Bu eser İlaç Keşif ve (sırasıyla P20GM104316 ve P30 GM110758-01) Ulusal Ulusal Sağlık Enstitüleri de Generaller Sağlık Bilimleri Enstitüsü Kurumsal Gelişim Awards tarafından finanse edilen Gelişmiş Biyomalzeme, Pew Charitable Ortaklıklarına Delaware COBRE programları tarafından desteklenen (00026178), Ulusal Bilim Vakfı Kariyer Ödülü (DMR-1253906), Burroughs Wellcome Fonu (1006787), ve Delaware Üniversitesi Ulusal Bilim Vakfı IGERT SBE2 programı (L. Sawicki için burs). Yazarlar konfokal mikroskopi için eğitim ve erişim için Delaware Üniversitesi&#39;nde Delaware Biyoteknoloji Enstitüsü Biyogörüntüleme Merkezi&#39;ne teşekkür Bayan Katherine Wiley video çekimi sırasında yardım için Sayın Matthew Rehmann cömertçe kemik iliği Prof. Christopher J izole hMSCs sağlamak için otomatik plaka okuyucu kullanımı için. Kloxin ve Bay Stephen Ma cömertçe veren PHOTOMASKS için, ve Prof. Wilfred Chen. </p&gt;

<ol>
	<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li><li>Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+in+Materials+Science.">Click Chemistry in Materials Science.</a> Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).</li><li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+An+indispensable+tool+to+create+multifaceted+cell+culture+scaffolds.">Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds.</a> ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).</li><li>Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+the+alkyne-azide+cycloaddition+by+photoinitiated+Cu(II)+reduction.">Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction.</a> Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).</li><li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-ene+click+chemistry.">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).</li><li>Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+hydrogels+via+catalyst-free+and+bioorthogonal+&amp;#34;tetrazole-Alkene&amp;#34;+photo-click+chemistry.">In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal &amp;#34;tetrazole-Alkene&amp;#34; photo-click chemistry.</a> Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).</li><li>Burdick, J. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+static+to+dynamic+complexity+in+hydrogel+design.">Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design.</a> Nat Commun. 3, 1269 (2012).</li><li>Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+dynamic+soft+materials+for+three-dimensional+cell+culture.">Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture.</a> Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).</li><li>Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+well-defined+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+prepared+by+thiol-ene+chemistry.">Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry.</a> J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+synthetic+extracellular+matrix+mimic+via+thiol-norbornene+photopolymerization.">A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization.</a> Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).</li><li>Roberts, J. J., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+photopolymerizable+thiol-ene+PEG+and+acrylate-based+PEG+hydrogels+for+cartilage+development.">Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development.</a> Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-norbornene+photoclick+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications.</a> J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).</li><li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+thiol-ene+photoclick+hydrogels+using+facile+techniques+for+cell+culture+applications.">Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications.</a> Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).</li><li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2.">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li><li>Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable,+photoadaptable+hydrogels+via+radical-mediated+disulfide+fragmentation+reaction.">Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction.</a> Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+incorporating+RGD+adhesive+peptide+in+polyethylene+glycol+diacrylate+hydrogel+on+osteogenesis+of+bone+marrow+stromal+cells.">The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).</li><li>Wacker, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+on+RGD-peptide-containing+PEG+hydrogels+in+the+presence+of+sphingosine+1-phosphate.">Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate.</a> Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).</li><li>Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+well-defined+peptide-hydrogel+spacing+and+concentration:+impact+on+epithelial+cell+behavior.">Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior.</a> Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).</li><li>Qiong Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+biodegradable+polyethylene+glycol/+RGD+peptide+hybrid+hydrogels+for+in+vitro+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stern+cellsa.">Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa.</a> Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function.">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).</li><li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids.">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering.">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J Vis Exp. (32), e1590 (2009).</li><li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH/3T3+fibroblasts+in+vitro.">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).</li><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks+Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks.">Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks.</a> Society. 6 (1), 386-391 (2005).</li><li>Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+of+gels+based+on+(hydroxypropyl)+cellulose+methacrylate.">Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate.</a> Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).</li><li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+of+Hydrogel+Scaffolds.">Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds.</a> Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions.">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).</li><li>Mosiewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+cell+manipulation+through+enzymatic+hydrogel+photopatterning.">In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning.</a> Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).</li><li>Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+cytocompatibility+of+six+cell+lines+with+photoinitiators+used+for+polymerizing+hydrogels+and+cell+encapsulation.">Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation.</a> Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).</li><li>Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).</li><li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically+tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions.">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li><li>Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+rates+and+mechanisms+for+radical,+photoinitated+addition+of+thiols+to+alkynes,+and+implications+for+thiol-yne+photopolymerizations+and+click+reactions.">Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions.</a> Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Wylie, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels.">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li><li>Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+solid+supports+for+the+modulation+of+stem+cell+fate.">Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).</li><li>Hudalla, G. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+that+regulate+growth+factor+activity+via+bioinspired+interactions.">Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions.</a> Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).</li><li>Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan prosedür tiyol-en tıklama kimyası oluşturduğu hidrojellerin içindeki hücreleri photoencapsulate için teknikler gösterilmiştir ve daha sonra biyokimyasal ipuçları ile jeller photopattern. Başlangıçta hidrojeller oluşturmak için ışık kullanımı polimerizasyonu öncesinde polimer çözeltisine içinde homojen karışmasını ve hücrelerin süspansiyon sağlar. Hızlı polimerizasyon &#39;kilitler&#39; tanımlı kalıp şeklinde jel ve hidrojel ağ içindeki hücreler askıya kapsüller. Jeller, aynı zamanda, arzu edilen nihai uygulamaya bağlı olarak, çok sayıda farklı şekillerde (örneğin, cam slaytlar veya şırınga ucu) içine kalıplanabilir. ışık alma ince numune içinde sınırlıdır Örneğin, cam slaytlar bağlı hidrojeller 3D kültür kapsüllenmiş hücreler görüntüleme uygulamaları için özellikle yararlıdır. Şırınga kalıplar kısa bir süre içinde elde edilmesi numune daha büyük bir sayı sağlayan hücrelerin hızlı kapsüllenmesi için kullanılabilir (cam slayt ile karşılaştırıldığındaBu sitometrisi veya qPCR akış hücrelerin çok sayıda gerektiren deneyler için kullanılabilir s). Daha sonra, bu jeller daha sonra farklılaşma ya da işgali olarak istenen hücresel tepkiler biyokimyasal ipuçları ile desenli olabilir. 30,31 canlılığı ve metabolik aktivite için Tahliller sunulan malzeme sistemi hücreleri ve desenlendirme koşulları hayatta göstermektedir. metabolik aktivite, hücre fonksiyonu üzerindeki polimerizasyon ve desen koşullarının, ilk etkilerini değerlendirmek üzere bozunmayan jellerinde 3 kadar (RGKGRK peptit çapraz bağ) gözlenmiş unutmayın. Buna ek olarak, bir parçalanabilir peptid ara bağlantı (GPQGIWGQ) ile formüle edilen jellerde sonrası kapsülleme hücreleri canlı ve kültürde 1 hafta yayılır kalmasını destekleyen 1 ve 6 gün sonra hMSCs bir membran bütünlüğü deneyi (ölü / canlı canlılığı / sitotoksiklik boyanma). Ek hücre çizgilerinin canlılığı kişilerce 32 içindeki photopatterning koşulları için bildirilmiştirBurada kullanılan ve ölü / canlı lekelemesi ve metabolik aktivite analizleri kullanılarak tarif hidrojel sistemi için değerlendirilebilir. Bu malzemeler sistemi ve ilgili prosedürler (4.2 ve 4.3) kullanılarak hücre canlılığı ile ilgili sorunlar görülmez iken, bazı hücre tipleri serbest radikal ve / veya ışığa maruz duyarlı olabilir. Bu durumda, kullanıcıların azid-alkin, 12 FXIII, 31 veya Diels Alder tabanlı hidrojel oluşum kimyaları olmayan foto-tetiklenerek malzemeler sistemleri, kullanmayı düşünebilirsiniz. 33 Basit teknikler algılamak ve aynı zamanda (3.1 ve 3.2) sunulmuştur jeller içinde biyokimyasal ipuçları desenlendirme ölçmek için. Reaktifler ticari olarak temin edilebilmektedir ve ek bir sentetik işlem adımları ya da daha pahalı reaktifler (örneğin, floresan etiketli peptid) gerekli olduğundan Ellman tahlili özel bir ilgi çekmektedir. Ellman tahlil tam differe altında biyokimyasal ipuçları ile serbest tiyol modifikasyonu belirlemek için kullanılabilirnt koşulları photopatterning, hem de hızlı bir şekilde desenleri görselleştirmek için. peptid esas kantitatif ölçüsü olarak, peptid birleşme öncesi ve desenlendirme sonra tiyol fonksiyonel grup konsantrasyonunu ölçülmesi için, doğrudan Ellman tayini ile değerlendirilir. Miktar, bu tür floresan işaretli peptidlerin ile yapılabilir olmakla birlikte, 34 görüntüleme tabanlı miktar daha fazla zaman alan işleme ve analiz adımları gerektirir (örneğin, bir kalibrasyon eğrisi, flüoresan-işaretli peptid ve üretim sentezi peptid konsantrasyonuna floresan ilişkilendirmek ) görüntü analizi kullanılarak. Görüntüleme peptid dahil edilmek için, Ellman reaktifı ile doğrudan numune tatbik hemen görülebilir. X ve desen görselleştirme için y düzlemleri ile sınırlı olmakla birlikte, bu teknik serbest tiyol grubu içeren matrisler desenli olup olmadığını tespit etmek için basit, rutin bir yöntem olarak kullanılabilir. Ellman tahlil c olmadığına dikkat etmek önemlidironsidered cytocompatible, photopatterns gözlemlemek ve ölçmek için kullanılabilir iken, bu hücrelerin varlığında yapılamaz. üç boyutlu ve hücrelerin varlığında model oluşturmanın görüntüleme için, hidrojel matrisinin içinde flüoresan peptidlerin konjugasyon güçlü ve yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olarak kalır. desen ebatları Y, x-değerlendirilmiştir edilebilir ve Z-düzlemler konfokal mikroskopi kullanılarak ve desenli bölgeler ya da olmayan desenli bölgelerde hücreleri tespit edilebilir, böylece bu yöntem cytocompatible olup. Birlikte ele alındığında, Ellman tahlil ve görüntüleme tabanlı teknikler araştırmacılar nicelik ve nitelik malzemeler sistem içinde biyokimyasal ipuçlarını photopatterning değerlendirmek için tamamlayıcı araçlardır. PhotoClick, ya da daha geniş foto-tetiklenerek hücrelerin varlığında hidrojellerin oluşumu ve modifikasyonu için kimyaları çoktur. Burada sunulan döküm, kapsülleme ve desenlendirme teknikleri lim değildirtarif edilen malzemenin sistemine SINIRLI ve tiol-alkin, 35 azid alkin, 4 ve tiol-en kimyaları (örneğin, tiol-norbornen), 10,13 yanı sıra ile gibi alternatif ışık tabanlı kimyaları, tatbik edilebilir bu Irgacure 2959, Eozin Y ve Camphorquinone farklı foto-başlatıcılar,. Kullanıcılar yordam parametreleri ayarlamak gerekebilir Not (örneğin, inkübasyon süreleri, polimerizasyon süreleri, hücre yoğunluğu) koşullar, bu diğer sistemler için cytocompatible kalmasını sağlamak için. Model verme işlemi hidrojel (2.2.3-2.2.5) içine Alloc-modifiye edilmiş peptid (ler) in difüzyon gerektirdiğinden, bu işlem integrin bağlanma kısımları (örneğin, peptid ya da hücre dışı matris proteini eklenmesi için en yararlı olduğu kanıtlanabilir ağa ligandın bağlanma hücresi tam integrin aktivasyonu ile çekiş güçleri üretimi için gerekli olan hidrojel, fragmanlar). Not 36, biyomoleküllerin söz konusu olabilirçözelti içinde, immobilizasyon (örneğin, büyüme faktörleri veya sitokinler) üzerine benzer şekilde aktif, hidrojel içine kısmı difüzyon (~ 1 saat) inkübasyon adımı desen sonuçları dürülmüş sinyal olaylarını neden olabilir. Diğer yöntemler kendi desen için büyüme faktörü immobilizasyon veya yerel haciz için kurulmuştur. 37-39 Ayrıca, desen çözünürlük ışığa maruz üzerinde kontrol tarafından belirlenir. Burada, PHOTOMASKS jel derinliği boyunca ve x ve y düzlemlerde desen yaratılmasına izin; Bununla birlikte, jellerin içindeki biyokimyasal işaretlerin desen üzerinde daha fazla aralıklı kontrol da x-desenleri, Y ve Z düzlemleri üretmek için bir iki-fotonlu konfokal mikroskop kullanımı ışınlama alternatif yöntemler ile elde edilebilir. 34,40 Son olarak, yordam içinde kullanılan malzeme sistemi sadece başlangıçta biyokimyasal ipuçları ile modifiye edilirken, dik PhotoClick kimyaları alte sağlamak için kullanılan olabilir dikkat etmek önemlidirBurada sunulan zamanla matris özellikleri rasyon. 12 prosedür ve teknikleri iyi tanımlanmış ve spatiotemporally kontrollü özelliklere sahip sentetik matris oluşturmak için mevcut yaklaşımlara çeşitlilik ekleyin. Özel olarak, bu prosedür içinde kullanılan tepkime maddeleri ve malzemelerinin piyasada bulunabilir olmasına kontrollü hücre kültüründe uygulama için hidrojel bazlı biyo materyallerin kullanımı ile ilgilenen araştırmacılar geniş bir faydalı olacaktır.

Click kimyası giderek artan bir şekilde, seçici, etkili ve genellikle cytocompatible reaktiviteleri nedeniyle, ilaç verme, doku mühendisliği ve kontrollü hücre kültürü dahil çeşitli biyomedikal uygulamalar için malzeme tasarımında kullanılır. Tetiklemek için ışık kullanan 1-3 PhotoClick kimyaları ya tepkimelerini başlatmaya (örneğin, azid-alkin, 4 tiol-en, 5 ve tetrazol-alken 6) biyomalzeme oluşumu ya da değiştirilmesi için özel bir öneme sahiptir. Işıkla meydana hücrelerin varlığında biyomalzeme özelliklerinin kullanım yönelik denetimi için çok uygundur. Özellikle 7,8 Bu reaksiyonlar yapmak yumuşak koşullar ne zaman ve kontrolü altında hızlı oranları, tiol-en PhotoClick kimyaları kullanılmıştır Resim sağlam mekanik özelliklere 5,9 ve de dahil olmak üzere, ancak hücre tipleri, çeşitli kapsüllenmesi için hidrojel bazlı biyo-malzemeler üretmek içinAyrıca, bu kimyaları temel özelliklerini taklit eden biyokimyasal işaretlerin uzamsal desen kullanılmaktadır T hücre kültürü ve teslimi için söz ile, insan mezenkimal kök hücreler (hMSCs), fibroblastlar, kondrositler, ve pankreatik hücre ile sınırlıdır. 10,11 ana hücre microenvironments ve yapışma, farklılaşması ve invazyon dahil olmak üzere uygun hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştırmak. 3,12 Yaygın cytocompatible sırasında hızlı, foto-tetiklenerek polimerizasyonu için akrilatlar ya da norbornenler ( &#39;en&#39;) ile fonksiyonelleştirilmiş polimerler ile reaksiyona sokulur. Işıkla tiol-en hidrojeller, sistein (tiyol) ihtiva eden peptidler oluşturulması için 13, bu araç kutusunu genişletilmesi, biz sağlamayı amaçlayan minimal sentetik işlenmesini gerekli veya sentetik hücre dışı matrisler olarak geniş kullanıma yönelik piyasada mevcut olan yeni, çok yönlü ve erişilebilir yapı taşları ile hidrojel oluşumu için yöntemler.[Bozunmayan ya da hücre-bozunabilir çapraz bağlar için K (hücre yapışmasını [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] ya da iki teşvik etmek kolye bir integrin bağlayıcı gruplar: 14 Spesifik olarak, peptidler (Alloc) alliloksikarbonil modifiye edilmiştir lysines -korumalı Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G ya da KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc sırasıyla]. Bu dizilerin ile koşulları dört kollu tiol ile modifiye edilmiş poli (etilen glikol) (PEG4SH) uzun dalga boylu UV ışığı (365 nm &#39;de 10 mW / cm2) ve cytocompatible dozları kullanılarak hızlı bir reaksiyon (1-5 dakika) için kurulan Foto-başlatıcı, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Elde edilen hidrojeller hafta içinde hücre kültürü koşulları altında kararlı idi. Hücre odaklı bozulması ve biçimlenme etkinleştirmek için, bir enzimatik-bölünebilir peptid jel çapraz bağları (yani, GPQGIWGQ), 15 ve model birincil hücrenin, insan mezenkimal kök hücrelerin (hMSCs) içinde kurulmuş, Durin kapsülleme ve sonra yüksek canlı kaldıBu matrisler içinde g kültürü. Dahası, peptidler mekansal bu malzemelerin içinde desenli edilmiş ve hMSCs yaşayabilir ve photopatterning koşulları altında metabolik olarak aktif kalır. Alternatif kolye peptid dizileri, burada gösterilmemiş olan (örneğin, IKVAV, YIGSR, GFOGER, vs.), ayrıca çevresindeki mikro ek hücre etkileşimleri incelemek için matrisler içine dahil edilebilir. Bu sonuçlar, bir çok hücre tipinde çeşitli çalışma üç boyutlu (3D), hücre kültürü ve teslim edilmesi için bu hidrojel bazlı malzeme uygulama ve doğrudan hücre-matris etkileşimleri için umut vericidir. Burada yöntemler hücreleri photoencapsulate ve önerilen hidrojel sistemi içinde sonradan photopattern biyokimyasal ipuçları (Şekil 1) sunulmuştur. Gözlemlemek ve aynı zamanda bu photopatterns ölçmek için Teknikleri gösterilmiştir: özellikle, i) Ellman testinin nicel ve nitel kullanım modifikasyona belirlemek içindesenli yüzeyler ve floresan peptidler (AF488Pep1Alloc) ii) tamamlayıcı nitel kullanım içinde serbest tiyol tion üç boyutlu bu desenleri gözlemlemek. Bundan başka, deneyler, canlılığı (ölü / canlı canlılığı / sitotoksisite boyama) ve metabolik aktivitesini belirlemek için (MTS, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) kullanıcılar hidrojel matris içinde farklı hücre hatları için photoencapsulation ve photopatterning koşullarının hücre proliferasyonu belirlemek, böylece -2H-tetrazolyum) sunulmaktadır. Protokol, basit bir ışık tabanlı PhotoClick hidrojel sistemi için gösterilmiştir birlikte, teknik hücrelerin varlığında photoencapsulation ve photopatterning için çok sayıda başka radikal olarak başlatılan hidrojel sistemlere uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Custom Peptides</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">4arm PEG Thiol, MW 20k</td>
			<td style="width:161px;">JenKem USA</td>
			<td style="width:123px;">4ARM-SH</td>
			<td style="width:331px;">Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
			<td style="width:161px;">Colorado Photopolymer Solutions</td>
			<td style="width:123px;">Li-TPO</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">149470</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">682519</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">213225</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">360473</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flask, Round Bottom, 100 mL</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1506-05</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1402-L-02</td>
			<td style="width:331px;">Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Magnetic Stir Bars</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Magnetic Stirring and Hot Plate</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vacuum Dessicator</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:161px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:123px;">16630</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14190-250</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Fungizone</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15290-018</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15400-054</td>
			<td style="width:331px;">Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">1.5 or 2 mL sizes, sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-823-16H</td>
			<td style="width:331px;">Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-544-1</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">High-Purity Silicone Rubber, 0.010&#34; Thick, 6&#34; x 8&#34; Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td>
			<td style="width:161px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:123px;">87315K62</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:161px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:123px;">2701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">RainX, Original</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:123px;">800002243</td>
			<td style="width:331px;">May be purchased from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SL2</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Photomasks</td>
			<td style="width:161px;">Advance Reproductions Corporation</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">DTNB; Ellman&#39;s Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">PI-22582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E6758</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S318</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Orthophosphoric Acid</td>
			<td style="width:161px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">33266</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7880</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">L-3224</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">G3582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of speeds at 90-110 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Multiwell Plate Reader</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Epifluorescent or Confocal Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Omnicure Exfo Series 2000</td>
			<td style="width:161px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Zeiss Zen Lite Software</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">NIH</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications

Click kimyaları ilaç dağıtım, doku mühendisliği ve hücre kültürü de dahil olmak üzere çok sayıda biyomateryaller uygulamalarda kullanılmak üzere incelenmiştir. Bu Fotokimyasal tiol-en ve tiol-in reaksiyonlar gibi, özellikle, ışık kaynaklı Click reaksiyonları üzere, malzeme özellikleri üzerinde uzaysal kontrol verecek ve kullanıcı yönelik tesis kontrol yüksek derecede sistemlerin tasarlanmasına izin verilmesi. İmalat ve ışık ve bu tiol-X PhotoClick kimyaları sunduğu çok yönlülük sağladığı hassas kullanılarak hidrojel bazlı biyo materyallerin modifikasyonu, özellikle, iyi tanımlanmış, biomimetik mikroçevrelerde içindeki hücrelerin kültürü için, artan bir öneme sahiptir. Burada, hücreler ve bir tiol-en PhotoClick reaksiyona sokularak polimerize çok yönlü ve modüler yapı blokları kullanılarak hidrojel matrisinin içinde biyokimyasal işaretlerin daha sonra photopatterning arasında photoencapsulation için yöntemler tarif eder. Spesifik olarak, bir yaklaşım co sunulmuşturalliloksikarbonil gelen nstructing hidrojeller (Alloc) işlevselleştirilmiş peptid çapraz bağlar ve asma peptit parçaları ve hızlı bir lityum acylphosphinate foto ortaya koyucu ve uzun dalga boyu ultraviyole (UV) ışık cytocompatible dozlarının varlığında polimerize tiol işlevselleştirilmiş poli (etilen glikol) (PEG) içerebilir. Facile teknikler photopatterning görselleştirmek ve tarif edilmiştir ilave peptid konsantrasyonunu ölçmek için. Ayrıca, yöntemler, kapsülleme hücreleri için özel olarak insan mezenkimal kök hücreleri kurulmuş ve bunların canlılığı ve aktivitesinin belirlenmesinde vardır. Oluşumu ve tiol Alloc hidrojellerin başlangıç desen burada gösterilir birlikte, bu teknikler geniş bir şekilde paternli bir alt-tabakaların üretilmesi için diğer ışık ve radikal başlatılan madde sistemleri (örneğin, tiol-norbornen, tiol-akrilat), bir dizi tatbik edilebilir.

Kurulum ve prosedür, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir hücreleri ve kapsüllenmiş hücreler içeren, daha sonra photopattern jeller photoencapsulate etmek ve hazır solüsyonlarının hazırlanması için bir örneği, bir ağırlıkça% 10 jel Tablo 1&#39; de verilmektedir oluşturulması için. Tablo 1 kullanarak, monomerlerin miktarı (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) ve hidrojeller polimerize etmek için gerekli olan bir ışık başlatan (LAP) hesaplanır. Bu hesaplamalara dayanarak, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc ve LAP stok çözeltileri hazırlanır ve ve şekillendirme ve sırasıyla (Şekil 1A) jeller, photopatterning için Pep1Alloc olmadan karıştırılır. Daha sonra, hücreler plakalardan toplanmıştır, sayılır ve kapsülleme (Şekil 1B) için uygun miktarlarda santrifüjlenir. Hücre peleti jel çözeltisi (PBS içinde peptit / polimer / LAP) içinde tekrar süspanse edilir ve hücre / monomer karışımları cam ya da şırınga mol aktarılırds. Hücreler, ışık uygulanması üzerine hidrojel içinde (Şekil 1C) (10 mW / 365 nm&#39;de cm2 1-5 dakika) kapsüllenir. (Şekil 1D) photopatterning için, jeller polimerize matrise peptid ve başlatıcı dağılmasını sağlayan, 1 saat ve 30 dakika için 30 dakika boyunca Pep1Alloc ve tur ile ıslatılır. Bu peptid-yüklü jeller istenilen desen ile, fotoğraf maskeleri ile kaplı ve matris içinde serbest tioller peptidleri konjüge etmek için hafif (1 dakika) bir ikinci doz maruz kalmaktadır. Kolye bariyerler, sadece kovalent uygun hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştırmak ve in vitro olarak, hücre fonksiyonu ve kaderi tarama doğru ana hücre mikro anahtar mekanik ve biyokimyasal özelliklerini taklit eden, ışığa maruz kalan bölgelerdeki jel ile bağlantılıdır. Ellman tahlili photopatte içinde jel modifikasyonu ve peptid birleşme ölçmek için basit ve ucuz bir yöntem sağlarrned yüzeyler. Desenli olmayan desenli jeller (yani, ya da peptid değişiklik yapılmadan jeller) Ellman reaksiyon tamponu polimerizasyon sonrası ıslatılır. Daha sonra, sistein standartları ve tampon maddesi içinde ıslatılmış jeller 48 oyuklu plakalara konuldu ve Ellman maddesi (sol Şekil 2A) ile birlikte inkübe edilir. 1 saat 30 dakika sonra, numunelerin alikoları, bir 96-çukurlu plaka, tek tek oyuklara yerleştirilir ve emme 405 nm&#39;de kaydedilmiştir. Sistein standartlardan bir kalibrasyon eğrisi (Şekil 2A, sağ) (absorbans doğrusal uyum, konsantrasyon vs) çizilmiştir ve jeller serbest tiyol miktarı kendi seyreltme faktörü dayalı tespit edilebilir. 10 ağırlıkça% jeli çeşitli polimerleştirme ve photopatterning koşulları için bu serbest tiyol konsantrasyonları Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. (Mavi çubuk, I = 1 dak ve II = 5 dk) Pep1Alloc olmadan 1 veya 5 dakika süreyle polimerize jeller t belirten istatistiksel olarak benzer serbest tiyol konsantrasyonlarışapka hızlı bir tepki oluşur ve katılaşma 1 dakika (iki kuyruklu t-testi, p&gt; 0.05) içinde tamamlanır. Böylece, ışık ek maruz (2-5 dakika) işlevsel grupların daha da dönüştürme ile sonuçlanmaz. Pep1Alloc olmayan 1 dakika için polimerize Jeller 30 ve 90 dakika süre ile (3 mg / ml) ve LAP (2.2 mM) (yeşil çubuklar, II = 30 dakika, IV = 90 dakika) Pep1Alloc ile ıslatılmış ve ışık bir ikinci doz maruz bırakıldı 1 dakika karıştırıldı. serbest tioller azalma (1 dakika durumuna göre% 60-80), bu koşullar altında kolye ipuçları ile jellerin etkin modifikasyon gösterir. daha yüksek modifikasyon isteniyorsa, Pep1Alloc çözeltisi artan konsantrasyonları Peptid çözeltileri dönüşüm sınırlayabilir seyreltik fazla serbest tioller Pep1Alloc erişilebilirliği olarak kullanılabilir; Örneğin, / ml Pep1Alloc 20 mg&#39;a kadar konsantrasyonlarda serbest tiol&gt;% 90 dönüşüm üreten bulmuşlardır. Benzersiz peptidlerin desenleri hidrojel ilave olabilirhızla Ellman maddesi (5 dakika altında Şekil 3A) ile görüntülenebilir. Ancak, desen görselleştirme süresi (fazla 5 dakika) jeli içinden sarı TNB 2- dianyonun difüzyon nedeniyle üzerinde kaybolur. Görüntüleme çözünürlüğünü arttırmak ve üç boyutlu (x-, y, ve z uçaklar) ve hücrelerin varlığında kalıplarını gözlemlemek için floresan peptit ilavesi (AF488Pep1Alloc) kullanılabilir. Şekil 3B x- olarak, y ve konfokal mikroskop ile çekilen görüntü yığınlarının z-projeksiyonları desen çözünürlüğü (mikron ölçeği) gösteren gösterilir. Yaklaşık (94 ± 2) ve% parçalanabilir jeller (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) içinde kapsüllenmiş hMSCs (94 ± 1)% kırmızı çekirdekler (birkaç ölü hücreler, sırasıyla, 1 ve 6 gün kapsülleme sonra canlı (yeşil hücre gövdeleri) kalır ) gözlendi (Şekil 4A). Dahası, hMSC sonrası Kapsülleme 6 gün (en görülmektedir yayılan <st<html> Rong&gt; Şekil 4A, içerlek), hücreler bozulmasina ve integrin bağlayıcı RGDS ile modifiye bu MMP-bozunur matrisler ile etkileşim olduğunu belirten. Bozunmayan jeller (Pep2Alloc = RGKGRK) kapsüllenmiş hücreler üzerinde yapılan metabolik aktivite deneyleri 1 ve 3 gün sonra kapsülleme (Şekil 4B) hücre canlılığının bir ikinci ölçü sağlar ve hücreler, test edilen çeşitli photoencapsulation ve photopatterning koşulları için aktif kalması göstermektedir Ellman tahlili (Şekil 2B). Özellikle, Pep1Alloc + LAP (koşullar III ve IV) ve ilk kapsülleme (koşullar I ve II) ile 30 dakika karıştırıldı ve 90 dakika inkubasyon arasındaki metabolik aktivitesi önemli bir farklılık prosedürü photopatterning uygulamalarında için uygun olduğunu gösteren, orada kapsüllü hücrelerin varlığı (t-testi, p&gt; 0.05 iki uçlu). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. Hidrojeller içindeki hücreler kapsüllenmesi ve daha sonra biyokimya ipucu ile photopatterning Kur (A) Makromerlerin ve ışık başlatan stok çözeltileri hazırlanır ve karma (PEG4SH = omurga Pep2Alloc = çapraz bağlama, Pep1Alloc = kolye yapıştırma parçası (RGDS), LAP = foto-başlatıcı ). (B) hücreler kapsülleme için toplanır. (C), hücreler (sırasıyla PEG4SH / Pep2Alloc / örtü ya da PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP) olmayan veya integrin-bağlama peptidleri olan makromer çözeltiler karıştırılır ve ışığa maruz kaldığında kapsüllenir. Jel oluşumu sırasında fazla tiol grupları ihtiva eden (D) jeller (burada, 2 mM fazla tiyol ile oluşturulan PEG4SH / Pep2Alloc / tur,), örneğin, tek bir Alloc grubunun (Pep1Alloc ile işlevselleştirilmiş peptidlerin daha sonra ilave biyokimyasal ipuçları ile desenli olabilir, RGDS, IKVAV, vs.), hücre yapışmasını arttıranjel belirli bölgeleri içinde. Burada, floresan etiketli RGDS jellerin desenleme gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Şekil 2:. Kantitatif Ellman tahlili Kurulum ve sonuçlar desenli hidrojellerinin modifikasyonu değerlendirmek için (A) jelleri ve sistein standartları Ellman maddesi ile 48 oyuklu plakalar içinde inkübe edilir. Doğrusal bir standart eğri jel örneklerinin sistein konsantrasyonunu belirlemek için çizilir. II = 5 dakika polimerizasyonu;, III = 30 dakika inkübasyon Pep1Alloc ile (B) aşırı serbest tioller bir asılı: Alloc-peptid (i = 1 dakika polimerizasyon ile desen üzerine jel oluşumu sırasında hidrojeller için dahil edilir ve tüketilen IV = 90 dakika inkübasyon, wi<html> inci Pep1Alloc; III ve IV hem) polimerize ve 1 dakika boyunca hafif desenli. Gösterilen veriler (3 n =) standart hatayı gösteren hata barları ile ortalama göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Şekil 3:. Ellman tahlili ve fluoresan görüntüler photopatterned hidrojeller görselleştirmek için (A) Ellman reaktifi hızlı x- desenleri (satır) ve y-düzlemi (sarı = desensiz bölgesi, Skala çubuğu = 1 mm) tespit etmek için kullanılabilir. (B) Floresan peptidler y, x- desenleri gözlemlemek için kullanılan ve olabilir z-uçakları (yeşil = desenli bölge; 200 mikron ölçek çubuğu, 10X su daldırma hedefi; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Şekil 4: Canlılık ve bozulmaya photopatterned hidrojellerin içindeki hücrelerin metabolik aktivitesi (A) Örnek konfokal z yığın (z-projeksiyon, 10X su daldırma objektif) canlı bir (yeşil, Ex / Em 488/525 nm) ve ölü hMSCs (kırmızı; Ex / Em 543/580 nm) hidrojeller içinde kapsüllü 24 saat sonrası kapsülleme (Ölçek çubuğu = 200 mikron). 6 gün kapsül (ilave görüntü, Ölçek çubuğu = 50 um) sonra bu hidrojellerin içinde yayıldı hücreler. (I, II = 5 dakika polimerizasyon i = 1 dakika polimerizasyon) ve örnekleme koşulları (III = Pep1Alloc 30 dakika inkübasyon (B) hücreler, 1 ve 3 gün (sırasıyla koyu ve açık çubuklar) çeşitli polimerizasyon için sonrası kapsülleme, metabolik olarak aktif olan , IV = 90 dakika Kuluçkan Pep1Alloc ile; her ikisi de) polimerize ve 1 dakika boyunca hafif desenli. Gösterilen veriler (3 n =) standart hatayı gösteren hata barları ile ortalama göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tablo 1: Örnek kurulum hidrojeller yapmak için stok çözeltileri hacimleri hesaplamak için mavi vurgulanır tablo içinde Hücreleri kullanıcı tanımlı parametreleri belirtir;. diğer miktarlar bu ayarlara dayalı olarak hesaplanır. bir jel yapmak için her stok çözümü için nihai hacimleri turuncu vurgulanır. beyaz hücreler, kullanıcı tanımlı parametrelere dayalı nihai hacimlerini hesaplamak için kullanılan formüller içerir. 2.2 mM LAP bir konsantrasyon 0,067 ağırlıkça% eşdeğer olduğuna dikkat edin.

Watch this Scientific Journal Video about Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications at JoVE.com

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K Görüntüleme.  University of Delaware. We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented. 

Video: Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Biyomühendislik

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

Mezenkimal Stromal Otolog Koşullarında Hücre Kültürü ve Teslimat: Ortopedik Uygulamalar için Akıllı Yaklaşım

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...