この作品は、創薬および国立衛生研究所で将軍医科学研究所（P20GM104316とP30のGM110758-01、それぞれ）から組織開発賞、ピュー慈善財団が資金を提供高度な生体材料にデラウェアCOBREプログラムによってサポートされていました（00026178）、全米科学財団のキャリア賞（DMR-1253906）、バローズウェルカム基金（1006787）、およびデラウェア大学の国立科学財団IGERT SBE2プログラム（L. Sawickiにフェローシップ）。著者らは、寛大に、骨髄、教授クリストファー・Jから単離されたhMSCを提供するために、ビデオ撮影時の支援のために、共焦点顕微鏡、さんキャサリンワイリーに氏マシュー・レーマンを訓練し、アクセスのためのデラウェア大学のデラウェアバイオテクノロジー研究所バイオイメージングセンターに感謝します自動プレートリーダーを使用するため。Kloxin氏とスティーブン馬寛大にフォトマスクを提供するための、および教授ウィルフレッド・チェン。 </p&gt;

<ol>
	<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li><li>Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+in+Materials+Science.">Click Chemistry in Materials Science.</a> Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).</li><li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+An+indispensable+tool+to+create+multifaceted+cell+culture+scaffolds.">Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds.</a> ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).</li><li>Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+the+alkyne-azide+cycloaddition+by+photoinitiated+Cu(II)+reduction.">Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction.</a> Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).</li><li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-ene+click+chemistry.">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).</li><li>Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+hydrogels+via+catalyst-free+and+bioorthogonal+&amp;#34;tetrazole-Alkene&amp;#34;+photo-click+chemistry.">In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal &amp;#34;tetrazole-Alkene&amp;#34; photo-click chemistry.</a> Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).</li><li>Burdick, J. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+static+to+dynamic+complexity+in+hydrogel+design.">Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design.</a> Nat Commun. 3, 1269 (2012).</li><li>Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+dynamic+soft+materials+for+three-dimensional+cell+culture.">Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture.</a> Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).</li><li>Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+well-defined+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+prepared+by+thiol-ene+chemistry.">Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry.</a> J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+synthetic+extracellular+matrix+mimic+via+thiol-norbornene+photopolymerization.">A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization.</a> Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).</li><li>Roberts, J. J., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+photopolymerizable+thiol-ene+PEG+and+acrylate-based+PEG+hydrogels+for+cartilage+development.">Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development.</a> Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-norbornene+photoclick+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications.</a> J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).</li><li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+thiol-ene+photoclick+hydrogels+using+facile+techniques+for+cell+culture+applications.">Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications.</a> Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).</li><li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2.">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li><li>Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable,+photoadaptable+hydrogels+via+radical-mediated+disulfide+fragmentation+reaction.">Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction.</a> Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+incorporating+RGD+adhesive+peptide+in+polyethylene+glycol+diacrylate+hydrogel+on+osteogenesis+of+bone+marrow+stromal+cells.">The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).</li><li>Wacker, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+on+RGD-peptide-containing+PEG+hydrogels+in+the+presence+of+sphingosine+1-phosphate.">Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate.</a> Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).</li><li>Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+well-defined+peptide-hydrogel+spacing+and+concentration:+impact+on+epithelial+cell+behavior.">Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior.</a> Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).</li><li>Qiong Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+polyethylene+glycol/+RGD+peptide+hybrid+hydrogels+for+in+vitro+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stern+cellsa.">Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa.</a> Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function.">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).</li><li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids.">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering.">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J Vis Exp. (32), e1590 (2009).</li><li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH/3T3+fibroblasts+in+vitro.">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).</li><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks+Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks.">Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks.</a> Society. 6 (1), 386-391 (2005).</li><li>Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+of+gels+based+on+(hydroxypropyl)+cellulose+methacrylate.">Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate.</a> Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).</li><li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+of+Hydrogel+Scaffolds.">Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds.</a> Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions.">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).</li><li>Mosiewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cell+manipulation+through+enzymatic+hydrogel+photopatterning.">In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning.</a> Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).</li><li>Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+cytocompatibility+of+six+cell+lines+with+photoinitiators+used+for+polymerizing+hydrogels+and+cell+encapsulation.">Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation.</a> Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).</li><li>Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).</li><li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically+tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions.">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+rates+and+mechanisms+for+radical,+photoinitated+addition+of+thiols+to+alkynes,+and+implications+for+thiol-yne+photopolymerizations+and+click+reactions.">Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions.</a> Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Wylie, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels.">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li><li>Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+solid+supports+for+the+modulation+of+stem+cell+fate.">Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).</li><li>Hudalla, G. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+that+regulate+growth+factor+activity+via+bioinspired+interactions.">Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions.</a> Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).</li><li>Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで紹介する手順は、チオール - エンクリックケミストリーによって形成されたヒドロゲル内のセルをphotoencapsulateする技術を実証し、その後、生化学的手がかりを有するゲルをphotopattern。最初にヒドロゲルを形成するための光の使用は、重合に先立って、ポリマー溶液内で均一に混合し、細胞の懸濁液を可能にします。急速な重合 &#39;ロック&#39;が定義されて金型の形状におけるゲルおよびハイドロゲルネットワーク内で懸濁した細胞をカプセル化します。ゲルはまた、所望の最終用途に応じて多数の異なる形状（ 例えば 、ガラススライドまたはシリンジ先端）に成形することができます。光減衰は、薄い試料に制限されるように、例えば、ガラススライドに取り付けられたヒドロゲルで3D培養のためにカプセル化された細胞が撮像用途のために特に有用です。シリンジ型をスライドガラスに比べて（サンプルの多くを短時間で製造することを可能にする、細胞の急速なカプセル化のために使用することができます複数の）そのようなフローサイトメトリーまたはqPCRのような多数の細胞を必要とする実験のために使用することができます。その後、これらのゲルは、その後、分化または浸潤のような所望の細胞応答を誘発するために、生化学的手がかりを用いてパターニングすることができる。30,31 生存率および代謝活性のためのアッセイは、提示された資料システムとパターニングの条件のための細胞の生存率を示しています。代謝活性が細胞機能に対する重合及びパターニング条件の初期効果を評価するために、非分解性ゲル（RGKGRKペプチド架橋）で3日目までモニターしたことに注意してください。また、分解性ペプチドの架橋（GPQGIWGQ）を用いて製剤化ゲル中のポストカプセル化は、細胞が生存し、培養液中で1週間で広がって残ることをサポートしている1と6日目のhMSCの膜完全性アッセイ（生/死生存性/細胞毒性染色）。追加の細胞株の生存率と同様の条件32を光パターンについて報告されていますここで使用され、生/死染色および代謝活性アッセイを用いて説明したヒドロゲル系について評価することができます。我々は、この材料系と関連する手順（4.2および4.3）を使用して、細胞生存率の問題は観察されなかったが、いくつかの細胞種は、フリーラジカルおよび/または露光に敏感であってもよいです。この場合、ユーザーは、アジド-アルキン、12 FXIII、31またはディールス・アルダーベースのヒドロゲル形成の化学的性質などの非光開始材料系を使用して検討すること。33 ゲル内の生化学的手がかりのパターンを検出し、定量化する容易な技術はまた、（3.1と3.2）を提示されています。試薬は市販されており、余分な合成処理工程以上の高価な試薬（ 例えば 、蛍光標識ペプチド）が必要とされないので、エルマンアッセイは、特に重要です。エルマンアッセイが正確にdiffere下生化学的手がかりと遊離チオールの変更を決定することができますntの条件を光パターンだけでなく、急速にパターンを可視化します。パターニングの前と後のペプチドの取込み、チオール官能基の濃度を定量するために、ペプチドの取り込みの定量的尺度として、直接エルマンアッセイにより評価されます。定量化のこのタイプは、蛍光標識されたペプチドを用いて行うことができるが、34撮像系の定量は、より多くの時間がかかるハンドリング及び分析手順（ 例えば 、ペプチド濃度に蛍光を関連付ける較正曲線の蛍光標識ペプチドおよび生成の合成を必要とします）画像解析を使用して。撮像ペプチドの取り込みのために、エルマン試薬を直接試料に適用し、即座に視覚化することができます。パターンの可視化のためのxおよびy平面に制限しながら、この技術は、遊離チオール基を含有するマトリックスがパターニングされているかどうかを決定するために、単純なルーチンの方法として使用することができます。エルマンアッセイをcではないことに注意することが重要ですそれはphotopatternsを観察し、定量化するために使用することができるが、それは細胞の存在下で行うことができないので、細胞適合性onsidered。三次元で、細胞の存在下でのパターニングを撮像するため、ヒドロゲルマトリックス内の蛍光性ペプチドの結合は強力で広く使用されるアプローチのままです。パターンの解像度は、y軸、x軸に評価することができ、Z平面共焦点顕微鏡を使用して、パターニング領域または非パターン領域内の細胞を同定することができるように、この方法は、細胞適合性です。まとめると、エルマンアッセイおよびイメージングベースの技術は、研究者は材料系内の両方の定量的および定性的生化学的手がかりの光パターンを評価するための補完的なツールです。 Photoclick、またはより広く光開始は、細胞の存在下でヒドロゲルの形成と修正のための化学物質は多数あります。ここに提示成形、カプセル化、およびパターニング技術は、LIMではありません説明材料系へitedとは、チオール-アルキン、35アジド-アルキン、4および他のチオール-エン化学的性質（ 例えば 、チオール-ノルボルネン）、10,13と同様のように代替光ベースの化学薬品に適用することができますこのようなイルガキュア2959、エオシンY、およびカンファーキノンなどの異なる光開始剤、。 、ユーザーがプロシージャのパラメータを調整する必要があります（ 例えば 、インキュベーション時間、重合時間、細胞密度は）条件が、これらの他のシステムのための細胞適合性のままであることを確認します。パターニング工程は、ヒドロゲル（2.2.3-2.2.5）にALLOC修飾ペプチドの拡散を必要とするので、この方法は、インテグリン結合部分（ 例えば 、ペプチドまたは細胞外マトリックスタンパク質の添加のために最も有用であろうネットワークへのリガンドの結合は、細胞と完全なインテグリン活性化による牽引力の生成に必要とされるヒドロゲル、にフラグメント）。36注意、生体分子のためのものかもしれません溶液中または固定化（ 例えば 、成長因子またはサイトカイン）の際にも同様にアクティブで、ヒドロゲルへの部分拡散（〜1時間）のためのインキュベーション工程は、パターニング結果を畳み込むシグナル伝達事象につながる可能性があります。他の方法は、そのパターニングのための成長因子の固定化やローカル隔離のために確立されている。37-39はさらに、パターン解像度は、露光量の制御によって決定されます。ここでは、フォトマスクは、ゲルの深さを通って、x軸とy平面内でパターンを作成できます。しかしながら、ゲル内の生化学的手がかりのパターニングをより空間的制御は、x方向におけるパターン、y軸、およびZ-面を生成するために二光子共焦点顕微鏡を使用するように照射する別の方法で達成することができる。34,40最後に、この手順内で利用される材料システムのみ最初に生化学的合図で修飾されている間、直交photoclick化学は、アルテを可能にするために使用することができることに注目することが重要です時間をかけて行列のプロパティで配給。12ここで紹介する手順および技術は、明確に定義されたと時空間制御特性を有する合成行列を作成するための現在のアプローチに多様性を追加します。特に、この手順内で使用される試薬および材料の商業的利用可能性は、制御された細胞培養液中のアプリケーションのためのハイドロゲルベースの生体材料の使用に興味を持つ研究者の広い範囲に有用であろう。

化学的性質がますます薬物送達、組織工学、および制御された細胞培養、それらの選択のために、効率的で、多くの場合、細胞適合性反応性を含む多くの生物医学的用途のための材料の設計に使用されている。光を利用1-3 Photoclick化学をトリガするためにクリックしますか、反応（ 例えば 、アジド、アルキン、4チオール-エン、5及びテトラゾール-アルケン6）生体材料の形成または改変するために特に重要である開始します。温和な条件といつ、どこで、彼らは光で場所を取るの制御下に急速な速度の細胞の存在下での生体材料特性のユーザー主導の制御のためのこれらの反応はよく適合させる。具体的には7,8-、チオール-エンphotoclick化学物質が使用されてきましたない堅牢な機械的性質5,9とを含むが、細胞型の多様なカプセル化のためのヒドロゲル系生体材料を生成しますまた、これらの化学物質は、の重要な局面を模倣するために、生化学的手がかりの空間的なパターニングのために使用されているT細胞培養および送達のための約束で、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、線維芽細胞、軟骨細胞、および膵臓細胞に制限。10,11天然の細胞の微小環境との密着性、分化、および浸潤などの適切な細胞-マトリックス相互作用を促進。3,12 光とのチオール-エンヒドロゲルの構築のために、システイン（チオール）を含むペプチドは、一般的に細胞適合性の条件下で迅速な、光開始重合のためのアクリレート又はノルボルネン（ &#39;エン&#39;）で官能化ポリマーと反応させる。13このツールボックスを展開する、我々が確立することを求めて最小限の合成処理を必要または合成細胞外マトリックスとしての幅広い使用に向けて市販されていた新しい多機能でアクセス可能なビルディング・ブロックとヒドロゲル形成のための方法。[非分解性または細胞分解性架橋のためKを（細胞接着[K（アロケーション）GWGRGDS = Pep1Alloc]または2を促進するためのペンダントのための1、インテグリン結合グループ：14具体的には、ペプチドは、（のAlloc）アリルオキシカルボニルで変更されたがリジンを-保護しましたALLOC）RGKGRKGK（アロケーション）GまたはKK（ALLOC）GGPQGIWGQGK（アロケーション）K = Pep2Alloc、それぞれ]。これらの配列を用いて、条件が長波長UV光（365 nmでの10ミリワット/ cm 2）での細胞適合性の用量を使用して、4つのアームチオール変性ポリ（エチレングリコール）（PEG4SH）と急速反応（1~5分）のために確立されたと光開始剤、リチウムフェニル-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP）。得られたヒドロゲルは、週間の細胞培養条件下で安定でした。電池駆動型の分解と再構築を有効にするには、酵素的に切断可能なペプチドは、ゲルの架橋（ すなわち 、GPQGIWGQ）、15モデルの一次細胞、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）内に組み込まれた、ドゥリンカプセル化と後に非常に実行可能なままでしたこれらのマトリックス内グラム文化。さらに、ペプチドは、空間的に、これらの材料の中にパターン化されており、およびhMSCのは、光パターニングの条件の下で生存可能で代謝的に活性なままです。 （ 例えば 、IKVAV、YIGSR、GFOGER）ここには示されていない代替のペンダントペプチド配列もまた、周囲の微小環境との追加の細胞相互作用を調べるためにマトリックス内に組み込まれてもよいです。これらの結果は、種々の細胞型のために研究するための三次元（3D）細胞培養および送達のためのこれらのヒドロゲル系材料の適用及び直接細胞 - マトリックス相互作用のために有望です。 ここで、方法は、細胞をphotoencapsulateし、提案されたヒドロゲル系内その後photopattern生化学的手がかり（ 図1）に提示されています。これらphotopatternsを観察し、定量化するための技術も実証されています。特に、i）は modificaを決定するために、エルマンアッセイの定量的および定性的使用パターニングされた基板と、蛍光性ペプチド（AF488Pep1Alloc）のii）の相補的な定性的な使用中の遊離チオールの化は、3次元でこれらのパターンを観察しました。さらに、アッセイは、生存率（生/死生存率/細胞毒性染色）および代謝活性を決定するために（MTS; 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル） -2H-テトラゾリウム）ユーザはヒドロゲルマトリックス内の異なる細胞株について光封入及び光パターニング条件の細胞適合性を決定することができるように提示されています。プロトコルが容易な光ベースphotoclickヒドロゲルシステムについて示されているが、この技術は、細胞の存在下で光封入し、光パターンのための多数の他のラジカル開始ヒドロゲルシステムに適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Custom Peptides</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">4arm PEG Thiol, MW 20k</td>
			<td style="width:161px;">JenKem USA</td>
			<td style="width:123px;">4ARM-SH</td>
			<td style="width:331px;">Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
			<td style="width:161px;">Colorado Photopolymer Solutions</td>
			<td style="width:123px;">Li-TPO</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">149470</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">682519</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">213225</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">360473</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flask, Round Bottom, 100 mL</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1506-05</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1402-L-02</td>
			<td style="width:331px;">Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Magnetic Stir Bars</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Magnetic Stirring and Hot Plate</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vacuum Dessicator</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:161px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:123px;">16630</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14190-250</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Fungizone</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15290-018</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15400-054</td>
			<td style="width:331px;">Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">1.5 or 2 mL sizes, sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-823-16H</td>
			<td style="width:331px;">Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-544-1</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">High-Purity Silicone Rubber, 0.010&#34; Thick, 6&#34; x 8&#34; Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td>
			<td style="width:161px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:123px;">87315K62</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:161px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:123px;">2701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">RainX, Original</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:123px;">800002243</td>
			<td style="width:331px;">May be purchased from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SL2</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Photomasks</td>
			<td style="width:161px;">Advance Reproductions Corporation</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">DTNB; Ellman&#39;s Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">PI-22582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E6758</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S318</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Orthophosphoric Acid</td>
			<td style="width:161px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">33266</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7880</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">L-3224</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">G3582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of speeds at 90-110 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Multiwell Plate Reader</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Epifluorescent or Confocal Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Omnicure Exfo Series 2000</td>
			<td style="width:161px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Zeiss Zen Lite Software</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">NIH</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications

クリック化学は、薬物送達、組織工学、細胞培養物を含む多くの生体材料用途において使用するために研究されてきました。特に、このような光開始チオール - エンおよびチオールYNE反応のような光媒介クリック反応は、材料特性以上の時空間的な制御を与えると、ユーザ指向特性制御度の高いシステムの設計を可能にします。光とこれらのチオール-Xのphotoclick化学反応によって提供される汎用性によってもたらされる精度を使用してハイドロゲルベースの生体材料の作製と修正は、特に明確に定義された、生体模倣微小環境内の細胞の培養のために、成長して注目されています。ここでは、細胞およびチオール - エンphotoclick反応により重合汎用性とモジュラービルディングブロックを使用して、ヒドロゲルマトリックス内の生化学的手がかりのその後の光パターニングの光封入するための方法を説明します。具体的には、アプローチは共同のために提示されていますアリルオキシカルボニルからnstructingヒドロゲル（のAlloc）-functionalizedペプチド架橋及びペンダントペプチド部分と迅速リチウムacylphosphinate光開始剤と長波長紫外線（UV）光の細胞適合性用量の存在下で重合チオール官能化ポリ（エチレングリコール）（PEG）。光パターンを視覚化し、追加のペプチドの濃度を定量するための簡便な技術が記載されています。さらに、方法は、細胞、特にヒト間葉系幹細胞をカプセル化するために確立され、そしてそれらの生存能力および活性を決定しています。チオールALLOCヒドロゲルの形成および初期のパターニングは、ここで示されているが、これらの技術は広く、パターン化基板を生成する他の光とラジカル開始材料系（ 例えば 、チオール-ノルボルネン、チオール-アクリレート）の数に適用されてもよいです。

セットアップ手順は、図1に示されている細胞およびカプセル化された細胞を含むその後photopatternゲルphotoencapsulateし、ストック溶液を調製するための例は、10重量％のゲルは、表1に提供されて形成する。 表1を用いて、単量体の量（PEG4SHをヒドロゲルを重合するのに必要なPep2Alloc、±Pep1Alloc）および光重合開始剤（LAP）を算出します。これらの計算に基づいて、PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、およびLAPの原液は、それぞれ、ゲルを形成し、フォトパターニングのためPep1Allocととせず（ 図1A）を用意し、混合されています。続いて、細胞をプレートから採取し、計数し、カプセル化（ 図1B）のために適切な量で遠心分離します。細胞ペレットは、ゲル形成溶液（PBS中のペプチド/ポリマー/ LAP）に再懸濁され、そして細胞/モノマー混合物は、ガラスまたはシリンジモルに転送されますDS。細胞は（10ミリワット/ 365nmのcm 2の1-5分）（ 図1C）、光の印加時にヒドロゲル内にカプセル化されています。 （ 図1D）をフォトパターニングするために、ゲルを重合マトリックス中にペプチドおよび開始剤の拡散を可能にする、1時間30分間、30分間Pep1Alloc及びLAPに浸漬されています。これらのペプチドを含んだゲルは、所望のパターンを有するフォトマスクで覆い、マトリックス内遊離チオールにペプチドを結合するために光の第2用量（1分）にさらされています。ペンダントテザーにのみ共有結合適切な細胞-マトリックス相互作用を促進し、in vitroで細胞機能と運命をプロービングに向けた天然の細胞の微小環境の重要な機械的および生化学的特性を模倣する、光に露出した領域にゲルにリンクされています。 エルマンアッセイはphotopatte内のゲル修正およびペプチドの取り込みを定量化するための容易かつ安価な方法を提供し、rned基板。パターン化および非パターンゲル（ペプチドの改変の有無にかかわらず、すなわち 、ゲル）をエルマン反応緩衝液後重合中に浸漬されています。次に、システイン標準バッファに浸したゲルは、48ウェルプレートに入れ、エルマン試薬（左図2A）とインキュベートします。 1時間30分後、試料のアリコートを、96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、吸光度を405nmで記録されています。システイン標準の較正曲線（ 図2A、右）は（吸光度線形フィット、濃度対）にプロットされ、そしてゲル中の遊離チオールの量は、それらの希釈係数に基づいて決定することができます。 10重量％のゲルの種々の重合及び光パターン条件のために、これらの遊離チオール濃度は、 図2Bに示されています。 Pep1Allocなし1または5分間重合ゲル（青いバー、I = 1分およびII = 5分）トンを示す、統計的に同様の遊離チオール濃度を有します帽子急速な反応が起こり、ゲル化は1分（両側t検定、p&gt; 0.05）以内に完了する。このように、光（2-5分）への追加の暴露は、官能基の更なる変換にはなりません。 Pep1Allocなしで1分間重合ゲルは、30〜90分間（3 mg / mlで）およびLAP（2.2ミリモル）（緑色のバー、II = 30分とIV = 90分）Pep1Allocに浸漬し、光の第2の用量に曝露しました1分間。遊離チオールの減少（1分の条件に対して60から80パーセント）は、これらの条件下でペンダント手がかりとゲルの効率的な変更を示します。より高い変更が望まれる場合、Pep1Alloc溶液の濃度は、多くのペプチド溶液は、変換を制限し得る希釈中の遊離チオールへPep1Allocのアクセスとして使用することができる増加しました。例えば、我々は、20 mg / mlで遊離チオールのPep1Allocプロデュース&gt; 90％の変換までの濃度のことを見出しました。 ユニーク、ペプチドのパターンは、ヒドロゲル月に追加しました急速にエルマン試薬（5分下の図3A）で画像化します。しかし、パターンの可視化は、ゲルを通して黄色のTNB の2-ジアニオンの拡散に起因した時間（5分より大きい）の上に失われます。撮像分解能を向上させ、三次元（X軸、Y軸、Z面）に、細胞の存在下でパターンを観察するため、蛍光性ペプチドの付加（AF488Pep1Alloc）が利用されてもよいです。 図3Bの x軸では、共焦点顕微鏡で撮影した画像スタックのy軸およびz突起はパターン解像度（ミクロンスケール）を実証し、示されています。 約（94±2）％と（94±1）分解性ゲル内に封入されたhMSCの％は、（Pep2Alloc = GPQG↓WGQ）少数の死細胞（赤核に、それぞれ、生存したままで（緑色細胞体）1と6日封止後）（ 図4A）を観察しました。さらに、hMSCのは、拡散は（6日後のカプセル化で観察されます<st<html>栄&gt;図4A、挿入図）、細胞は改造とインテグリン結合RGDSで変性されたこれらのMMP-分解性マトリックスと相互作用することができることを示しています。非分解性ゲル（Pep2Alloc = RGKGRK）でカプセル化された細胞で実施代謝活性アッセイ1および3日後にカプセル化（ 図4B）細胞生存率の第二の手段を提供し、細胞を、試験した様々な光封入し、光パターンの条件のためのアクティブなままであることを実証エルマンアッセイ（ 図2B）。特に、Pep1Alloc + LAP（条件III及びIV）及び初期封入（条件I及びII）との30分および90分のインキュベーションの間の代謝活性に有意差は手順が光パターニングの用途において適していることを示す、存在しません封入された細胞（両側t検定、p&gt; 0.05）の存在。 2fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：マクロマー及び光開始剤のヒドロゲル内のセルをカプセル化し、その後の生化学的手がかりと光パターンのセットアップ （A）ストック溶液を調製し、（PEG4SH =バックボーン、Pep2Alloc =架橋、Pep1Alloc =ペンダント接着部分（RGDS）、LAP =光開始剤混合）。 （B）細胞をカプセル化するために収集されます。 （C）細胞（それぞれ、PEG4SH / Pep2Alloc / LAPまたはPEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP）なしまたはインテグリン結合ペプチドとマクロマーソリューションと混合され、光への曝露時に封入されています。 ゲル形成の間に過剰なチオール基を含む（D）ゲル（ここで、2mMの過剰のチオールを用いて形成PEG4SH / Pep2Alloc / LAPが）、単一のAlloc基（Pep1Alloc、 例えば、で官能化ペプチドのその後の添加によって生化学的手がかりを用いてパターニングすることができますRGDS、IKVAV、 等 ）は、細胞接着を促進するためゲルの特定の領域内です。ここでは、蛍光標識されたRGDSを有するゲルのパターニングが示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> 図 2： 定量的なエルマンアッセイのセットアップとその結果をパターン化ハイドロゲルの変形を評価するための （A）ゲルおよびシステイン基準はエルマン試薬で48ウェルプレート中でインキュベートします。線形標準曲線は、ゲル試料中のシステイン濃度を決定するためにプロットされています。 II = 5分重合; III = 30分のインキュベーションPep1Allocと;（B）過剰遊離チオールは、ペンダントのalloc-ペプチド（I = 1分間の重合をパターニング時にゲル形成中のヒドロゲル内に組み込まれ、消費されたIV = 90分のインキュベーションのwi<html>第Pep1Alloc; IIIおよびIVの両方）を重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> 図 3： エルマンアッセイおよび蛍光画像がフォトパターンヒドロゲルを可視化する （A）エルマン試薬は迅速にx方向におけるパターン（ライン）とy平面（黄色=パターン化されていない領域、スケールバー= 1 mm）を検出するために使用され得ます。 （B）蛍光ペプチドは、x軸、y軸、およびz平面（; 200ミクロンのスケールバー; 10X水浸漬対物; EX /エム525分の488 nmのグリーン=パターン領域）のパターンを観察するために使用されてもよいです。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> 図4： 生存率と非分解光パターンヒドロゲル内の細胞の代謝活性 （A）は実施例の共焦点zスタック（Z-投影; 10X水浸漬対物レンズ）、生存の（緑; EX /エム525分の488 nm）を死にました。 hMSCは（赤; EX /エム580分の543 nm）は、ヒドロゲル内にカプセル化後24時間カプセル化（スケールバー= 200μm）で。 6日のカプセル化（挿入画像、スケールバー=50μm）をした後、これらのヒドロゲルの中に広がった細胞。 （; II = 5分重合I = 1分重合）とパターニング条件（III = Pep1Allocで30分間のインキュベーション（B）細胞は、1と3日（それぞれ明るさと暗さのバー、）種々の重合のためのポストカプセル化は、代謝的に活性であります; IV = 90分incubationはPep1Allocと。両方の）重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> 表1： ハイドロゲルを作製するためのストック溶液の体積を計算するための例のセットアップ青強調されているスプレッドシート内の細胞は、ユーザ定義のパラメータを示しています。他の量は、これらの設定に基づいて計算されます。ゲルを作るために、各ストック溶液の最終的なボリュームがオレンジ色で強調表示されます。白血球は、ユーザ定義のパラメータに基づいて最終的な体積を計算するために使用される数式を含みます。 2.2ミリモルのLAPの濃度が0.067重量％に相当することに注意してください。

Watch this Scientific Journal Video about Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications at JoVE.com

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K ビュー.  University of Delaware. We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented. 

ビデオ: Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

生物工学

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...