This work was supported by EPSRC Career Acceleration grant EP/J002402/1.

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシートを参照してください。このプロトコルで使用される過酸化水素は有害であり、白金に暴露された酸素ガスの発生は、爆発の危険をもたらします。過酸化物溶液（ヒュームフード）と個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣）を処理しながら、技術管理など、このプロトコル中にすべての適切な安全管理を使用してください。 1.触媒ヤヌス粒子を製造します<ol><li> スライドガラス基板を準備 <ol><li>脱イオン（DI）水、ガラス除染液とDI水で数分間ずつ、順次洗浄を使用して、未使用の標準的な顕微鏡スライドを清掃してください。エタノールのV混合物：その後70:30 Vで洗浄し、DI水、そして最後にきれいな空気/窒素気流中で乾燥吹きます。 </li><li>表面は粒子汚染の証拠からきれい、自由であることを確認するために、顕微鏡下でスライドガラスを調べます。繰り返し手順1.1。1必要に応じて。 </li></ol></li><li> 堆積のためのコロイド分散液を準備します <ol><li>ピペットのエタノール990μlのに水性株価蛍光コロイド溶液（10重量％）の10μlの。約0.1％の重量のコロイド懸濁液に到着するために使用される原液の濃度に応じて、必要に応じてボリュームを調整します。 </li><li> 10秒間ボルテックスミックス。 </li></ol></li><li> スライドガラス基板上にスピンコートコロイド分散 <ol><li>きれいなガラススライドでスピンコーターを装備。上記調製した希釈コロイド溶液の100μlをピペットチップを埋めます。 30秒間、2000回転サイクルを実行するためのプログラムスピンコーター。スピンコーターを起動し、アップが高速化するときに連続して回転スライドガラスの中央上に調製した溶液をピペット。 </li><li> 、スピンコーターからスライドガラスを取り外し、光学顕微鏡に戻り、主に非触​​れる別々のコロイドの均一な分散が中央領域Oをカバーしていることを確認スライドガラスF。 </li></ol></li><li> 真空コロイド装飾されたガラススライド上に白金金属を蒸発させます <ol><li>金属蒸発器にコロイドコーティングされたガラススライドを挿入します。コロイド装飾された側が蒸発源に直面していることを確認します。白金金属蒸着源と白金金属の堆積物は15nmをインストールします。 注意：金属蒸着後、サンプルは、不活性雰囲気下で保存する必要があります。 </li></ol></li></ol> 2.「水泳」ヤヌス粒子<ol><li> 過酸化物を含む溶液にヤヌスコロイドを再懸濁 <ol><li>レンズ組織の1×1cm角にカットし、DI水の10μlの終了を減衰させます。ピンセットで保持し、静かに（このステップは、物理的に基板からコロイドを削除）プラチナコーティングされたコロイド飾らスライドガラスの表面に沿ってこします。 </li><li> DI水1.5ミリリットルにレンズティッシュを挿入し、手動で密封されたTUで30秒間激しく振りますです。レンズ組織を削除します。 </li><li>ピペットV H 2 O 2のストック溶液/ W1 30mlのの％が充填された新たな容器に溶液を含有するコロイド1mlを、。静かに溶液を混合し、その後さらに25分間攪拌しない潜伏期間に続いて5分間、室温で超音波浴中に置きます。 注意：このソリューションは、酸素を進化させることができます。密封しないでください。 </li><li>残りの水性コロイド溶液の乾燥100μlのヤヌスコロイド構造のSEMの検証を可能にするために、走査型電子顕微鏡（SEM）スタブ上に14 </li></ol></li><li> 分析キュベットを準備 <ol><li>高速の推進を可能にするために、適切な燃料強（10％）に到達するために過酸化物と白金被覆されたコロイドを含むインキュベーション溶液に、DI水の追加の1ミリリットルを追加します。 注意：インキュベーション前のステージは、白金触媒の表面を洗浄するために高濃度燃料の濃度で行いました。 </li><li> loの塗りつぶしインキュベーション溶液でワットボリューム長方形の石英ガラスキュベット。緩くプッシュインキャップを取付け。 注意：爆発の危険 - スクリューキャップを使用しないでください。 </li></ol></li></ol> 3.顕微鏡観察<ol><li> 関心の粒子の位置を確認します <ol><li>ロード適切な目的（ 例えば、20X）を装備した蛍光顕微鏡へのキュベットおよび適切なフィルタの組み合わせ（励起450〜490 nmの発光&gt; 515 nm）を用いた蛍光体の発光を励起します。 </li><li>手動でキュベット内の蛍光コロイドを検索します。 注：過酸化物濃度を維持しながら、コロイド密度の調整が必要とされ得ます。例えば、コロイド濃度が高い場合には希釈が推奨され、およびフローを生成する多数の酸素の気泡​​が存在しています。約0.003％のコロイド体積濃度は、推奨出発点です。 </li><li> 3Dトラッキングのための光学設定を最適化：適切な照明条件の下で、私はnはコロイドは鋭い円形のオブジェクトとして表示されます焦点を当てます。推進球を中心明るいリングを変更する独特の大きさと焦点面からコロイドを移動するが、これは、zは3次元トラッキングを可能にするように調整するかを決定するために使用され、観察されます。 </li></ol></li><li> 録画映像 <ol><li>興味の粒子が焦点位置」の「粒子と、同心のリングを生成するようにビデオキャプチャを開始する前に、顕微鏡の焦点を合わせます。ビデオキャプチャ時の焦点面を移動しないでください。 </li><li>関心の粒子の録画ビデオ。詳細な軌道再構成を可能にするために30ヘルツを超えるフレームレートで30秒の映像期間を使用します。 </li></ol></li><li> 3D軌道再建 <ol><li> z軸をキャリブレーション <ol><li> 2％の重量を占めています。 60°Cに相当キュベット内の場所での蛍光ヤヌス粒子の懸濁液を含む水におけるジェランガム溶液それは、上記の使用、および固定静的コロイドを含む硬い透明なゲル状のサンプルを形成するように設定することができます。 </li><li>上記選択したのと同じ照明条件を用いて、単一の固定コロイドに焦点を当て、今、この面に対して既知の変位によって発生するZ-フォーカスなどの一連の静止画像を記録します。 </li><li>既知の各焦点位置11でリングの半径を決定します。 注：これは、静止フレーム、ビデオ最も効率的に実行されたすべてのキャリブレーションにバッチ処理として適用することができる画像解析アルゴリズムを使用することです。典型的なアプローチは、オブジェクトの中心のおおよその位置を識別するために画像、閾値を平滑化し、次いで、強度ピークのいずれかの環の面との間の距離を測定することにより、リングの中心の実際のx、y座標の位置を含みます。リングの中心から強度ピークまでの平均半径方向距離は、その後見つけることができます。11これは明るいリングANの半径の両方を可能にしますD XYは、サブピクセル精度で決定される座標。焦点面からジェランガム固定ヤヌス球30μmのX、Y、Z位置を特定することによって、画像の時系列的に、粒子は、各軸に沿って±25nmの誤差で配置することができます。エラーは、画像のノイズに起因することができます。信号対雑音比、したがっては、位置アルゴリズムの精度は、検出された蛍光光の強度に依存します。ヤヌス球が遠い焦点面から、その強度は、例えば 、それを正確に追跡するために弱くなりすぎている場合、4.8μmの直径のコロイドのために約200ミクロンのz範囲が可能です。代替の非アルゴリズム的方法は、x、yの中心と半径の単純な手動測定を使用することですが、これは精度が低下します。 </li><li> z位置に半径を関連付けるために較正曲線をプロットし、補間を可能にするために、適切な機能（ 例えば 、三次方程式）に適合します。11 </li></ol></li> &lt;李&gt; 校正のx、yの軸 <ol><li>まだ3.2で選択した同じ顕微鏡条件を用いて空間較正の目盛りの光学顕微鏡像をフレーム記録します。 </li><li>空間較正の目盛りの画像から既知の実世界のサイズを持つオブジェクトの「ピクセル」寸法を測定し、X、Y画像平面のためのミクロン変換係数にピクセルを確立するためにこれを使用しています。 </li></ol></li><li> 軌道を再構築 <ol><li> 3.3.1.3に記載されているようにx、yを変換するために、Zに半径を変換するために3.3.1.4に見出される機能、および3.3.2.2に見られる較正係数を使用して、ビデオシーケンスの各フレームのx、y座標および半径を決定しますピクセルは、ミクロンに調整します。この手順は、時間の関数としての推進粒子の位置座標に正確なX、Y、Zをもたらすであろう。11この手順は、アルゴリズムを使用して実装、または手動ですることができます。 </li><li>派生Pを決定しますこのような観測された触媒水泳の程度を定量化するための平均速度としてroperties。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

プラチナヤヌス粒子の準備のためのプロトコルには多くの変数が観測された軌道に影響を与えます。 2μmの直径の粒子を用いて説明したようなパラメータは、毎秒10ミクロンのオーダーで推進速度を与えます。より小さな粒子を使用する場合、速度が増加し、粒子径を大きくすると、推進速度を減少する一方12蒸発プロトコルの詳細も観察軌道を変化させます。この現在のプロトコルでは、コロイドのまばらな分布は、一緒にスライド方向に垂直金属蒸着で、推奨されます。これらの条件は、ブラウン回転拡散の制限内で線形軌道につながり、図2に示すように対称ヤヌス構造をもたらす。13逆に、タイトなパックされたコロイドは角度堆積をかすめるの対象となっている場合は、ヤヌスキャップの対称性を破壊することができます紡糸挙動を誘発する。14 PAここで生産rticlesはすべて3次元で比較的等方性の動きを表示します。厚い白金コーティング、またはより大きな粒子を使用する場合は、上方バイアスまたは重力走性を付与することができる。製造後ヤヌスコロイドの貯蔵の11の詳細も観察水泳速度に影響し得ます。蒸発段階から出る高表面エネルギー清浄な白金表面は、炭化水素から、特にチオール、例えば汚染表面の影響を受けやすい。15 また、ヤヌスコロイドを再懸濁された溶液の特性は、推進力を観察するために重要です。分解反応生成運動の速度が減少するように、低過酸化物濃度は、より遅い速度をもたらすであろう。6また、塩の低濃度は、推進速度の劇的な減少をもたらす。7 ここで生産コロイドの重要な特徴は、それらのねあります3Dトラッキングに適していますutral浮力、。一般的には水泳装置の分野では原因、部分的に緻密な金属から作られているいくつかの顕著な例に、3D効果にはほとんど注意を払っているそれら急速に沈殿物、16にも起因し、必要な測定を行うことに伴う困難および費用にします。いくつかの確立された3次元追跡方法の明確な欠点は、これらの急速に移動するコロイドのために存在し、例えば、共焦点走査型レーザー顕微鏡軌跡を解決するために、画像の十分な数を記録するための時間分解能が不足していることができます。この文脈において、ここで本発明の方法は、結果的に高いフレームレートを可能にするz座標の推定を可能にするために単一のフレームを必要とする重要な利点を有しています。復興だけではなく、絶対蛍光強度よりも、単一のフレーム内のピンボケコロイドの相対的なコントラストに依存しているz座標としても、それは効果を急冷し、点滅に強いですフォアインチこれらの利点は、3D軌道の再構成が可能である上に、フィールドの減少深さ、及び十分に分離された非重複コロイドの要件を犠牲にして可能です。私たちは、彼らの水泳デバイスが直接的かつ高精度で、この情報にアクセスするためのプロトコルを記述すると、3D行動に興味を持つ他の研究グループを許可することを願っています。 3Dにこれらのデバイスの理解を拡大することは興味深い将来の現象やアプリケーションの重要な範囲を開くことは明らかです。軌道分析のさらなる詳細に興味のある読者は、推進システムとどのように推進速度の正確な定量を確保するために共通の成果物を説明文献17に向けられています。

彼らは、このような薬物送達のようなエキサイティングな新しい機能を有効にする可能性を秘めているように、これらのデバイスは、3ラボオンチップトランスポートを重要な研究の関心を集めている、自律的流体環境での運動を生成することが可能な命綱をつけコロイド小規模です。1,2触媒水泳機器4および環境改善。5つ広く研究されている例は、触媒「ヤヌス」スイマーです。6これらの粒子は、（ヤヌスは2直面ローマの神である）は、2つの別個の辺、または面を有するから自分の名前を取得します。他の不活性であり、一方の側には、触媒活性および分解反応を行うことができます。適切な溶解燃料分子の存在下では、得られた非対称の化学反応は、自己diffusiophoresis /電気泳動を介して運動を生成することができるコロイドの周りに勾配を生成する。7 これらの急速に移動する物体のモーションを特徴づけることは茶です<html>これまでのllenging、多くの実験観察は、2Dに限られていました。しかし、最終的なアプリケーションが3Dでバルク・ソリューション全体を移動するための触媒水泳デバイスの能力を悪用する可能性があります。8この問題に対処するため、ここでは、決定すべき水泳デバイスの正確な3D軌道を可能にするプロトコルを記述します。この方法は、固定焦点の対物レンズ、9で観察された焦点蛍光コロイドのうちによって生成される環構造の解釈に基づいており、従来の未修正の顕微鏡を使用して適用することが容易です。明らかに、ここでこの方法を記述することにより、この分野の他の研究者は、このような3D情報にアクセスできることによって利益を得るであろう。これは水泳デバイス用の運動特性に将来の洞察を支援します。このポテンシャルの証拠は、重力によって指示されている水泳機器、最も簡単に3Dトラッキングのアプリケーションを介して可視化することができる10,11行動の最近の報告書で与えられる。11 ove_contentは &quot;&gt;また、このペーパーでは、明らかに、これらのデバイスを調査して、既存の研究グループ全体の方法を標準化し、さらに水泳デバイスを作製し、調査に興味を持って新たな研究者を導くためにさらに有益であろう触媒ヤヌス粒子水泳デバイスを製造するための方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>Evaporator</td><td>Moorfield (UK)</td><td></td><td>Minilab 80 e-beam evaporator</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse LV100</td></tr><tr><td>Fluorescence light source</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon B2A filter cube</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X, 0.45 NA</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Hellma</td><td></td><td>fused quartz, 40 x 10 x 1 mm</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>IKA</td><td></td><td>Lab Dancer S2</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies Corp.</td><td></td><td>Model WS-400BZ-6NPP/Lite</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Eumax</td><td></td><td>2 liter</td></tr><tr><td>Lens tissue</td><td>Whatman</td><td>2105 841</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30 wt%</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267171</td><td>0.25 mm, 99.99%</td></tr><tr><td>Colloids</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Fluoro-Max PS microspheres, d = 1.9&amp;nbsp;microns</td></tr><tr><td>Glass decontamination solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0025/15</td><td>Decon 90</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0600DF/17</td><td>Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>DI water</td><td>Elga</td><td></td><td>Purelab Option filtration system (15 MW)</td></tr><tr><td>Gellan gum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169-100G</td><td>&quot;Phytagel&quot;</td></tr></tbody></table>

preparation and 3d tracking of catalytic swimming devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

図1は、白金を堆積する前に、清浄なスライドガラス上のコロイドの典型的な分散を示している。 図2は、この撮影モードの下でプラチナコーティングされた領域は明るいコントラストを生成し、ヤヌススイマーコーティングされた半分のプラチナのための典型的な後方散乱SEM像を示します。希望の半球状の白金層は明らかである。3ディスプレイジェランガムで固定し、最適な照明条件の下で、一般的な蛍光ヤヌススイマーの外観図 。スイマーが対称リング機能として表示され、それが焦点位置にコロイドに対するz位置を決定するために使用することができるリングの半径である。 図4は、半径方向の輝度強度分布のための代表的な断面を示しています正確に中心とコロイドの見かけの半径を特定するために画像解析アルゴリズムと組み合わせて使用されている。 図5 </stron<html>グラム&gt;は、焦点位置から明らかなコロイドサイズと距離を関連付けるために、固定コロイドサンプルおよび較正された顕微鏡のz並進ステージを使用して得られた検量線が含まれています。この曲線は、z座標に明らかな半径を変換するために使用されるキュービック関数に取り付けられています。最後に、 図6は、蛍光ヤヌス粒子スイマーのための典型的なX、Y、Zの軌跡が表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig1.jpg" /> 図 1.9ミクロン直径のポリスチレン微小球の 1 光学像。ミクロスフェアは、白金堆積前に洗浄したガラススライド上に分散しています。スケールバーは40μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> エス/ ftp_upload / 54247 / 54247fig2.jpg &quot;/&gt; 1.9μmの直径のポリスチレン微小球の 図2 のSEM後方散乱画像。ミクロスフェアは、白金堆積後に示されています。スケールバーは2μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig3.jpg" /> ジェランガムに固定さ4.8μmの直径の蛍光ポリスチレン球の 図3. キャリブレーション画像は20Xの対物レンズ（0.4 NA）を使用して記録した。各画像の下の距離が球体上記の目的の焦点面までの距離を示しています。画像は明るいリングに明るいディスクの変更の0〜200μmでフォーカスの画像からデフォーカスしているように、半径が、そのうちのspher倍率に依存していますEサイズと焦点面からの距離。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig4.jpg" /> 図4. X、Y、Z粒子追跡手順。自己書かれたアルゴリズムのセットは、第1の垂直と水平線のシリーズを抽出し、平均半ばを見つけることによって、明るいリングの（x、y）の中心の位置を特定するために使用されます明るいピーク（a）の間のポイント。リングの半径は、その後、リング中央（B）から放射状に平均画素グレー値にスプライン嵌合しのピーク強度から算出される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図5ジェランガムで固定球の明るいリング半径を測定したヤヌス球の校正チャートをZ座標（図3と図4を参照してください）。校正チャートは、z方向に測定されたリングの半径を変換するために、当社のアルゴリズムによって使用されています座標。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig6.jpg" /> 図6 の典型的な蛍光ヤヌス球水泳装置の軌道。移動水泳装置の画像シーケンスは、33ヘルツのフレームレートで30秒間にわたって記録しました。 （X、Y、Z）の軌跡の座標は明るいリング中心を配置することによって得た（FIグレ4（a））は、シーケンス内の各画像のキャリブレーションチャートを実測リング半径を比較する（ 図4（b）及び5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

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Motion in Two or Three Dimensions

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7.6K ビュー.  University of Sheffield. A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

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Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

発生生物学

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen consumption is typically used as the criterion measurement in this regard, two metabolic breakpoints that reflect changes in the dynamics of lactate production/consumption as the work rate is increased are perhaps more relevant for endurance athletes from a functional standpoint. Exercise economy, which represents the rate of oxygen consumption relative to performance of submaximal work, is also an important parameter to measure for endurance-athlete assessment. Ramp incremental tests comprising a gradual but rapid increase in work rate until the limit of exercise tolerance is reached are useful for determining these parameters. This type of test is typically performed on a cycle ergometer or treadmill because there is a need for precision with respect to work-rate incrementation. However, athletes should be tested while performing the mode of exercise required for their sport. Consequently, swimmers are typically assessed during free-swimming incremental tests where such precision is difficult to achieve. We have recently suggested that stationary swimming against a load that is progressively increased (incremental tethered swimming) can serve as a &#34;swim ergometer&#34; by allowing sufficient precision to accommodate a gradual but rapid loading pattern that reveals the aforementioned metabolic breakpoints and exercise economy. However, the degree to which the peak rate of oxygen consumption achieved during such a protocol approximates the maximal rate that is measured during free swimming remains to be determined. In the present article, we explain how this rapidly incremented tethered-swimming protocol can be employed to assess the cardiorespiratory capacity of a swimmer. Specifically, we explain how assessment of a short-distance competitive swimmer using this protocol revealed that his rate of oxygen uptake was 30.3 and 34.8 mL&#8729;min-1&#8729;kg-1BM at his gas-exchange threshold and respiratory compensation point, respectively.

As opposed to measurement during free swimming, which presents inherent challenges and limitations, determination of important parameters of cardiorespiratory function for swimmers can be made using a more feasible and easier to administer tethered-swimming rapidly incremented protocol with gas exchange and ventilatory data collection.

スイマーの心呼吸評価のための急速に増加するテザド水泳最大プロトコル

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

生化学

3D Kinematic Gait Analysis for Preclinical Studies in Rodents

The utility of three-dimensional (3D) kinematic motion analysis systems is limited in rodents. Part of the reason for this inadequacy is the use of complex algorithms and mathematical modeling that accompany 3D data collection and analysis procedures. This work provides a simple, user-friendly, step-by-step detailed methodology for 3D kinematic gait analysis during treadmill locomotion in healthy and neurotraumatic rats using a six-camera motion capture system. Also provided are details on 1) calibration of the system in an experimental set-up customized for quadrupedal locomotion, 2) data collection for treadmill locomotion in adult rats using markers positioned on all four limbs, 3) options available for video tracking and processing, and 4) basic 3D kinematic data generation and visualization and quantification of data using the built-in data collection software. Finally, it is suggested that the utility of this motion capture system be expanded to studying a variety of motor behaviors before and after neurotrauma.

Presented here is a protocol to collect and analyze three-dimensional kinematics of quadrupedal locomotion in rodents for preclinical studies.

げっ歯類の前臨床研究のための3Dキネマティック歩行分析

The utility of three-dimensional (3D) kinematic motion analysis systems is limited in rodents. Part of the reason for this inadequacy is the use of ...

行動学

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

神経科学

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

生物工学

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Swimming Performance Assessment in Fishes

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, pollution, hypoxia and temperature. This paper describes a flexible protocol to assess fish swimming performance using equipment in which water velocity can be controlled. The protocol involves one to several stepped increases in flow speed that are intended to cause fish to fatigue. Step speeds and their duration can be set to capture swimming abilities of different physiological and ecological relevance. Most frequently step size is set to determine critical swimming velocity (Ucrit), which is intended to capture maximum sustained swimming ability. Traditionally this test has consisted of approximately ten steps each of 20 min duration. However, steps of shorter duration (e.g. 1 min) are increasingly being utilized to capture acceleration ability or burst swimming performance. Regardless of step size, swimming tests can be repeated over time to gauge individual variation and recovery ability. Endpoints related to swimming such as measures of metabolic rate, fin use, ventilation rate, and of behavior, such as the distance between schooling fish, are often included before, during and after swimming tests. Given the diversity of fish species, the number of unexplored research questions, and the importance of many species to global ecology and economic health, studies of fish swimming performance will remain popular and invaluable for the foreseeable future.

The lives of the majority of fish are predicated on swimming. This protocol describes techniques for capturing a range of swimming modes available to individual and schooling fish, and includes metrics associated with swimming physiology and behaviour.

魚類の遊泳性能評価

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, ...

生物学

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

の自動解析<em&gt; C。エレガンス</emセレストソフトウェアを使用&gt;スイム挙動

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

要約

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ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

スイマーの心呼吸評価のための急速に増加するテザド水泳最大プロトコル

げっ歯類の前臨床研究のための3Dキネマティック歩行分析

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

心筋細胞ベースのアクチュエータおよび自己安定化バイオロゴ - パート1

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

魚類の遊泳性能評価

の自動解析

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後のステントの運動性パターンの解析

触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

要約

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ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

スイマーの心呼吸評価のための急速に増加するテザド水泳最大プロトコル

げっ歯類の前臨床研究のための3Dキネマティック歩行分析

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

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魚類の遊泳性能評価

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細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後のステントの運動性パターンの解析