Name: preparation and 3d tracking of catalytic swimming devices
Uploaded: 2016-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
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This work was supported by EPSRC Career Acceleration grant EP/J002402/1.

ATENÇÃO: Por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança do material relevantes antes do uso. O peróxido de hidrogênio utilizado neste protocolo é prejudicial, e a evolução de gás de oxigênio quando exposto à platina representa um risco de explosão. Use todos os controles de segurança apropriados durante este protocolo, incluindo controles de engenharia ao manusear soluções de peróxido (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas e bata de laboratório). 1. Fazendo Catalytic Janus partículas <ol><li> Prepare substrato lâmina de vidro <ol><li> Limpar uma lâmina de microscópio padrão não utilizado, usando a lavagem sequencial por alguns minutos cada, em água deionizada (DI) de água, solução de descontaminação de vidro e água DI. Em seguida, lave com um 70:30 v: v mistura de etanol: água DI e, finalmente, golpe seco em uma corrente de ar / nitrogênio limpo. </li><li> Examine a lâmina de vidro sob um microscópio para verificar a superfície esteja limpa e livre de evidência de contaminação por partículas. Repita o passo 1.1.1, se necessário. </li></ol></li><li> Prepare dispersão coloidal para deposição <ol><li> Pipetar 10 ul de solução aquosa de colóide estoque fluorescente (10% em peso.) Em 990 ul de etanol. Ajuste volumes conforme necessário, dependendo da concentração da solução estoque utilizado para chegar a cerca de suspensão peso coloidal 0,1%. </li><li> mistura de vórtice durante 10 seg. </li></ol></li><li> Revestimento de spin dispersão coloidal em substrato lâmina de vidro <ol><li> Equipar um revestidor de rotação com a lâmina de vidro limpa. Encha com uma ponta de pipeta 100 uL da solução diluída coloidal preparada acima. rotação programa para executar um revestidor de 30 s, ciclo 2000 rpm. Iniciar revestidor de rotação, e quando uma velocidade continuamente até a solução preparada pipeta para o centro da lâmina de vidro de fiação. </li><li> Remover lâmina de vidro do coater rotação, retornar ao microscópio óptico e verificar se uma dispersão uniforme de colóides separadas principalmente não tocar cobre a região o centrof a lâmina de vidro. </li></ol></li><li> Vacuum evaporar metal platina em colóide decorados lâmina de vidro <ol><li> Inserir a lâmina de vidro coloidal revestido de metal para um evaporador. Verifique se o colóide decorados lado está voltado para a fonte de evaporação. Instalar uma fonte de evaporação de metal de platina e o depósito de 15 nm de platina metálica. Nota: Após a deposição de metal, as amostras devem ser armazenadas sob uma atmosfera inerte. </li></ol></li></ol> 2. &quot;Natação&quot; partículas Janus <ol><li> Re-suspender Janus Colloids numa solução contendo peróxido <ol><li> Corte um 1 x 1 centímetro quadrado do tecido da lente, e amortecer a extremidade com 10 ul de água desionizada. Segurar com uma pinça, e esfregar suavemente ao longo da superfície da lâmina de vidro decorados colóide de platina revestido (Este passo remove fisicamente colóides do substrato). </li><li> Insira o tecido lenticular, em 1,5 ml de água DI e agitar manualmente vigorosamente por 30 segundos num tu seladaestar. Remover o tecido da lente. </li><li> Pipete 1 mL de solução contendo o colóide para um novo recipiente, cheios com 1 ml de 30% w / v solução de H 2 O 2. Misturar suavemente as soluções, e, em seguida, colocar num banho de ultra-sons à temperatura ambiente durante 5 min, seguido por um outro período de incubação de 25 minutos sem agitação. ATENÇÃO: Esta solução pode evoluir de oxigênio; Não selar. </li><li> Secas 100 ul da solução coloidal aquosa restante em um microscópio eletrônico de varredura (SEM) stub para permitir a verificação SEM da estrutura coloidal Janus 14. </li></ol></li><li> Prepare cuvette análise <ol><li> Adicionar um adicional de 1 ml de água desionizada para a solução incubada contendo colóides de peróxido e de platina revestido de chegar a uma força de combustível adequada (10%) para permitir a propulsão rápida. Nota: As etapas de incubação anteriores foram realizados em concentrações mais elevadas de combustível concentração para limpar a superfície do catalisador de platina. </li><li> Encha a lovolume de w de quartzo retangular tina de vidro com a solução incubada. Vagamente encaixar uma tampa push-in. CUIDADO: Risco de explosão - não use uma tampa de rosca. </li></ol></li></ol> 3. microscópica Observação <ol><li> Localizar partícula de interesse <ol><li> Carregar a cuvete um microscópio de fluorescência equipado com uma objectiva adequado (por exemplo, 20X) e excita emissão fluoróforo utilizando uma combinação adequada de filtros (excitação 450-490 nm, emissão a&gt; 515 nm). </li><li> procurar manualmente colóides fluorescentes dentro da tina. Nota: Ajustar a densidade colóide, mantendo a concentração de peróxido pode ser necessária. Por exemplo, a diluição é recomendado se a densidade colóide é alta, e numerosas bolhas de oxigénio que produzem fluxos estão presentes. A concentração em volume do colóide de cerca de 0,003% é um ponto de partida recomendada. </li><li> Otimizar as configurações ópticas para rastreamento 3D: em condições de iluminação adequadas, iN concentrar colóides aparece objectos circulares como afiadas. No entanto, como os coloides de propulsão se move dentro e para fora do plano focal um tamanho distinto mudando anel brilhante centrada em torno da esfera será observado, este é utilizado para determinar a coordenada z para activar o controlo de 3D. </li></ol></li><li> Gravar vídeo <ol><li> Antes de iniciar a captação de vídeo, o foco do microscópio de modo a que a partícula de interesse produz um anel concêntrico, com a partícula &quot;sob&quot; a posição do foco. Não mova o plano de foco durante a captura de vídeo. </li><li> Gravar vídeos de partículas de interesse. Use durações de vídeo de 30 segundos com taxas de quadro superiores a 30 Hz para permitir a reconstrução trajetória detalhada. </li></ol></li><li> Reconstrução trajetória 3D <ol><li> Calibrar eixo z <ol><li> Faça-se um peso de 2%. solução de goma de gelana em água que contém uma suspensão de partículas de Janus fluorescentes a 60 ° C, em lugar de uma cuvete equivalente aque é utilizado acima, e deixar solidificar para formar uma amostra de gel transparente rígida contendo colóides estáticos fixos. </li><li> Concentre-se em um único colóide fixo usando as mesmas condições de iluminação selecionados acima, agora gravar uma série de imagens estáticas como o foco z é levantada por deslocamentos conhecidos relativos a este plano. </li><li> Determinar o raio do anel em cada posição de focagem conhecido 11. Nota: Este é ainda mais eficiente realizada por meio de um algoritmo de análise de imagem que pode ser aplicado como um processo em lotes para todos os quadros de calibração, e vídeos. Uma abordagem típica envolve suavizar a imagem, limiar para identificar uma localização aproximada do centro dos objetos e, em seguida, localizar os x reais e y coordenadas do centro do anel, medindo a distância entre os picos de intensidade de ambos os lados do anel. A distância radial significativo para os picos de intensidade do centro do anel pode então ser encontrado. 11 Esta permite que o raio do um anel brilhanted xy coordenar a serem determinadas com precisão sub-pixel. Ao localizar o X, Y, Z posição de uma esfera Janus fixo em goma de gelano de 30 um em relação ao plano focal, numa sequência temporal das imagens, as partículas podem ser localizados com um erro de ± 25 nm ao longo de cada eixo. O erro pode ser atribuída a ruído nas imagens. A relação sinal-ruído e, por conseguinte, a precisão dos algoritmos de localização é dependente da intensidade da luz de fluorescência detectado. Quando uma esfera Janus é medida a partir do plano focal sua intensidade torna-se muito fraca para controlar com precisão o que, por exemplo, para um diâmetro de 4,8 | iM colóide um z-gama de cerca de 200 um é possível. Um método não-algorítmica alternativa é a utilização de medição manual simples de x, y e o centro do raio, no entanto, isto vai reduzir a precisão. </li><li> Traçar uma curva de calibração para relacionar raio para z-position, e apto para uma função apropriada (por exemplo, equação, cúbico) para permitir a interpolação. 11 </li></ol></li> &lt;li&gt; Calibrar x, eixo y <ol><li> Gravar um ainda armação imagem do microscópio óptico de uma retícula de calibração espacial usando as mesmas condições de microscópio escolhido no ponto 3.2. </li><li> Medir a dimensão &quot;em pixels&quot; de um objeto com dimensões conhecidas do mundo real a partir da imagem da retícula calibração espacial e usar isso para estabelecer um pixels para fator de conversão micron para o x, y plano da imagem. </li></ol></li><li> reconstruir a trajetória <ol><li> Determine as coordenadas x e y e raio para cada quadro da sequência de vídeo como descrito em 3.3.1.3, use a função encontrada em 3.3.1.4 para converter raio em z, eo fator de calibração encontrado em 3.3.2.2 para converter x e y coordenadas de pixel em microns. Este processo resultará num precisos x, y, z coordenadas para o local de partículas de propulsão como uma função do tempo. 11 Este processo pode ser implementado utilizando um algoritmo, ou manualmente. </li><li> Determinar o p derivadaROPRIEDADES tais como velocidade média para quantificar a extensão da natação catalítica observada. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Muitas variáveis ​​no protocolo de preparação para a platina partículas Janus afectará as curvas observadas. Os parâmetros, como descrito usando partículas de 2 um de diâmetro vai dar velocidades de propulsão na ordem de 10 um por segundo. Se são utilizadas partículas menores, as velocidades irá aumentar, enquanto que o aumento do tamanho de partícula irá diminuir a velocidade de propulsão. 12 Os detalhes do protocolo de evaporação também irá alterar as trajectórias observadas. Neste protocolo atual, uma distribuição esparsa de colóides é recomendado, juntamente com a evaporação de metal normal à orientação do slide. Estas condições resultam em estruturas Janus simétricas como mostrado na Figura 2, que conduzem a trajectórias linear dentro dos limites de difusão de rotação Browniano. 13 Por outro lado, se colóides apertado embalados estão sujeitos a olhando deposição em ângulo, em seguida, a simetria da tampa Janus pode ser quebrado , para induzir girando comportamento. 14 a paARTIGOS produzidos aqui exibir movimento relativamente isotrópico em todas as três dimensões; no entanto, se forem utilizados mais espessos revestimentos de platina, ou maiores partículas, um viés ou gravitaxis para cima pode ser transmitida. 11 Detalhes do armazenamento dos colóides Janus após o fabrico pode também afetar as velocidades de natação observados. A superfície de platina limpo elevada energia superficial que emerge a partir da fase de evaporação é susceptível a contaminação da superfície, por exemplo, de hidrocarbonetos, e em particular, tióis. 15 Além disso, as propriedades da solução em que os colóides Janus são re-suspensas são críticos para a observação de propulsão. Baixas concentrações de peróxido irá resultar em velocidades mais lentas, como a taxa de movimento da reacção de decomposição produzindo reduz. 6 Além disso, as baixas concentrações de sais resultará numa redução dramática na velocidade de propulsão. 7 Uma característica fundamental dos colóides produzidos aqui é a sua neflutuabilidade utral, o que os torna adequados para o rastreamento 3D. Em geral, o domínio dos dispositivos de natação deu pouca atenção aos efeitos 3D, em parte devido a alguns exemplos proeminentes a ser feitos a partir de metais densos, fazendo-os rapidamente sedimentos, 16, mas também devido às dificuldades e despesas associadas a fazer as medições necessárias. desvantagens claras para alguns métodos de rastreamento 3D estabelecidos existem para esses colóides que se movimentam rapidamente, por exemplo, microscopia confocal de varredura a laser pode faltar a resolução temporal para gravar um número suficiente de imagens para resolver trajetórias. Neste contexto, o método apresentado aqui tem a vantagem significativa de apenas exigir um único enquadramento para permitir a estimativa da coordenada z, que, consequentemente, permite elevadas taxas de quadro. Além disso, como coordenada z reconstrução baseia-se apenas sobre o contraste relativa do colóide fora de foco em quadros individuais, em vez da intensidade de fluorescência absoluta, que é resistente a têmpera e efeitos piscarno fluoróforo. Estas vantagens são possíveis à custa de uma reduzida profundidade de campo sobre o qual trajectória reconstrução 3D é possível, e o requisito de colóides não sobrepostos bem separados. Esperamos que descreve o protocolo permitirá que outros grupos de pesquisa com interesse em comportamento 3D para os seus dispositivos de natação para acessar essas informações diretamente e com um alto grau de precisão. É claro que a expansão do entendimento desses dispositivos para 3D vai abrir um leque significativo de fenômenos futuros interessantes e aplicações. Os leitores interessados ​​em mais detalhes da análise de trajetória são direcionados para referência 17, que descreve artefatos comuns em sistemas de propulsão e como assegurar a quantificação precisa de velocidades de propulsão.

Dispositivos de natação catalíticos são de pequena escala, colóides untethered capazes de gerar autonomamente movimento em ambientes fluídicos. 1,2 Estes dispositivos estão atraindo o interesse de pesquisa significativa, pois têm o potencial de permitir excitantes novas funções, como a entrega de drogas, 3 lab-on um transporte de chip 4 e remediação ambiental. 5 um exemplo amplamente estudados são catalítica &quot;Janus&quot; nadadores. 6 Estas partículas obter seu nome de que tem dois lados distintos, ou faces (Janus é um duas caras deus romano). Um lado é cataliticamente activo e capaz de realizar uma reacção de decomposição, enquanto a outra é inerte. Na presença de moléculas de combustível dissolvidos adequados, a reacção química assimétrica resultante cria gradientes em torno dos colóides que pode produzir movimento através de auto-diffusiophoresis / electroforese 7. Caracterizando o movimento para esses objetos em movimento rápido é cha<html> llenging e muitas observações experimentais até à data têm sido limitada a 2D. No entanto, eventuais aplicações são susceptíveis de explorar catalítica habilidade dispositivos de natação para se mover ao longo de soluções a granel em 3D 8 Para resolver esta questão., Aqui nós descrevemos um protocolo que permite que as trajetórias 3D precisos para dispositivos de natação a ser determinado. Este método baseia-se na interpretação das estruturas anelares produzidos por fora de foco fluorescente colóides observadas com um objectivo de foco fixo, 9 e é fácil de aplicar utilizando microscópios convencionais não modificadas. Ao descrever claramente este método aqui, outros pesquisadores da área irão beneficiar por ser capaz de acessar tais informações 3D. Isto ajudará perspectivas futuras em características de movimento para dispositivos de natação. Evidência deste potencial é dado pelo recente relatório de dispositivos de natação que está sendo dirigido por gravidade, 10,11 comportamento que podem ser mais facilmente visualizado através da aplicação de rastreamento 3D. 11 ove_content &quot;&gt; Este artigo também documenta claramente um método para a fabricação de Janus dispositivos de natação partículas catalíticos, que serão de benefício adicional para padronizar métodos através dos grupos de pesquisa existentes na investigação destes dispositivos, e, adicionalmente, orientar novos investigadores interessados ​​em fazer e investigar dispositivos de natação.

<table><tbody><tr><td>Evaporator</td><td>Moorfield (UK)</td><td></td><td>Minilab 80 e-beam evaporator</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse LV100</td></tr><tr><td>Fluorescence light source</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon B2A filter cube</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X, 0.45 NA</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Hellma</td><td></td><td>fused quartz, 40 x 10 x 1 mm</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>IKA</td><td></td><td>Lab Dancer S2</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies Corp.</td><td></td><td>Model WS-400BZ-6NPP/Lite</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Eumax</td><td></td><td>2 liter</td></tr><tr><td>Lens tissue</td><td>Whatman</td><td>2105 841</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30 wt%</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267171</td><td>0.25 mm, 99.99%</td></tr><tr><td>Colloids</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Fluoro-Max PS microspheres, d = 1.9&amp;nbsp;microns</td></tr><tr><td>Glass decontamination solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0025/15</td><td>Decon 90</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0600DF/17</td><td>Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>DI water</td><td>Elga</td><td></td><td>Purelab Option filtration system (15 MW)</td></tr><tr><td>Gellan gum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169-100G</td><td>&quot;Phytagel&quot;</td></tr></tbody></table>

preparation and 3d tracking of catalytic swimming devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A Figura 1 mostra uma dispersão típica de colóides em uma lâmina de vidro limpa antes da deposição de platina. A Figura 2 mostra uma imagem SEM de volta típica-espalhados por meio de platina revestido Janus nadador, no âmbito do presente modo de imagiologia da região de platina revestida produz contraste brilhante. A camada de platina hemisférica desejado é aparente. Figura 3 mostra a aparência de uma lâmpada fluorescente Janus nadador típica em condições de iluminação ideais fixos em goma de gel. O nadador aparece como uma característica anel simétrico, e é o raio do anel que pode ser utilizado para determinar o z-posição do colóide em relação à posição de focagem. A Figura 4 mostra secções transversais representativos para a distribuição de intensidade do brilho radial que é utilizado em combinação com algoritmos de análise de imagem para localizar com precisão o centro e raio aparente do colóide. Figura 5 </stron<html> g&gt; contém uma curva de calibração obtida utilizando uma amostra coloidal fixo e um microscópio de fase Z-tradução calibrado para relacionar o tamanho coloidal aparente e a distância da posição de focagem. Esta curva está equipado para uma função cúbica, que é utilizado para converter o raio aparente na coordenada z. Finalmente, a Figura 6 mostra um típico x, y, z trajectória para um fluorescente Janus nadador partícula. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem Óptico de microesferas de poliestireno de 1,9 mm de diâmetro. As microesferas são dispersas numa lâmina de vidro limpo antes da deposição de platina. Barra de escala representa 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> es / ftp_upload / 54247 / 54247fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imagem SEM de uma retroespalhamento 1,9 um de diâmetro microesferas de poliestireno. As microesferas são mostrados após a deposição de platina. Barra de escala representa 2 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens de calibração de uma esfera de poliestireno fluorescentes 4,8 mm de diâmetro fixo na goma de gel gravado utilizando um objetivo 20X (0,4 NA). As distâncias abaixo de cada imagem indicam a distância do plano focal do objectivo acima da esfera. À medida que a imagem está desfocado de 0 um a 200 um a imagem no foco de um brilhante alterações disco para um anel luminoso, o raio dos quais é dependente de ampliação, o sphere tamanho e sua distância do plano focal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig4.jpg" /> Figura 4. X, Y, Z procedimento de rastreamento de partículas. Um conjunto de algoritmos de auto-escrita é usado primeiro para localizar o centro (x, y) do anel brilhante através da extracção de uma série de linhas verticais e horizontais e encontrar a média médio ponto entre os picos brilhantes (a). O raio do anel é então calculado a partir da intensidade do pico de uma ranhura ajustada aos valores de cinzentos de pixel média que irradiam para fora do centro do anel (b). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 5. coordenada Z gráfico de calibragem para esferas Janus obtidos medindo o raio luminoso anel de esferas fixas em goma de gelano (ver Figuras 3 e 4). O gráfico de calibração é utilizada pelos nossos algoritmos para converter o raio medido a um anel Z- coordenar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig5large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54247/54247fig6.jpg" /> Figura 6. A trajetória de um dispositivo típico fluorescente Janus esfera natação. Uma sequência de imagens do dispositivo móvel natação foi gravado durante um período de 30 segundos a uma taxa de quadros de 33 Hz. O (x, y, z) da trajectória coordenadas foram obtidos por localizar o centro de anel brilhante (Fifigura 4 (a)) e comparando o raio de oscilação medida para o gráfico de calibração para cada imagem na sequência (Figuras 4 (b) e 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54247/54247fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Preparação e 3D Rastreamento de Catalytic Natação Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

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7.5K visualizações.  University of Sheffield. A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Vídeo: Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Biologia do Desenvolvimento

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen consumption is typically used as the criterion measurement in this regard, two metabolic breakpoints that reflect changes in the dynamics of lactate production/consumption as the work rate is increased are perhaps more relevant for endurance athletes from a functional standpoint. Exercise economy, which represents the rate of oxygen consumption relative to performance of submaximal work, is also an important parameter to measure for endurance-athlete assessment. Ramp incremental tests comprising a gradual but rapid increase in work rate until the limit of exercise tolerance is reached are useful for determining these parameters. This type of test is typically performed on a cycle ergometer or treadmill because there is a need for precision with respect to work-rate incrementation. However, athletes should be tested while performing the mode of exercise required for their sport. Consequently, swimmers are typically assessed during free-swimming incremental tests where such precision is difficult to achieve. We have recently suggested that stationary swimming against a load that is progressively increased (incremental tethered swimming) can serve as a &#34;swim ergometer&#34; by allowing sufficient precision to accommodate a gradual but rapid loading pattern that reveals the aforementioned metabolic breakpoints and exercise economy. However, the degree to which the peak rate of oxygen consumption achieved during such a protocol approximates the maximal rate that is measured during free swimming remains to be determined. In the present article, we explain how this rapidly incremented tethered-swimming protocol can be employed to assess the cardiorespiratory capacity of a swimmer. Specifically, we explain how assessment of a short-distance competitive swimmer using this protocol revealed that his rate of oxygen uptake was 30.3 and 34.8 mL&#8729;min-1&#8729;kg-1BM at his gas-exchange threshold and respiratory compensation point, respectively.

As opposed to measurement during free swimming, which presents inherent challenges and limitations, determination of important parameters of cardiorespiratory function for swimmers can be made using a more feasible and easier to administer tethered-swimming rapidly incremented protocol with gas exchange and ventilatory data collection.

Um protocolo máximo de natação amarrada rapidamente incrementado para avaliação cardiorrespiratória dos nadadores

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Bioquímica

3D Kinematic Gait Analysis for Preclinical Studies in Rodents

The utility of three-dimensional (3D) kinematic motion analysis systems is limited in rodents. Part of the reason for this inadequacy is the use of complex algorithms and mathematical modeling that accompany 3D data collection and analysis procedures. This work provides a simple, user-friendly, step-by-step detailed methodology for 3D kinematic gait analysis during treadmill locomotion in healthy and neurotraumatic rats using a six-camera motion capture system. Also provided are details on 1) calibration of the system in an experimental set-up customized for quadrupedal locomotion, 2) data collection for treadmill locomotion in adult rats using markers positioned on all four limbs, 3) options available for video tracking and processing, and 4) basic 3D kinematic data generation and visualization and quantification of data using the built-in data collection software. Finally, it is suggested that the utility of this motion capture system be expanded to studying a variety of motor behaviors before and after neurotrauma.

Presented here is a protocol to collect and analyze three-dimensional kinematics of quadrupedal locomotion in rodents for preclinical studies.

Análise de marcha cinemática 3D para estudos pré-clínicos em roedores

The utility of three-dimensional (3D) kinematic motion analysis systems is limited in rodents. Part of the reason for this inadequacy is the use of ...

Comportamento

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Neurociência

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

Atuador baseado em células musculares cardíacas e Biorobot auto estabilizante - PARTE 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Bioengenharia

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Swimming Performance Assessment in Fishes

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, pollution, hypoxia and temperature. This paper describes a flexible protocol to assess fish swimming performance using equipment in which water velocity can be controlled. The protocol involves one to several stepped increases in flow speed that are intended to cause fish to fatigue. Step speeds and their duration can be set to capture swimming abilities of different physiological and ecological relevance. Most frequently step size is set to determine critical swimming velocity (Ucrit), which is intended to capture maximum sustained swimming ability. Traditionally this test has consisted of approximately ten steps each of 20 min duration. However, steps of shorter duration (e.g. 1 min) are increasingly being utilized to capture acceleration ability or burst swimming performance. Regardless of step size, swimming tests can be repeated over time to gauge individual variation and recovery ability. Endpoints related to swimming such as measures of metabolic rate, fin use, ventilation rate, and of behavior, such as the distance between schooling fish, are often included before, during and after swimming tests. Given the diversity of fish species, the number of unexplored research questions, and the importance of many species to global ecology and economic health, studies of fish swimming performance will remain popular and invaluable for the foreseeable future.

The lives of the majority of fish are predicated on swimming. This protocol describes techniques for capturing a range of swimming modes available to individual and schooling fish, and includes metrics associated with swimming physiology and behaviour.

Avaliação de Desempenho nadando em Peixes

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, ...

Biologia

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...