Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Minist&#232;re de l'&#233;ducation, de l'Enseignement sup&#233;rieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Qu&#233;bec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the R&#233;seau Qu&#233;b&#233;cois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Sant&#233;, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient&#236;fico e Tecnol&#242;gico (CNPq) and the Programme de bourses d'excellence pour &#233;tudiants &#233;trangers MEESR-FRQNT.

胎盤は、インフォ患者の同意と倫理委員会（CHUMサンリュック病院とINRS-研究所アルマン-フラピエの承認を得て、直ちにCHUMサンリュック病院、モントリオール、QC、カナダでの合併症のない妊娠からの自発的な膣分娩後に得ましたラバル、QC、カナダ）。 絨毛細胞栄養芽層細胞の1単離および精製<ol><li>ソリューションとメディア<ol><li> 4℃で1％の体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸塩）とストアを含むダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（DMEM-HG）を補完することにより、トランスポートメディアを準備します。 </li><li> 10％ 体積/体積のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM-HGを補充することにより一次培地を調製し、25 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1％ 体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlのペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸ナトリウム）し、4℃で保存します。 37°Cの前にウォームメディアつかいます。 </li><li>生理食塩水（0.9％重量/容量の塩化ナトリウム）の4 Lを準備します。 </li><li> 1×HBSS（pH7.4）中に25mMのHEPESを添加することによって改変ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を準備します。 </li><li>修正されたHBSS（1.1.4で調製した）で消化溶液、硫酸マグネシウム（MgSO 4）、塩化カルシウム（CaCl 2）、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼIV（DNアーゼIV）、および1％ 容量/容量の抗生物質（新鮮な4つのボトルを準備10,000単位/ mlのペニシリンG、100ミリグラム/ mlストレプトマイシン硫酸塩） を表1に示します。 </li><li>密度遠心分離メディア勾配を準備<ol><li> 10％の体積/体積 HBSS 10倍で密度遠心分離培地を補充することによって密度遠心分離培地溶液を準備します。 </li><li>密度遠心分離培地溶液で14アッセイチューブを準備し、 表2に記載されているように、HBSSを変更しました。 </li><li>精力的にグラデーションにその内容を追加する前に、各濃度の溶液（ステップ1.1.6.2）を混ぜます。優しく最高濃度（70％）で始まる、蠕動ポンプ（1ml /分）を有する50mLのガラス遠心管に濃度溶液を加えます。勾配の各層の適切な分離を維持するために、管壁に対するソリューションを排出することによって液滴を避けてください。 <ol><li>蠕動ポンプの非存在下では、パスツールピペットで非常に優しく層を適用します。 </li></ol></li></ol></li><li> 2％ 容量/抗真菌体積抗生物質/（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlで硫酸ストレプトマイシン）で（材料の表を参照）ランニング緩衝液を補充することにより、最終的なランニングバッファーを準備します。 4℃で保存。 </li></ol></li><li>絨毛細胞栄養芽層の分離 注意：使用無菌手術用機器、ガラス製品、ピペット、フラスコなど <ol><li>絨毛細胞栄養芽層の分離の日に、37℃の水浴中で、及びFBS 70mlを（ステップ1.1.5）からの消化液を温めます。注：FBSの使用50mlを消化し、遮断します一度解凍した氷の上に置くことができる凍結工程（1.2.22）用の20ミリリットルを残り。 </li><li>出産後、できるだけ速やかに（ステップ1.1.1から）氷冷輸送媒体で実験室に（1時間未満）の胎盤をもたらします。 </li><li>液体ゴミ箱に輸送媒体と胎盤血を捨てます。胎盤の重量を測定し、冷生理食塩水に浸します。 </li><li>測定し、以下の機能解析：臍帯の長さを、臍帯ローカライズ;胎盤長さ、幅、形状（楕円形、円盤状）。膜の色;子葉構造病理。注：データは、結果セクションに提示されています。 </li><li> （コードの周りに追加の半径1cmの円とそのベースで、 すなわち ）その胎盤の挿入と一緒にへその緒を切ります。後で組織学的分析のために、組織学的、組織固定溶液（ホルマリンの10％）300mlに浸します。 </li><li> 5×5×5cmの立方体に全体胎盤をカット。生理食塩水ゾル中に完全に（4倍X〜1分）洗浄ution（0.9％）食塩水が透明になるまで、血液細胞を除去します。リンス液は捨ててください。 </li><li>時計皿では、血管や石灰化を除去するために胎盤膜およびミンチ組織を削除します。鉗子でしっかりと血管を持ち、Metzenbaumはさみバックを使用して組織を削除します。 <ol><li>ブフナー漏斗でみじん切り胎盤を置きます。生理食塩水緩衝液の約100ミリリットルですすいでください。細分化した組織の35グラムが得られる（プラスチック計量ボートとスケールを使用） - 30までミンチ続けます。 35グラムの準備 - 必要に応じて、3つの追加30まで得ることが胎盤の残りの部分をミンチ。この間、氷の上に秤量ボートにみじん切りの組織を置きます。 注：このステップは1時間に約45分かかります。 </li></ol></li><li>トリプシン処理フラスコに35グラムみじん切り胎盤組織 - 30を追加します。トリプシン処理フラスコに調製した消化溶液1（ 表1）の150ミリリットルを移し、よく混ぜます。 </li><li>でトリプシン処理フラスコを置きますこれ以上50未満サイクル/分の速度で30分間水浴を振って、手動で均質な消化のために5分ごとにトリプシン処理フラスコを混ぜます。 </li><li>最初の消化の終わりに、水浴からトリプシン処理フラスコを削除し、胎盤組織を沈降するために1分間それ（45°）を傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、上清の約80ミリリットルを除去し、廃棄します。組織を吸引することは避けてください。 </li><li>トリプシン処理フラスコに消化溶液2（ 表1）100mlのを転送します。よく混ぜ、ステップ1.2.9を繰り返します。 </li><li>第二の消化の終了時に、水槽からトリプシン処理フラスコを取り外し、1分間それを45°傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、80ミリリットルの上清を除去し、静かにセルストレーナー（100μmのメッシュ）で遠心分離管に移します。 FBSの2ミリリットルの遠心分離管がいっぱいになるたびに入ったビーカーに濾過した上清を転送します。 </li><li>記載したように、第3の消化を行います第二の消化（1.2.11および1.2.12）並行して75ミリリットル消化溶液3を用いて、消化2用の1.2.16.1にステップ1.2.15を実行します。 </li><li>消化溶液4（75ミリリットル）を用いた第3の消化とまったく同じように第四の消化を実行しますが、上清の最大量を収集します。消化3並列に1.2.16.1に、手順1.2.15を実行し、そして最終的に消化4。 </li><li> （消化2、3から4）上清13.5ミリリットルの部分に、1 15ミリリットル遠心管に各部分を等分。 22.8センチメートル長いガラスパスツールピペットで、非常に静かに、ゆっくりと別のレイヤーを作成するために、各チューブの底にFBSの1.5ミリリットルを配置します。 FBSおよび上清を混在させないでください。室温で1250×gで20分間ブレーキなしのチューブを遠心。 注： 図1に示すように遠心分離した後、4つの層は、チューブ内に表示されているトリプシンおよび栄養膜細胞の分離は、過剰な細胞消化を回避します。 </li><li>真空ポンプ、aspirと食べたし、上清（消化液）と2層の間に白っぽい膜を含むFBS層を捨てます。温かい細胞培養培地1ml（; NO FBSなしHEPESとステップ1.1.2）と（トロホブラストと赤血球​​層）ペレットを再懸濁します。 <ol><li>すべてのチューブから再懸濁した細胞を収集し、1チューブでそれらを組み合わせます。チューブはすべて消化の終わりまで室温で放置します。注：すべて消化した後、通常の収量は再懸濁された細胞（消化あたり1）の3つのチューブです。 </li></ol></li><li>暖かい細胞培養培地で15ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で10分間、1250×gで遠心分離します。真空ポンプで上清を取り除きます。ペレットを吸引しないでください。 </li><li>優しく暖かい細胞培養培地の1ミリリットルで3つの管から得られたペレットを再懸濁します。 1チューブでその内容をプール。 8ミリリットルを得るためには、温かみの細胞培養培地でボリュームを完了します。 </li><li>非常に静かに分離卒業生に細胞懸濁液をレイヤーパスツールピペットでient。室温で507×gで30分間ブレーキなしで遠心します。 </li><li>遠心分離した後、バックライトでの勾配で細胞の異なる層を識別します。密度遠心分離培地の50％ - 層栄養膜を含むと40の間の細胞の混入を探します。真空ポンプで、上位層（&gt; 50％）を取り外します。 </li><li>パスツールピペットで関心のある層に位置して細胞を回収し、50mlの遠心管に移します。細胞培養培地で50ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で1250×gで10分間遠心します。 </li><li>無菌条件下で、上清を捨て、FBS 20mlでペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。氷の上で、無菌ジメチルスルホキシド（DMSO）の2.22ミリリットルを追加し、反転させる穏やかに混合します。極低温バイアルへの細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、-80℃で一晩凍結し、液体窒素タンクに移します。 </li></ol></li> &lt;LI&gt;栄養膜精製<ol><li>製造元の指示に従ってすすぎとバッファを実行し、磁気浄化機器の新しいフィルターカラムを取り付けます。負の1、正1と正の2ポートをきれいにしてから、製造元の指示に従って、各ポートの下に50ミリリットルチューブを紹介する「クリーンプログラム」を実行します。 </li><li> 37℃の水浴中で迅速ステップ1.2.22で凍結した細胞を解凍。冷たいランニング緩衝液の20ミリリットルと穏やかに50ミリリットルチューブを再懸濁細胞に細胞を移します。 450×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。 </li><li>上清を捨てます。冷たいランニング緩衝液で洗浄ステップを繰り返します。生存率を測定する血球計数器を用いて細胞を数えます。遠心分離を繰り返して（5分、4℃で450×gでの場合）。上清を注意深く取り除きます。抗HLA-ABC抗体をマウスの1％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlを追加します。 4℃で30分間インキュベートし、ミクシィ静かに5分ごとにngの。 </li><li>冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、このステップを繰り返します。抗マウス二次抗体結合磁気ビーズの10％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlで再懸濁細胞。静かに5分ごとに混合、15分間4℃でインキュベートします。 </li><li>冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。 5ミリリットルの冷ランニングバッファーで上清と再懸濁を捨てます。 </li><li>磁気精製装置を用いて栄養膜細胞を分離します。負のポートで細胞を回収し、冷ランニングバッファーの20ミリリットルを追加します。 注：栄養膜細胞は複雑なHLA-ABCが含まれていない、したがって、他の細胞型から分離し、負の1ポートに向けられています。 </li><li> 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、ゆっくりと20ミリリットル暖かい初代培養培地で細胞を再懸濁します。 usin細胞を数えますGAの血球計数器は、生存率を決定します。 </li><li>プレート以下の密度で細胞：0.15×10 6細胞/ウェルで96ウェルプレート、1.6×10 6細胞/ウェルで24ウェルプレートおよび4.5×10 6細胞/ウェルで6ウェルプレート。 37℃で、5％CO 2でプレートをインキュベートします。 </li><li>および/ ​​または18を免疫細胞化学により16,17フローサイトメトリーによって栄養膜細胞の純度を確認してください。 注：免疫精製細胞の純度は、サイトケラチン7およびビメンチン17-19に対するFITC結合モノクローナル抗体を用いて決定しました。このプロトコルは、。Lanoixらにも詳述されている2008年7。 </li><li>少なくとも4時間後、未付着細胞を除去した後、8％O 2（ 図2およびセクション2を参照）で構成されて正常酸素室にプレートを転送するために温かい培地で細胞を2回洗浄します。 </li></ol></li></ol> 2.インビトロ Inductio酸素正常状態のnおよび低酸素/再酸素化<ol><li>インキュベータ室操作（セット・アップするための図2Aを参照）。 <ol><li>層流フード中で、乾燥を避けるために、インキュベーターチャンバーの底に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。その後、チャンバーの優れた棚の上に先に調製した細胞培養プレートまたはフラスコ（ステップ1.3.10）を配置。 </li><li>フード外、ガスホース（ 図2A：図5a、b及びc）にチャンバー（入口ポート）を取り付けたガス（8％O 2または0.5％O 2）のチューブに到達する（ 図2A：7）。チャンバーの両方の入口および出口ポートを開きます。このとき、ガスレギュレータ（ 図2（a）は ：4）閉じたままにする必要があります。 </li><li>注意深くガス調整弁を開き（ 図2A：4）。完全にチャンバ内の空気を置換する25リットル/分の空気流で4分間のフラッシュ。 </li><li>チャンバーをフラッシュした後、次に入口をガスレギュレータを閉じ、OUチャンバーのtletポート。 </li><li>流量計の出口ホース（ 図2A：5C）抜い室の入口ポートからの37℃で細胞培養インキュベーター内でチャンバを置きます。 </li><li>ステップ2.1.3の後にガス1時間でチャンバーを充填することにより、培養培地中で、現在のプレート、フラスコ内に存在し、溶存空気を交換してください。 </li><li>繰り返して、他のガス組成のために2.1.6に2.1.1ステップ（ 例えば 、妊娠初期の栄養膜培養の9のための2％のO 2）。 </li></ol></li><li>酸素の割合（ 図2B-C）を確認<ol><li>チャンバ内（細胞なし）の細胞培養培地中の酸素の濃度を確認するために、酸素のアダプタに接続された酸素電極を使用します。電圧計に酸素電極を接続します。 </li><li>既知の酸素含有量（ 例えば 、0％でのガスの溶液を曝露することによって、同じ溶液（ すなわち 、細胞培養培地）で検量線を作成し21％酸素）。測定値は各濃度について安定化された後、チャンバー内の媒体中に電極を導入します。 注：酸素濃度10内の任意の偏りを回避するために、同じ深さですべての測定を行います。 </li></ol></li><li>栄養芽細胞で正常酸素および低酸素/再酸素化の誘導。 <ol><li>適切な細胞培養フラスコ、プレートまたはペトリ皿に一次栄養膜細胞を追加した後、必要に応じて治療を行います。 </li><li>並行して、チャンバ内に、特定の条件ごとに24時間（ 図3）を再生するために所望のガス混合物に細胞をさらします。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

哺乳類では、胎児の発育が十分な胎盤機能に直接依存しています。健康障害の発生起源は、その後の人生で明らかに病気の原因は早期開発に胎盤が胎児プログラミング30-32で機構的な役割を持っていることをさかのぼることができ仮説に基づいています。胎盤は胎児の成長と発展の重要なメディエーターである：それは、栄養移動を規制する有害な暴露から保護し、主要な内分泌機能...

ヒト妊娠全体にわたって、単核幹細胞である胎盤栄養膜細胞は、急速に増殖し絨毛またはextravillous細胞栄養芽層細胞のいずれかに分化します。 Extravillous細胞栄養芽層が侵入し、子宮壁のらせん動脈を改造します。絨毛細胞栄養層は、他の一方で、多核合胞体（シンシチウム）1を形成するために、増殖し分化し、ヒューズを続けます。絨毛栄養膜の恒常性の維持は、胎児の幸福と健康な妊娠のために不可欠です。実際には、絨毛栄養膜は、酸素と栄養素の母体胎児の交換を可能にし、妊娠に不可欠なホルモンを産生します。また、合胞体栄養細胞は、母体の血液循環と直接接触している唯一の細胞型であり、本質的な物理的および免疫学的障壁を提供します。したがって、合胞体栄養細胞は恒常性維持のため、アポトーシスおよび交換を受けなければならないとAVOしますID胎盤病理2-5。 Kliman らによって開発された技術。1986年の6個のヒト胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離するためには、絨毛栄養膜分化に関与する分子メカニズムの研究を可能にすることによって、胎盤の研究に革命をもたらしました。密度遠心分離メディア（ポリビニルピロリドン、またはパーコールによってコーティングされたコロイダルシリカ粒子）で分離に続いてトリプシンおよびDNアーゼによる逐次酵素消化に基づいて、この古典的な技術は、現在、絨毛栄養膜細胞を単離するためのゴールドスタンダードとして認識されています。技術は、磁気免疫精製、これらの細胞の表面上の特異的抗原の示差発現に基づいて、非栄養膜細胞から絨毛細胞栄養芽層を分離する手順によって最適化することができます。私たちは、原因絨毛細胞membran上のその発現の欠如にヒト白血球抗原ABC（HLA-ABC）を選びました電子7,8。 胎盤は、妊娠中の酸素レベルの劇的な変化を受ける器官です。妊娠初期では、酸素の比は、第二及び第三のトリメスターに生理学的に非常に低い（2％O 2）が、酸素の穏やかなレベルに増加する（8％O 2）です。 Tuuli ら 9は、胎盤絨毛内部の栄養膜環境のin vitroでの再生が酸素化レベルでの挑戦とばらつきがあっても表現型の変化につながる可能性があることを説明しました。したがって、妊娠8,9の第三期中の胎盤絨毛に見られる酸素分圧を模倣するために正常酸素として8％の酸素を採用することが示唆されます。 Chenら 10は、広く栄養膜細胞培養における酸素分圧に関連するいくつかの変数を検討し、細胞周囲環境の酸素レベルを決定することの重要性を実証しました。絨毛中の酸素の濃度が増加する傾向にあります脈管形成に起因します。常に胎盤絨毛増加の血流および過酸化水素（豊富な反応性酸素種）のレベルは、脈管11,12を制御する重要な信号です。妊娠合併症、脈管形成の欠如は、低酸素状態を生成し、そしてより重要なことには、酸素の間欠的な変形は、（低酸素/再酸素化と呼ばれます）。これらの条件は、胎盤と胎児の生存率13,14を損なう酸化ストレスの異常な増加につながります。次のように栄養膜細胞が低酸素/再酸素化のエピソードの間に生体内で受ける改変は、in vitroで模倣することができる。彼らは合胞体栄養細胞に分化するまで、絨毛細胞栄養層は、酸素正常状態（8％O 2）下に維持されています。次いで、それらを酸素正常状態（再酸素化）の追加の18時間、続いて4時間、低酸素条件（0.5％O 2）に供されます。この低酸素/再酸素化のアプローチを使用して、元のトロホブラスト特定の妊娠合併症で観察されているように、調節解除酸化還元状態と内因性アポトーシス8のレベルの増加をhibit。したがって、これは胎盤性低酸素症/再酸素化に関連した妊娠合併症に対処するために新たな予防・治療法を評価するインビトロモデルに有用です。 胎盤細胞は、例えば、酸化ストレスおよび胎盤機能不全15を回避する能力など、いくつかの重要な機能を有し、メラトニンを生成します。ここで、我々は、分子細胞および機能レベル8で胎盤栄養膜細胞におけるメラトニンの保護効果を実証するために使用される実験的なアプローチとセルモデルを提示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved Metzenbaum Scissors</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>9212</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps Fine 41/2in</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 4.5 Str Dissection</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-940</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponge 10cm X 10cm</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>361020733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oblong Glass Baking Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1105397</td>
			<td>Glassware (2.8L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel Buchner&#160;</td>
			<td>Coorstek Inc</td>
			<td>10-356E</td>
			<td>Glassware (114MM DIAMeter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch Glass&#160;</td>
			<td>pyrex</td>
			<td>9985100EMD</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>histological tissue fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsinizing Flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>355395</td>
			<td>Glassware (1 unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>73750-13100</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm)&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>K63B1367820C</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Ml Glass Beakers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>KFS14005250</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottles With Cap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>KFS14395250</td>
			<td>Glassware (8 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Ml Corex Tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8422-A</td>
			<td>(1 unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Serological Pipet</td>
			<td>Corning</td>
			<td>11415038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbant Liner</td>
			<td>Scienceware</td>
			<td>1199918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500&#160;Ml Bottles Top Filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Pore: 0,22&#160;&#181;m / medium and HBSS preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Ml Criogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Pharmacia Fine Chemicals</td>
			<td>P3 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>ABM</td>
			<td>4EKFS6CX-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>EC231-598-3</td>
			<td>Saline solution 0.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (Hbss)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td>Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)</td>
			<td><a name="RANGE!B29">Life Technologies</a></td>
			<td>15630-080</td>
			<td>25mL (1M) for 1L of digestion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8003</td>
			<td>9,888U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease Type Iv</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-104-159-001</td>
			<td>402,000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2500-01</td>
			<td>800mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10564-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Sulphate</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td>&#160;Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>42383-0010</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Magnetic Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Model 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs&#160;Columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Rinsing Solution&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-9983-82</td>
			<td>anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Igg Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130048401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 6 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3335</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 24 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 96 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3300</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Incubator Chamber&#160;</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>SFM3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Mm In-Line Filter&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6721-5010</td>
			<td>PTFE, pore: 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Regulator</td>
			<td>Pro Star</td>
			<td>PRS301233</td>
			<td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Hose Class Vi Clear 5/16&#160;</td>
			<td>Parker</td>
			<td>100-05070102</td>
			<td>3 pieces with ~ 0.5 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp</td>
			<td>Tiewraps</td>
			<td>THCSS-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoxia Gas Cylinder&#160;</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI CDOXR1U-K</td>
			<td>Size K (3rd trimester&#8216;s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoxia Gas Cylinder&#160;</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI CDOXR1U-K</td>
			<td>Size K (3rd trimester&#8216;s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Microelectrode Mi-730</td>
			<td>Microelectrodes INC</td>
			<td>84477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Adapter</td>
			<td>Microelectrodes INC</td>
			<td>3572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-hCG ELISA kit&#160;</td>
			<td>DRG internatinal</td>
			<td>EIA-4115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin ourified antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-9897</td>
			<td>Host: mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119697</td>
			<td>Host: mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&#38;L antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human primary trophoblast cell culture model to study the protective effects of melatonin against hypoxia/reoxygenation-induced disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

経膣分娩で得られた正常期間胎盤から絨毛栄養膜細胞の単離と免疫精製は、1×10 8の生細胞が得られました。胎盤は、350グラムの重量を量った円盤状の形状と透明膜で4センチ、直径19センチ、でした。いいえ子葉奇形は検出されませんでした。臍帯は傍局在と56センチメートルの長さを有していました。純度は、ビメンチンおよびサイトケラチン7マーカーを用?...

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Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.8K ビュー.  INRS-Institut Armand-Frappier. This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

発生生物学

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient utilization by avian embryos during development. Fertilized Japanese quail eggs were incubated at 37 &#176;C for 5 days and then yolk sac membranes (YSM) were collected to establish the EEC culture system. We isolated the embryonic endoderm layer from YSM, and sliced the membrane into 2 - 3 mm pieces and partially digested with collagenase before seeding in 24-well culture plates. The EECs proliferate out of the tissue and are ready for cell culture studies. We found that the EECs had typical characteristics of YSM in vivo, for example, accumulation of lipid droplets, expression of sterol O-acyltransferase and lipoprotein lipase. The partial digestion treatment significantly increased the successful rate of EEC culture. Utilizing the EECs, we demonstrated that the expression of SOAT1 was regulated by the cAMP dependent protein kinase A related pathway. This primary Japanese quail EEC culture system is a useful tool to study embryonic lipid transportation and to clarify the role of genes involved in mediating nutrient utilization in YSM during avian embryonic development.

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

ニワトリ胚組織の開発培養法

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...