is described. This polymer is then chain extended by methyl methacrylate (MMA) followed by N,N-dimethyl acrylamide (DMA) using reversible addition&#8722;fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, affording a triblock copolymer that can undergo CDSA in ethanol. The living CDSA process is outlined, the results of which yield cylindrical nanoparticles up to 500 nm in length and a length dispersity as low as 1.05. It is anticipated that these protocols will allow others to produce cylindrical nanostructures and elevate the field of CDSA in the future.

Crystallization-driven self-assembly (CDSA) displays the unique ability to fabricate cylindrical nanostructures of narrow length distributions. The organocatalyzed ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone and subsequent chain extensions of methyl methacrylate and N,N-dimethyl acrylamide are demonstrated. A living CDSA protocol that produces monodisperse cylinders up to 500 nm in length is outlined.

生分解性ブロック共重合体の結晶化駆動自己組織化による単分散円筒ナノ粒子の合成

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...