ステンター・コエルルスは、単細胞再生を理解するためのモデル生物として長い間用いられてきた。視覚形態学的再生のタイムラインは知られているが、機能的再生のタイムラインは不明のままである。このアッセイは、損失機能の回復を定量化できるように、同期再生を受けている中心集団の運動性を追跡する。
これは、他の細胞型との使用に適合させることができる。イメージングチャンバの安全なシールの欠如は、ウェルが互いに漏れたり、ウェルの内部に気泡が形成されたりする結果となる。シリコーンスペーサーの使用に慣れていない研究者のために、PSWまたは他のクリーン培地を各ウェルにピペットで固定して、使用前に漏れをテストすることを強くお勧めします。
サンプルチャンバーの構造は、口頭で説明するよりも簡単に示されます。取得した映像データから運動パターンを抽出する処理も同様です。まず、顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さい厚さ250マイクロメートルのシリコーンスペーサーシートをカットします。
パンチ全体を使用して円形の井戸を作成し、隣接する井戸の間に十分なスペースを残して、良好なシールを確保します。ステンターコエルラス細胞を10%スクロースまたは2%尿症で2分間インキュベートすることによって、経口装置の再生を開始する。その後、新鮮な培地で3回洗う。
各ウェルに約10個のステンターを静かにピペットで入れる。サンプル量をできるだけウェル量に近づけるように注意してください。片方の端からウェルの上にカバーガラスを静かに下げて、ウェルを閉じます。
10マイクロリットルのピペットチップなど、狭くてわずかに柔軟なものを使用して、カバーガラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、顕微鏡を利用可能な最低倍率に設定して、フレームに収まるようにします。タイムラプスを開始し、各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。
キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。2つのスクリプトをダウンロードし、セルを追跡し、トレースをコンピュータ上の覚えやすい場所にきれいにし、データビデオをこのコンピュータに転送します。
データビデオをフォルダに整理します。各タイム ポイントに 1 つずつ。スクリプトトラックセルを使用して、トラックセルを開き、スクリプトを実行することによって、データビデオの自動セルトラッキングを実行します パスに追加を選択します ポップアップウィンドウでプロンプトが表示された場合、通常はスクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。
プロンプトが表示されたら、1つ以上のデータビデオを選択して追跡を開始します。データビデオに移動し、ファイルのリストに満足したら、開くをクリックします異常または偽のトレースを手動で拒否するには、ファイルをダブルクリックしてMATLABエディタウィンドウでクリーントレースを開きます。プロンプトで、トラックセル別に出力されるデータフォルダを選択します。
作成したフォルダの1つに移動して選択します。プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースを拒否するにはゼロを入力します。次に、Enter キーを押して次のトレースに進みます。
まず、スパゲッティプロットというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ファイルブラウザウィンドウがプロンプトとともにポップアップしたら、開くフォルダを選択します。
いずれかの時点のフォルダーに移動します。キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、ミリメートルあたりのピクセル数は何ですか?キャリブレーション値を入力し、Enter キーを押します。
スクリプトの55行目(デフォルトではRRが4に等しい)を変更して、必要に応じてプロットの軸を調整します。最大4ミリメートルの半径を含むため。プロットを保存します。
結果は、口腔装置再生プロセスの2時間、3時間、7時間、および8時間におけるステンター細胞集団の集団運動性を示す。これらのプロットは、運動性個体数の予想される増加と、集団内の最も運動性細胞の範囲における4倍の増加の両方を示す。最速の遊泳セルは、端の近くで開始された場合、完全に直線で泳ぐことが制限され、その移動範囲は小さく見えます。
管細胞は、目に見えるホールドファストを有する非運動性、可視ホールドファストを有する非運動性、および可動性を有する3つの異なるカテゴリーに分類された。その結果、これらのカテゴリにわたる相対的なセル数を、再生への関数として要約した積み重ねられたヒストグラムが示されました。後に、目に見えるホールド断食を持つコロニーでかなりの数の細胞が発見され、彼らが環境を探索し、その種の他のものの近くに優先的に付着したことを強く示唆した。
約1ミリメートルのサイズであるステンターコエルルスによく働くサンプルウェル寸法を選択することが重要です。これには、直径5/16インチのシリコーンスペーサーの厚さ、およびウェルあたり10セルが含まれます。これらの数値は、このプロトコルを他の細胞型に適応させるときに調整する必要があります。
このアッセイは、RNA-Iと組み合わせて実施して、異なるステンター表現型の再生を調査および比較することができる。
