著者らは、マイクロインジェクション、だけでなく、匿名のレビュアーからの洞察に満ちたコメントで支援するためのRJサマー＆X王に非常に感謝しています。この作品は、NIHの助成金SC2GM089602によってサポートされています。

1。トランスジェネシス：DNA調製<ol><li>支配的なコインジェクションマーカー：pRL3 [PPA - PRL - 1（tu92）] pRL3プラスミドは、視覚的に成功した形質転換事象を識別するための支配的なコインジェクションマーカーです。このプラスミドは、密接にCでSQT - 1コラーゲン遺伝子に関連するPPA - PRL - 1遺伝子の優性突然変異体対立遺伝子（tu92）をコードする虫やワームの本体軸1,5に沿って時計回りにねじる運動に野生型正弦波運動に変換します。形質転換動物は、C言語で使用されるポピュラーな優性選択マーカーROL - 6（su1006）と非常に似ています過去20年間のエレガンス 。 </li><li>ターゲットレポーター遺伝子：PPA - EGL - 4P：：GFP 目的の遺伝子をシーケンス9をコードするGFPに、転写または翻訳後リンクすることができます。本研究では、PPA - EGL - 4promoter：：GFP（EGL - 4、cGMPの依存性プロテインキナーゼ）は使用いた上流に翻訳開始の2 kbのフラグメントは、P.でGFPの発現を付与することができるかどうかを判断するには、d pacificus PS312。このGFPベクターは、変更されたとのGFPコード領域を含んでいます イントロンと親切にXiaoyue王とラルフJ.ゾマー（マックスプランク研究所、チュービンゲン、ドイツ、EU）が提供する多目的PPA - RPL - 23の3&#39;UTRターミネーター5。 </li><li>ゲノムDNA：PS312 野生型P.の追加pacificus PS312のゲノムDNAは、特にそれらのF 2後代〜5トランスジェニックF 1動物から、安定した導入遺伝子の継承を取得する必要があります。で安定したF 2トランスジェニック系統で観察されたものに似て：ゲノムDNA二つ導入遺伝子（GFPレポーター：共射出マーカーPRL - 3とPPA - EGL - 4P）との複合体の余分な染色体の配列を形成する場合、それはまだ定かではないC.エレガンス 3。しかし、要件が同一のcohesiを共有するためにゲノムDNAと導入遺伝子を持っているためオーバーハングをVEは強く宿主細胞は、適切なDNAの伝達（gDNAをシグマG1N10キットを用いて調製した）のために認識できる複雑な染色体外配列の形成を示唆している。 </li><li> DNA消化 ：GFPベクターDNAと共射出マーカーpRL3とPS312 gDNAのと互換性のある粘着性がオーバーハングを生成する：制限酵素は、PPA - EGL - 4Pを線形化するために使用されます。ボルテックスではない、タップして混ぜる。 37℃で一時間インキュベート℃に</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4μgの</td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>をPstI（10 U /μL） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μL </td></tr><tr><td> PPA - EGL - 4P：：GFP </td><td> 4μgの</td></tr><tr><td> 10倍のバッファ</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>をSalI（10 U /μL） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μlの </td></tr><tr><td> gDNAをPS312 </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> 10倍のバッファ</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> pstファイルIおよびSal I（10 U /μL） </td><td> μlの8 </td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μlの</td></tr></tbody></table> 表1。制限酵素消化のための混合物。 <ol start="5"><li> DNAの沈殿と準備<ol><li>消化産物の1:10〜酢酸ナトリウム（3 M NaCOOCH 3液（pH5.2））と2.5倍の100％エタノールの量を追加し、ペレットを見やすくするためにグリコーゲンの20 ng /μLのを追加。 </li><li> 4℃で15分間14,000 rpmで遠心する℃、 </li><li> tippiによって上清をデカントゆっくりとngの遠心分離管逆さにしてから、ティッシュペーパーで、それをタップすると、ペレットがチューブの底隅に安全であることを確認し、エタノールの自由意思。 </li><li> 75％エタノール1 mlを追加します。 </li><li>すぐに4℃で5分間、14,000 rpmでスピン℃、 </li><li>ゆっくりと上下逆に遠沈管を転倒し、ペレットがチューブの底の隅に固定していることを確認し、エタノールの自由な意思ティッシュペーパーで、それをタップして上清をデカントします。 </li><li> 25から30で5分間14,000 rpmで真空遠心分離で乾燥ペレット° C、乾燥してエタノールの完全にフリーになるまで。 </li><li> TEまたは滅菌のdH 2 Oを30μlを加え、℃で混合簡単に前にボルテックスで4℃で一晩おきます。 </li><li>表2は、注射のための各精製したDNAから注入混合物を作成する方法について説明します。 </li><li> -20℃で保存注射用混合物を融解後、かもしれない破片の粒子を取り除くために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン注射針を詰まらせる。 </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 遺伝物質 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> PPA - EGL - 4P：：GFP（SalIで） </td><td> &gt; 5 ng /μlに（0.1-10ng/μl） </td></tr><tr><td> pRL3（PstIで） </td><td> &gt;は1 ng /μL </td></tr><tr><td> gDNAをPS312（PstIで+をSalI） </td><td> &gt; 60 ng /μLの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 30μlの </td></tr></tbody></table> 表2。PPA - PRL - 1注射混合物 2。 RNA干渉：in vitroで二本鎖RNAの合成で <ol><li>目的の遺伝子を増幅するPCRを使用してください。 RHL091 5&#39; - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3&#39;（BamHI部位）とRHL092 5&#39; - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3&#39;（PstIサイト）は、464 bpのゲノム断片を増幅したPPA - PRL - 1（tu92）対立遺伝子を含むpRL3ベクトルからメンター（位置3から466まで）。 </li><li> BamHIおよびPstIでPCR産物を消化。 </li><li>をBamHI / PstIで消化pL4440 RNAiの給餌ベクトル2への断片をライゲーションする。 </li><li>コンピテント細胞に挿入されたベクトルを変換し、アンピシリンLB培地プレート（50μg/ mlの）上に成長する。 </li><li> T7プライマーを用いたPCRにより、正常に挿入ベクトルを選択してください。 </li><li> BLOCK - ITのRNAi合成キット（Invitrogen）を用いて）二本鎖RNA二本鎖RNAを作るためにPRL - 1遺伝子を含むPCR産物を両側にT7を使用してください。 </li><li> &gt; 200 NG /注射用溶液、最大1μg/μLの場合dsRNAの濃度は最高です。 </li><li> -20℃で保存注射用混合物を融解後、注射針を詰まらせることができる破片の粒子を除去するために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン。 </li></ol> 3。マイクロインジェクション：導入遺伝子および/またはdsRNAの注射のためのプロトコル<ol><li>注射針<ol><li>温度：ナリシゲ針プラーを（PC - 10モデル＃）に設定します： <ol><li>に底のつまみを回して、&quot;第2のヒーター。&quot; </li><li> &quot;第2のヒータAdjを。&quot;回しパネルまでのノブは様々な長さのテーパー針の先端のための55.0から60.0 ° Cを読み取ります。 </li></ol></li><li> （一度に針を引っ張る）&quot;ステップ1&quot;に戻って一番下のノブを回します。 </li><li>チャンバー内に針をロードし、それが安全であることを確認してください。 </li><li> &quot;スタート&quot;ボタン（赤いボタン）を押すと針はすべての重み（これは反対方向に2つの同一の針を作成してください）​​でプルアップすることができます。 </li><li>針に蓄積からほこりを防ぐためにプレードウによって所定の位置に固定プラスチック培養プレートでチャンバーとストアからニードルを取り外します。 </li></ol></li><li>取付パッド<ol><li> 1.5 mlの遠心管に、H 2 O 1ml中にNoble寒天の0.02 gを追加して2％ノーブル寒天溶液を作る寒天は、4 °年度までのCで保存することができる。 </li><li>完全に混和し、&gt; 88℃に設定したヒートブロックに寒天を溶かす</li><li> 1 mlのマイクロピペットを用いて、スライドガラスの中央（フィッシャー、12 544 - F）に液体2パーセントNoble寒天のドロップを置きます。 </li><li>ドロップの上に別のスライドガラスを配置することで平らに。 </li><li>五スライドガラスの層があるまで&quot;ドロップステップを&quot;繰り返します。 </li><li>お互いからスライドガラスをスライドさせて、各ガラススライドを削除します。 </li><li> 70℃の真空オーブン中でスライドガラス上の寒天パッドを平らに乾かし℃で一晩に4時間（または室温で一晩）。 </li><li>将来使用するために複数の注入パッドとストアを行います。 </li></ol></li><li>雌雄同体の生殖腺へのマイクロインジェクション</li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> 図1。 P.の概略図pacificusの解剖学。明確な有核細胞は、雌の生殖細胞（卵母細胞）であり、灰色の網掛け部分は腸です。唯一の遠位前生殖腺が表示されますが、2つの遠位生殖腺が半ば体の近くに背側に互いに交差に気づく。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> 図2。マイクロインジェクションの画像。（A）注射針の先端が引っ張らキャピラリー部分の右端のラインにフォーカスされている。それでも鋭いポイントを保持しながら、軽くその辺に針の先端に触れることにより、針の先端が切断してください。 （B）上に針の挿入はちょうど、最初の注射のための腸内の曲率の上に生殖腺。 （C）底部に針の挿入はちょうど目の注射のための腸内の曲率の下に生殖腺。 <ol start="3"><li><ol><li>コントラストとDIC剪断設定は両性生殖腺を表示するための理想であることを確認してください。 </li><li>引っ張らキャピラリー針に注入混合物の1.0から2.0μlをロードする。 </li><li>マイクロインジェクションのマニピュレータに針を置き、窒素タンクの圧力計は理想的な条件（10〜20 psiに設定する必要があります。0.5から1秒間）。 </li><li>スライド（図2A）上に配置薄く引かキャピラリーチューブの端にわずかに触れて、針の先端を破る。 <ol><li>針ブレーカのスライド：プルオイルを一滴でスライドガラス上に配置キャピラリーの最薄部</li></ol></li><li>針が壊れているしたら（P. pacificusは彼らドライアウトする前に注射のために5分のウィンドウを持っていると死ぬ）パッドにあなたのワームを選んでいる間はアイドル位置に位置することができます。 </li><li> J4 -若い成虫のフルプレートを使用して、ちょうどOP50細菌の芝生内のすべてのワームをカバーするのに十分なパラフィン油を（重い）注ぐ。 </li><li>ワームを選択し、注入パッドの上に置きます。 </li><li>位置針と離れて針（図2B、2C）から外陰部の方向にワームの生殖腺、顕微鏡でのワームのガラススライドを置きます。 </li><li>顕微鏡の視野の位置に針を下ろします。 </li><li>同じ焦点面（図2B）のトップ生殖腺と針を合わせます。</li><li>注射の混合物にゆっくりとワームとポンプを突く、遠位端に向かって分離ooctyesが導入遺伝子またはdsRNAを配信を最適化するには成功した注射を（示すためには、注入時には、遠位に近くなるまで続けて生殖腺の拡大の波が見えるはずヒント）。 </li><li>下の生殖腺に注入し、注入を繰り返すように針の位置を、この生殖腺は、消化管の下にあるしかしながらので卵母細胞の広がりが見られるため、より困難に達成することである（図2C）されません。 </li><li>通常の探してこのワームは、注射後の成功注入を示し、損傷した生殖腺（外陰部から突き出たまたは体腔内ポップ）があってはならない。 </li><li>アイドル位置にニードルバックを置きます。 </li><li>ワームを救うために準備する。 </li><li>注入されたワームが配置されているパッドの上にM9バッファーの低下（0.5μl）を追加します。 </li><li>お好きなものをいくつかOP50バクテリアを使用して、OP50とワームに触れ、そしてそれは守らなければならない。 Weは口のピペットを使用しないでください。 </li><li> OP50の50μlのスポットを接種したプレートの上にワームを配置、2-4ワームはそのようなプレートに救出することができます。 </li></ol></li><li>遺伝子導入のためのポスト噴射ストレージ＆スクリーニング<ol><li> 20℃で注入したワーム（P 0）を格納° C〜4日間、卵を産むとF 1を成長する。 </li><li>選択された表現型（PPA - PRL - 1優性マーカーを発現しているローリング動物のための遺伝子導入、検索用画面へ）のため4日目の画面のワーム。 </li><li>単一の独立したF 1ピックアップ、秒&#39;25で新しいシードプレートとストアに観察された表現型との動物を° Cこの温度は、F 1から安定した線の形成を促進&quot; </li><li>独立したF 1行から単一のF 2。個々のF 2行は同じような導入遺伝子の伝達率を持っている。私たちはしばしば、変換F 1動物当たり&gt; 15 F 2行を取得します。 </li><li> 25℃で、その後の世代保存</li><html><li>各々のラインのために：ローラーの伝送速度は、通常、それゆえに、ターゲット遺伝子の発現レベルを（GFP：PPA - EGL - 4P）を決定するために、この時点で必要な、F 4世代後に一定のままである。 GFPの発現は、支配的なローラーの表現型の浸透の程度と相関しないことがあります。 </li></ol></li><li> RNAiの表現型のポスト噴射ストレージ＆スクリーニング<ol><li> 20℃で注入したワーム（P 0）を格納° C〜4日間F 1を置くと成長する。 </li><li>選択された表現型（RNAiノックダウン表現型をスクリーニングするために、標的遺伝子の活性の損失に関連する可能性がある浸透表現型を検索し、我々の場合におけるPPA - PRL - 1表現型の損失）のため4日目画面F 1のワーム。 </li><li>我々の経験では、非ローラーノックダウン表現型は、F 2の&gt; 97％が失われている。 </li></ol></li></ol> 4。代表的な結果： <html>遺伝子導入のp&quot;&gt; 1。結果<table border="1"><tbody><tr><td> セッション </td><td> 注入されたP 0 </td><td> F 1ローラー </td><td> ％トランスジェニックF 2 </td><td> F 2の後に平均％の透過 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> （1行目）0％ （ライン2）13パーセント</td><td> NA 13パーセント± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> （3行目）0％ </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0パーセント</td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> （4行目）0％ </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0パーセント</td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> （5行目）26％ </td><td> 22パーセント± 10 </td></tr></tbody></table>クロスしなかったコンテンツ&quot;&gt; *男性ローラー、NA：該当なし ：GFP（サル私は消化）、pRL3（ローラー）（PST私は消化）、とgDNA PS312（PstIおよびSalIでの消化）：。PPA - EGL - 4Pと注入されたPS312の表3の結果。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> 図3（A）野生型（B、C）安定したF 4 pRL3、PPA - EGL - 4P：：ヘッドニューロンGFPの発現を示すGFPトランスジェニックライン。 2。 RNA干渉の結果<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> 図4。 RNAが注入されたPRL - 1変異体では、&quot;ローリング&quot;運動の完全なノックダウンを示しています。（）PRL - 1ローラーの機能獲得型変異体tu92。 （B）PRL - 1変異体展示正常な野生型の姿勢や運動を&quot;ノックダウン&quot;。 （C）PRL - 1（下）もある長いB注入されたPRL - 1変異体（上部）よりody。 （D）注入PRL - 1（下）の長い体は野生型PS312（上）よりも長いもです。長い体の表現型は、CのROL - 5（SQT - 1）RNAiノックダウンが観察されたelegansの N2（データは示さず）。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ロール </td><td> 非ロール </td></tr><tr><td> PRL - 1本鎖RNA（200 ng /μlに） </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B PRL - 1本鎖RNA（ng /μLの1000） </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td>の制御</td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> 表4。PPA - PRL - 1 dsRNAを注射のまとめ。 （A）[二本鎖RNA] = 200 ng /μlに、（B）[二本鎖RNA] = 1000 ng /μlに。 P =それぞれ200および1000 ng /μLの注入のための両側フィッシャーの正確確率検定、、、で0.0019と0.041。

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

P. pacificusの集団は、世界の様々なコガネムシの種と密接に関連して発見し、自由生活と寄生線虫の中間のモデル線虫であるされています。 P.の強さ新興モデル生物としてpacificus、公正な前進遺伝子スクリーニング（ すなわちだけでなく、以前にC.エレガンスを特徴とする候補遺伝子のための）6,10から分離された変異体の位置的なマッピングを促進し...

<table border="1"><tbody><tr><th>製品： </th><th>カタログ番号： </th><th>サプライヤー： </th></tr><tr><td> DMI3000インジェクション顕微鏡</td><td> DMI3000 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>マイクロインジェクターのマニピュレータ（ダイレクトドライブ） </td><td> Narashige BC - 3ボールジョイント</td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td> Narashige PC - 10 </td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター™全てのデジタルマルチ圧力システム</td><td> Narashige MINJ - D </td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td> GeneElute™哺乳類のゲノムDNAミニプレップキット</td><td> G1N70 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> pJetクローニングジェットキット</td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJETプラスミドミニプレップキット</td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNAクリーン＆コンセントレータ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO研究</td></tr><tr><td> BLOCK - IT™RNAiのTOPO ®転写キット</td><td> K3500 - 01＆K3650 - 01 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>ディフコ™寒天ノーブル</td><td> DF0142 - 15から2 </td><td>フィッシャーScientifi </td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス（1.5 - 0.16〜0.19ミリメートルの厚さ、サイズ：50 × 45ミリメートル） </td><td> 12から554 - F </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー（フィラメント） </td><td> 615000 </td><td> AMシステム</td></tr><tr><td>パラフィンオイル（ヘビー） </td><td> O122 - 1 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386 - 500 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 </td><td> AC20651 - 5000 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BP3581 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> M80 - 500 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

それは、RNA干渉と安定した遺伝子導入による遺伝子機能と発現解析-深さで、さらに、完全に配列のゲノムを取得し、特定の解剖学と生物の分子細胞生物学のために多くの種に限られている。ために新たなモデル生物にとってますます手頃な価格ですが、例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans）3を含むクラウングループの線虫の外で、非線虫種で安定的に伝送されるトランスジェニック系統は、 糞線虫 4とPristionchus pacificus 5の例外を除いて、このもっともらしい門（線虫）で報告されていない。 P.の拡大する役割を容易に開発、進化、そして行動6-7の研究ではpacificusは 、我々はここにトランスジェニック動物や遺伝子のRNAiによるノックダウンを行うためのマイクロインジェクションを使用する現在の方法を説明します。の生殖腺のような<em&gt; C.虫や他のほとんどの線虫、P.の生殖腺pacificusは syncitialと直接マイクロインジェクションによって提供される卵母細胞にDNAとRNAを組み込むことが可能です。 C.とは異なり、 P.の虫はしかし、安定した導入遺伝子の継承と身体表現pacificusは、ターゲットの導入遺伝子と共射出マーカー5の両端に相補的なエンドヌクレアーゼで消化し ​​、自己ゲノムDNAを追加する必要があります。キャリアのゲノムDNAの添加は、 糞線虫 4とCの生殖細胞における遺伝子発現のための要件と同様ですエレガンス 。動物の独自のゲノムDNAの特定の要件がある場合は、それが明らかでないため、P. pacificus相馬は非複雑なマルチコピー遺伝子またはP.でその染色体外配列を黙らせるには非常に効率的です。 pacificusは、有糸分裂時の適切な動原体のアセンブリのためのゲノム配列が必要です。二軍の腹の移行（二子宮の）雌雄同体の生殖腺では、さらに個々のワーム8の両方の生殖腺を注入する能力を複雑にしています。我々はまた、ノックダウン、非ローリングF 1子孫を得るために生殖腺に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することにより、優性突然変異体を（ローラー、tu92）にマイクロインジェクションの使用方法を示しています。 C.とは異なり、 虫 、他のほとんどの線虫のように、P. pacificus PS312は、餌と浸すため、dsRNAをsyncitial生殖巣にマイクロインジェクションによって投与されている必要がありますを介して全身性のRNAiを受け入れるではありません。この現在の研究では、PPA - EGL - 4プロモーターを変換するために必要なマイクロインジェクションのプロセスを記述することを望む：：GFP融合レポーターとノックダウン支配的なローラーPRL - 1（tu92）視覚的に有益なプロトコルの変異体。

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;、進化の発達、および行動生物学の研究のため。

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

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Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K ビュー.  California State University. RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して Pristionchus pacificus、進化の発達、および行動生物学の研究のため。

ビデオ: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

ローカライズされたRNAiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAiのエフェクターの細菌配達：Transkingdom RNAiの

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...