Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Minist&#232;re de l'&#233;ducation, de l'Enseignement sup&#233;rieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Qu&#233;bec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the R&#233;seau Qu&#233;b&#233;cois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Sant&#233;, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient&#236;fico e Tecnol&#242;gico (CNPq) and the Programme de bourses d'excellence pour &#233;tudiants &#233;trangers MEESR-FRQNT.

태반은 정보를 환자의 동의와 윤리위원회 (CHUM - 세인트 루크 병원 INRS - 인스 티 투트 아르망 - Frappier의 승인을 즉시 미끼 - 세인트 루크 병원, 몬트리올, QC, 캐나다에서 복잡하지 않은 임신에서 자연 질식 분만 후 얻었다 라발, QC, 캐나다). 산모 Cytotrophoblast 세포의 1. 분리 및 정제 <ol><li> 솔루션 및 미디어 <ol><li> 보완하여 전송 매체를 준비 둘 베코의 이글의 중간 높은 포도당 1 % 부피 /의 부피 항생제와 (DMEM-HG) (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장 4 ℃에서 수정. </li><li> 10 % 부피 / 부피 소 태아 혈청 (FBS), 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1 % 부피 / 부피 항생제 (10,000 단위 / 가진 DMEM-HG를 보충하여 일차 배양 배지를 준비 ml의 페니실린 G 4 ° C에서 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장. 37 ° C에 따뜻한 미디어 전용도. </li><li> 생리 식염수 (0.9 % 중량 / 부피의 염화나트륨)의 4 L를 준비한다. </li><li> HBSS (PH 7.4) 1x에서 25 mM의 HEPES를 추가하여 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 수정 준비합니다. </li><li> (변성 (1.1.4에서 제조) HBSS, 황산 마그네슘 (MgSO4로), 염화칼슘 (CaCl2를) 트립신, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제의 IV (DNase의 4) 및 1 % 부피 / 부피 항생제 분해 용액 신선 네병 준비 표 1에 나타낸 바와 같이 10,000 단위 / ㎖ 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트). </li><li> 밀도 원심 분리 미디어 구배를 준비 <ol><li> 10 % 부피 /의 부피 HBSS 10 배와 밀도 원심 분리 미디어를 보완하여 밀도 원심 분리 미디어 솔루션을 준비합니다. </li><li> 표 2에 기재된 바와 같이, 밀도 원심 미디어 용액 변성 HBSS 14 분석 튜브를 준비한다. </li><li> 적극적으로 그라데이션에 내용을 추가하기 전에 각각의 밀도 솔루션 (단계 1.1.6.2)를 섞는다. 부드럽게가장 높은 농도 (70 %)을 시작으로 연동 펌프 (1 ㎖ / 분)을 50 ㎖의 유리 원심 관에 밀도 솔루션을 추가한다. 구배의 각 층의 적절한 거리를 유지하기 관벽 용액을 배출하여 물방울을 피한다. <ol><li> 연동 펌프의 부재에서, 파스퇴르 피펫으로 매우 부드럽게 층을 적용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 실행중인 버퍼를 보완하여 최종 실행 버퍼를 준비 (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트), 항진균제 2 % 부피 / 부피 항생제 /과 (재료의 표 참조). 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 융모 cytotrophoblast 분리 참고 : 사용 무균 수술 장비, 유리, 피펫, 플라스크 등 <ol><li> 융모 cytotrophoblast 분리 날에, 37 ℃의 수욕 및 FBS 70 ㎖ (단계 1.1.5에서)를 digestions 용액을 가온. 주 : FBS 50ml의 사용은 digestions 및 인터럽트 할일단 해동 얼음에 배치 할 수있는 냉동 공정 (1.2.22) 20 ml의 나머지. </li><li> 전달 후, 수 (이하, 1 시간) 빨리 (1.1.1)에서 빙냉 전송 매체에 실험실 태반을 가져온다. </li><li> 취소 전송 매체 및 액체 쓰레기통에 태반 혈액. 태반의 무게를 차가운 생리 식염수에 담가. </li><li> 측정하고 다음과 같은 기능 분석 : 탯줄의 길이; 탯줄 현지화; 태반 길이, 폭, 모양 (타원형 원반 모양); 막 색상; 떡잎 구조 병변. 주 : 데이터는 결과 섹션에 표시됩니다. </li><li> (코드 주위에 추가 1cm 반경 원과의 기지에서, 즉)의 태반 삽입과 함께 탯줄을 잘라. 이상 조직 학적 분석 학적 조직 고정액 수용액 (포르말린 10 %) 300 ㎖에 담근다. </li><li> 5 × 5 × 5cm의 큐브로 전체 태반을 잘라. 식염수 졸 (4 시간 X ~ 1 분) 철저하게 세척생리 식염수가 선명해질 때까지의 ution (0.9 %)는 혈액 세포를 제거한다. 액체를 씻어 버리십시오. </li><li> 시계 유리, 혈관 석회화를 제거하는 태반 막과 말하다 조직을 제거합니다. 집게로 단단히 혈관을 잡고 Metzenbaum 가위의 뒷면을 사용하여 조직을 제거합니다. <ol><li> 흡인 여과기에 다진 태반을 놓습니다. 식염수 버퍼의 약 100 ㎖로 씻어. 다진 조직의 35g (보트와 규모 무게 사용 플라스틱)를 얻을 수있다 - (30)가 될 때까지 닦지 계속합니다. 35g 제제 - 필요한 경우, 추가로 30 세까지 얻었다 태반의 나머지 말하다. 이 시간 동안 얼음에 무게 보트에 다진 조직을했습니다. 참고 :이 단계는 1 시간에 약 45 분 소요됩니다. </li></ol></li><li> trypsinizing 플라스크에 35g 다진 태반 조직 - 30를 추가합니다. 전송 150 trypsinizing 플라스크에 준비된 소화 용액 1 (표 1)의 용액과 잘 혼합한다. </li><li> 에 trypsinizing 플라스크를 배치무 50 사이클 / 분의 속도로 30 분 동안 수욕 진탕 수동 trypsinizing 플라스크를 균일 소화 매 5 분 동안 혼합한다. </li><li> 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 플라스크를 분리하고 태반 조직을 1 분 침강 대 (45)를 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로 제거하고 상층 액의 약 80 ml의 폐기합니다. 조직을 흡입하지 마십시오. </li><li> 전송합니다 trypsinizing 플라스크 소화 용액을 100㎖의 2 (표 1); 잘 혼합 단계 1.2.9를 반복합니다. </li><li> 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 형틀을 제거하고 1 분 정도 45 ° 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로, 80 ml의 상층 액을 제거하고 부드럽게 셀 스트레이너 (100 μm의 메쉬)와 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. FBS 2 ㎖ 원심 분리 튜브가 가득마다 들어있는 비이커에 여과하여 상층 액을 이동. </li><li> 기술 한 바와 같이 제 소화를 수행병행하여 75 ml의 소화 용액 (3)을 사용하여 초 소화 (1.2.11 및 1.2.12)은, 소화 2 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행합니다. </li><li> 소화 용액 (4) (75 ㎖)를 사용하여 제 소화 정확히 제 소화를 수행하지만, 상등액의 최대 양을 수집한다. 소화 3 병렬 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행하고, 마지막으로 소화 4. </li><li> 제 (digestions이 3 내지 4), 13.5 mL의 상층 액 부분으로 한 15 mL의 원심 분리 튜브에 나누어지는 각 부품. 22.8 cm 길이 유리 파스퇴르 피펫으로 아주 부드럽게 천천히 개별 층을 생성하기 위해 각 튜브의 하단 FBS 1.5 ㎖에 놓는다. FBS와 상층 액을 혼합하지 마십시오. 실온에서 1,250 × g으로 20 분 동안 브레이크없이 튜브를 원심 분리기. 참고도 1에 나타낸 바와 같이 원심 분리 후에, 4 층의 튜브를 볼 수 트립신 및 영양막 세포의 분리 과도한 세포 분해를 피한다.. </li><li> 진공 펌프와 aspir먹고 두 층 사이에 백탁 막을 포함 상청액 (분해 용액) 및 FBS 층을 버린다. 따뜻한 세포 배양 배지 1 mL를 펠렛합니다 (trophoblasts과 적혈구 층) 재현 탁한다 (단계 1.1.2 아니오 FBS없이 HEPES로). <ol><li> 모든 관에서 재 부유 세포를 수집하고 1 관에서 그들을 결합. 튜브 모든 digestions이 끝날 때까지 실온에 서 보자. 참고 : 모든 digestions 후, 보통의 수율은 재현 탁 세포 (소화 당 하나)의 3 관입니다. </li></ol></li><li> 따뜻한 세포 배양 배지 15 ml의에 볼륨을 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 1250 × g으로 원심 분리기. 진공 펌프와 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 흡입하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 따뜻한 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 개의 튜브에서 얻은 펠렛을 재현 탁. 1 관에서 자신의 콘텐츠를 풀. 8 ml의 수득 따뜻한 세포 배양 배지 부피를 완료. </li><li> 아주 부드럽게 분리 래드에 세포 현탁액 레이어파스퇴르 피펫 ient. 실온에서 507 XG에 30 분 동안 브레이크없이 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 다시 조명 기울기에 세포의 다른 레이어를 식별합니다. 밀도 원심 분리 매체의 50 % - 레이어 영양막 세포를 포함하는 40 사이에 세포 오염을 찾습니다. 진공 펌프로, 상위 계층들 (&gt; 50 %)을 제거한다. </li><li> 파스퇴르 피펫 관심 층에있는 세포를 수집하고 50 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 세포 배양 배지 50 ㎖에 볼륨을 확인합니다. 상온에서 1,250 XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 멸균 조건 하에서, 상층 액을 제거 FBS 20 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. 얼음 멸균 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 2.22 mL를 추가하고 젖혀 부드럽게 혼합한다. 저온 바이알에 세포 현탁액의 분취 량 1.5 ㎖를, -​​80 ° C에서 밤새 냉동 및 액체 질소 탱크로 옮긴다. </li></ol></li> &lt;리&gt; 영양막 세포 정화 <ol><li> 헹굼 및 실행 버퍼와 제조업체의 지침에 따라 자기 정화 장비에 새 필터 컬럼을 설치합니다. 음 1, 양 1, 양 2 포트를 청소하고 제조업체의 지침에 따라 각 포트에서 50 ml의 튜브를 소개하는 &quot;클린 프로그램&quot;을 수행합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 단계 1.2.22에 동결 된 세포를 해동. 50 ㎖의 튜브에 세포를 전송 천천히 차가운 완충액 20 ㎖로 재현 탁 셀. 450 XG에 5 분, 4 ℃로의 튜브를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 차가운 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. 생존을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심 분리를 반복합니다 (5 분, 4 ° C에서 450 XG의 경우). 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 1 % 권 / 마우스 항 - HLA-ABC 항체의 부피를 포함하는 차가운 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어, 믹시부드럽게 매 5 분 ng를. </li><li> 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고이 단계를 반복합니다. 10 % 부피 / 항 - 마우스 이차 항체 결합 된 자성 비드의 체적을 포함하는 차가운 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. 부드럽게 매 5 분을 혼합, 15 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 5 ml의 차가운 버퍼에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> 자기 정화 장비를 사용하여 영양막 세포를 분리합니다. 부정적인 포트에서 세포를 수집하고 차가운 버퍼 20 ㎖를 추가합니다. 주 : 영양막 세포는 복잡한 HLA-ABC 포함하지 않으며, 따라서 음의 1 포트쪽으로 다른 유형의 세포로부터 분리에 관한 것이다. </li><li> 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 20 ㎖ 따뜻한 차 배지에서 세포를 재현 탁. 저기서 세포를 계산조지아 혈구는 가능성을 확인합니다. </li><li> 판 다음 밀도의 세포 : 0.15 × 10 6 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트, 1.6 × 10 6 세포 / 웰에서 24 웰 플레이트 4.5 × 10 6 세포 / 웰 6 웰 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 접시를 품어. </li><li> 16, 17 계측법 및 / 또는 18 면역 세포에 의해 흐름에 의해 영양막 세포의 순도를 확인합니다. 주 : immunopurified 세포의 순도는 사이토 케라틴 -7- 멘틴 및 17-19에 대해 FITC 접합 된 모노클로 날 항체를 사용하여 측정 하였다. 이 프로토콜은 Lanoix 등의 알 잘 상세한입니다. 2008 년 7. </li><li> 적어도 4 시간 후 비 부착 세포를 제거하고 8 % O 2 (도 2, 섹션 2 참조)로 구성된다 normoxia 챔버에 플레이트를 전송하는 따뜻한 배지로 두 번 세포를 씻어. </li></ol></li></ol> 2. 체외 유도 전열Normoxia의 n 및 저산소증 / 재산 소화 <ol><li> 인큐베이터 챔버 작업 (셋업에 대한도 2A 참조). <ol><li> 층류 후드에서 건조 함을 방지하기 위해 인큐베이터 챔버의 바닥에 멸균 수를 함유하는 페트리 접시로; 그 실의 우수한 가구에 미리 제조 세포 배양 플레이트 또는 플라스크 (단계 1.3.10)을 배치했다. </li><li> 후드 이외의 가스 호스 챔버 (입구 포트) 연결 (그림 2A : 5A, B 및 C) 가스 (8 % O 2 0.5 % O 2)의 튜브에 도달하는 (그림 2A : 7). 챔버의 양쪽 입구와 출구 포트를 엽니 다. 이 때, 가스 레귤레이터 (그림 2A : 4) 폐쇄 상태를 유지해야합니다. </li><li> 조심스럽게 가스 조절 밸브를 엽니 다 (그림 2A : 4). 25 L의 공기 흐름을 4 분 동안 세척 / min으로 완전히 챔버 내부의 공기를 대체한다. </li><li> 챔버를 세척 한 후, 그 입구 및 OU를 가스 조절기를 닫고챔버의 tlet 포트. </li><li> 유량계 출구 호스 빼고 (도 2a를 : 5C) 상기 챔버의 입구로부터 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터 챔버를 배치했다. </li><li> 단계 2.1.3 후 가스를 1 시간으로 챔버를 작성하여 배지에서 현재 판, 플라스크에 존재하는 용존 공기를 교체합니다. </li><li> 를 반복하여 다른 가스 조성에 대한 2.1.6에 2.1.1 단계 (예를 들어, 2 % 임신 초기의 영양막 세포 배양 9 O 2). </li></ol></li><li> 산소 비율을 확인 (도 2B-C) <ol><li> 상기 챔버 내부 (셀)없이 세포 배양 배지 내의 산소의 농도를 확인하기 위해, 산소 어댑터에 연결된 산소 전극을 사용한다. 전압계에 산소 전극을 연결합니다. </li><li> 동일한 용액에서 검량선을 작성 (예를 들어, 세포 배양 배지) 공지의 산소 함량 (기체로 용액에 노출시킴으로써 예를 들어, 0 % 및21 % 산소). 판독은 각 농도에 대해 안정화 된 후, 챔버 내의 매질에 전극을 소개한다. 주 : 산소 농도 10 편견을 피하기 위해 동일한 깊이에서 모든 측정을 수행. </li></ol></li><li> trophoblasts에서 normoxia 및 저산소증 / 재산 소화 유도. <ol><li> 적절한 세포 배양 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시에 차 영양막 세포를 추가 한 후, 필요에 따라 치료를 수행합니다. </li><li> 병행하여, 챔버 내부 특정 조건마다 24 시간 (도 3)를 재생하기 원하는 가스 혼합물에 셀을 노출. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

포유 동물에서 태아의 발달은 적절한 태반 기능에 직접적으로 의존한다. 건강 장애의 발달 기원은 이후의 삶에서 나타난 질환의 원인은 초기 개발 및 태반 태아 프로그래밍 30-32에서 기계적 역할을하고 있음을 다시 추적 될 수 있다는 가설에 기초한다. 그것은 영양 전달을 조절 유해한 노출 방지 및 주요 내분비 기능을 가지고 : 태반은 태아의 성장과 발전의 중요한 매개체이다. Kliman ?...

인간 임신 중, 단핵 줄기 세포 인 cytotrophoblast 태반 세포는 빠르게 증식 또는 융모 extravillous cytotrophoblast 세포로 분화하거나. Extravillous cytotrophoblasts는 침략과 자궁 벽의 나선형 동맥을 개조. 융모 cytotrophoblasts 반면에, 다핵는 syncytiotrophoblast합니다 (syncytium) (1)를 형성하기 위해 증식 분화 퓨즈 계속한다. 융모 영양막 세포의 항상성의 유지 보수는 태아 웰빙과 건강한 임신을 위해 필수적이다. 사실, 융모 trophoblasts는 산소와 영양소의 모체 - 태아의 교환을 허용하고, 임신을위한 필수적인 호르몬을 생산하고 있습니다. 또한,는 syncytiotrophoblast는 모체 혈액 순환과 직접 접촉만을 셀형이며 필수적인 물리적 면역 장벽을 제공한다. 따라서,는 syncytiotrophoblast는 항상성 유지를위한 세포 사멸 및 교체를 받아야하고 AVO하기아이디 태반은 2-5 병리. 인간의 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts를 분리하기 위해 1986 년 Kliman 등. (6)에 의해 개발 된이 기술은 융모 영양막 세포의 분화에 관여하는 분자 메커니즘 연구를 허용하여 태반 연구에 혁명을 일으켰습니다. 밀도 원심 분리 미디어에서 분리 한 다음 트립신과 DNase를 순차적 효소 digestions에 따라이 고전적인 기술은, (콜로 이달 실리카 입자는 폴리 비닐 피 롤리 돈에 의해 코팅, 또는 퍼콜)는 지금 융모 cytotrophoblast 세포를 분리하기위한 황금 표준으로 인식하고 있습니다. 이 기술은 자기 immunopurification, 이들 세포의 표면에 특이 항원의 발현 차이에 기초하여 비 융모 세포 융모 cytotrophoblasts 분리 절차에 의해 최적화 될 수있다. 우리 때문에 융모 membran 세포에 발현의 부재에 사람 백혈구 항원 ABC (HLA-ABC)를 선택한전자 7, 8. 태반은 임신 중 산소 수준에 극적인 변화를 겪는다 기관이다. 임신 초기에, 산소 비율은 생리 매우 낮음 (2 % O 2) 그러나 두 번째 및 세 번째 임신에서 산소화 온화한 수준 (8 % O 2)로 증가한다. 툴리 등. (9)는 태반 융모 내부 영양막 환경 시험 관내 재생 산소화 수준의 도전 및 변형도 표현형 변화를 초래할 수 있음을 설명했다. 따라서, 임신 8,9의 세 번째 임신시 태반 융모에있는 산소 장력을 모방 normoxia로 8 % 산소를 도입하는 것을 제안한다. Chen 등. (10)는 광범위 영양막 세포 배양 산소 장력과 관련된 여러 변수를 검토하고 pericellular 환경에서의 산소 농도를 결정하는 중요성을 입증 하였다. 융모의 산소 농도가 증가하는 경향혈관 생성에 기인. 계속 태반 융모 증가 혈류량과 과산화수소의 수준 (풍부한 반응성 산소 종) 혈관 형성 (11, 12)을 제어하는 중요한 신호이다. 임신 합병증, 혈관 생성의 결핍은 저산소증, 더욱 중요한 것은, 산소 간헐적 변동 (호출 저산소증 / 재산 소화)를 생성한다. 이러한 조건은 태반과 태아의 생존 13,14 타협 산화 스트레스의 비정상적인 증가로 이어집니다. 융모 cytotrophoblasts 그들이는 syncytiotrophoblast로 분화 될 때까지 정상 산소 상태 (8 % O 2)에서 유지되는 다음과 같이 영양막 세포가 저산소증 / 재산 소화의 에피소드 중 생체 내에서 받아야 변화는 시험 관내에서 모방 할 수 있습니다. 그들은 다음 normoxia (재산 소화)의 추가 18 시간 뒤에, 4 시간 동안 저산소 조건 (0.5 % O 2)을 실시한다. 이 저산소증 / 재산 소화 방식을 사용하여, 예를 trophoblasts특정 임신 합병증에서 관찰 된 바와 같이, 하이드 록시 에틸는, 산화 환원 상태 및 고유 세포 사멸 (8)의 증가 수준을 규제 완화. 따라서, 이는 태반 저산소증 / 재산 소화와 관련 임신 합병증을 방지하기 위해 새로운 예방 및 치료 방법을 평가하기 위해 시험 관내 모델에서 유용하다. 태반 세포는 산화 스트레스와 태반 기능 부전 (15)를 미연에 방지 할 수있는 능력 등 여러 가지 중요한 기능을 가지고 멜라토닌을 생산하고 있습니다. 여기, 우리는, 분자 세포 및 기능 수준 8시 태반의 영양막 세포에서 멜라토닌의 보호 효과를 입증하는 데 사용되는 실험 방법 및 세포 모델을 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved Metzenbaum Scissors</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>9212</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps Fine 41/2in</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 4.5 Str Dissection</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-940</td>
			<td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponge 10cm X 10cm</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>361020733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oblong Glass Baking Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1105397</td>
			<td>Glassware (2.8L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel Buchner&#160;</td>
			<td>Coorstek Inc</td>
			<td>10-356E</td>
			<td>Glassware (114MM DIAMeter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch Glass&#160;</td>
			<td>pyrex</td>
			<td>9985100EMD</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>histological tissue fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsinizing Flasks</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>355395</td>
			<td>Glassware (1 unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>73750-13100</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm)&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>K63B1367820C</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Ml Glass Beakers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>KFS14005250</td>
			<td>Glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottles With Cap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>KFS14395250</td>
			<td>Glassware (8 units)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Ml Corex Tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8422-A</td>
			<td>(1 unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Serological Pipet</td>
			<td>Corning</td>
			<td>11415038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbant Liner</td>
			<td>Scienceware</td>
			<td>1199918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500&#160;Ml Bottles Top Filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Pore: 0,22&#160;&#181;m / medium and HBSS preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Ml Criogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Pharmacia Fine Chemicals</td>
			<td>P3 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>ABM</td>
			<td>4EKFS6CX-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>EC231-598-3</td>
			<td>Saline solution 0.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (Hbss)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td>Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)</td>
			<td><a name="RANGE!B29">Life Technologies</a></td>
			<td>15630-080</td>
			<td>25mL (1M) for 1L of digestion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8003</td>
			<td>9,888U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease Type Iv</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-104-159-001</td>
			<td>402,000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>100mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2500-01</td>
			<td>800mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10564-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Sulphate</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td>&#160;Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>42383-0010</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Magnetic Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Model 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs&#160;Columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automacs Rinsing Solution&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>14-9983-82</td>
			<td>anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Igg Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130048401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 6 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3335</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 24 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiple Well Plate -&#160; 96 Well With Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3300</td>
			<td>Cell Bind surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Incubator Chamber&#160;</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Flow Meter</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td>SFM3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 Mm In-Line Filter&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6721-5010</td>
			<td>PTFE, pore: 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Regulator</td>
			<td>Pro Star</td>
			<td>PRS301233</td>
			<td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Hose Class Vi Clear 5/16&#160;</td>
			<td>Parker</td>
			<td>100-05070102</td>
			<td>3 pieces with ~ 0.5 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp</td>
			<td>Tiewraps</td>
			<td>THCSS-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoxia Gas Cylinder&#160;</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI CDOXR1U-K</td>
			<td>Size K (3rd trimester&#8216;s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normoxia Gas Cylinder&#160;</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NI CDOXR1U-K</td>
			<td>Size K (3rd trimester&#8216;s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Microelectrode Mi-730</td>
			<td>Microelectrodes INC</td>
			<td>84477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Adapter</td>
			<td>Microelectrodes INC</td>
			<td>3572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-hCG ELISA kit&#160;</td>
			<td>DRG internatinal</td>
			<td>EIA-4115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin ourified antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-9897</td>
			<td>Host: mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab119697</td>
			<td>Host: mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&#38;L antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human primary trophoblast cell culture model to study the protective effects of melatonin against hypoxia/reoxygenation-induced disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

질식 분만에 의해 얻어진 일반 용어 태반에서 분리 및 융모 cytotrophoblast 세포의 immunopurification 1 × 10 8 가능한 세포를 얻었다. 태반은 350g 무게 원반 모양과 투명 막에 4cm 높이 직경 19cm였다. 더 자엽 기형은 발견되지 않았다. 탯줄은 paracentral 현지화 및 56cm의 길이를 가지고 있었다. 순도는 멘틴 및 사이토 케라틴-7 마커를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었?...

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Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.8K 조회수.  INRS-Institut Armand-Frappier. This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient utilization by avian embryos during development. Fertilized Japanese quail eggs were incubated at 37 &#176;C for 5 days and then yolk sac membranes (YSM) were collected to establish the EEC culture system. We isolated the embryonic endoderm layer from YSM, and sliced the membrane into 2 - 3 mm pieces and partially digested with collagenase before seeding in 24-well culture plates. The EECs proliferate out of the tissue and are ready for cell culture studies. We found that the EECs had typical characteristics of YSM in vivo, for example, accumulation of lipid droplets, expression of sterol O-acyltransferase and lipoprotein lipase. The partial digestion treatment significantly increased the successful rate of EEC culture. Utilizing the EECs, we demonstrated that the expression of SOAT1 was regulated by the cAMP dependent protein kinase A related pathway. This primary Japanese quail EEC culture system is a useful tool to study embryonic lipid transportation and to clarify the role of genes involved in mediating nutrient utilization in YSM during avian embryonic development.

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...