私たちは、イメージングのためのMITのホワイトヘッド研究所でウェンディサーモンとケック施設のニッキー・ワトソンに感謝します。

DC2.4およびRAW 264.7細胞株の作製注：マクロファージ様細胞株RAW 264.7及び樹状細胞株DC2.4両マウス起源であり、以下の条件が細胞を増殖するために使用しました。 <ol><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃、10％不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM（ダルベッコ最小イーグル培地）でRAW 264.7細胞を増殖させます。 </li><li> L-グルタミンの代わりにDMEMを補っ使用RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）培地を除き、RAW 264.7細胞のものと同様の条件でDC2.4細胞を成長させます。 </li></ol> 2.蛍光共役微粒子の調製： カンジダ・アルビカンス 、ザイモサン、IgGをコーティングしたビーズ<ol><li> カンジダ・アルビカンスの成長 <ol><li>ウリ（2％バクトペプトン、1％を補充したYPD 25mlに凍結グリセロールストックからC.アルビカンス株 SC5314に接種酵母エキス、2％グルコース、一晩30℃で80 / mlのウリジン）。 注：OD 12の600よりも多くのカンジダ培養物を増殖することは避けてください。 </li><li> カンジダ・アルビカンスの1ミリリットルを取り、室温で5分間、2000×gでスピンダウン。 </li><li>上清を吸引除去し、1mlのPBSでペレットを再懸濁。 </li><li>室温で5分間、2000×gで遠心分離することによってペレットを収集します。 </li><li>手順を繰り返し2.1.4。 </li><li>食細胞の数との関係でカンジダ・アルビカンスの感染多重度（MOI）を計算し、1の部3アンOD 600で説明したように、食作用アッセイを続行すると、1ミリリットル当たり2.5×10 7 カンジダ・アルビカンスと同等です。 注：カンジダ-BFPの生成は文献13に記載されています。 </li></ol></li><li> ザイモサンおよびIgGでコーティングされたビーズの調製 注：ザイモサンは、βグルカン含有されていますサッカロマイセス・セレビシエ由来の真菌炭水化物微粒子製剤。ザイモサンは、マクロファージおよび樹状細胞における炎症性シグナルを誘発することが知られ、それは13食作用の研究に広く用いられている14、15。 <ol><li>簡単に言うと、微粒子が含まれているチューブをボルテックスし、1.5mlチューブに実験のための十分な量を分取。 注：一般的に、我々は（1セルのために、10ザイモサン粒子またはIgGでコーティングしたビーズを追加）1:10を使用します。 </li><li>氷冷PBSの1ミリリットルを加え、10,000×gで1分間遠心分離して粒子を収集します。 </li><li>上清を吸引し、1mlの氷冷PBSでペレットを再懸濁。 </li><li>手順を繰り返します2.2.2-2.2.3 注：2.2.5ステップまたは使用するまで4℃でチューブを格納するために進んでください。 </li><li>回避するために、超音波浴超音波処理器（120 V、50〜60 kHzの）中で10秒間微粒子を超音波処理NYの粒子凝集。 </li></ol></li></ol> 3.食作用注：食作用は、粒子の表面上のリガンドとのPRRの相互作用を介して食細胞の細胞表面上の粒子の結合から始まる複雑なプロセスです。結合は、アクチンのアセンブリとの接触部位でその関連タンパク質、および貪食カップの形成が続いています。その後のアクチン解体はファゴソームで発生し、粒状の完全な貪食になります。私たちは食作用のさまざまな段階を説明し、以下に。 <ol><li> 結合分析 注記：この実験の目的は、標的粒子上のリガンドおよび貪食細胞上の受容体との相互作用を伴う食作用の第一段階を監視することです。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 Alternatively、カバースリップ（24または12ウェル形式）またはガラス底の96ウェルプレート上にプレート細胞。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。 </li><li> 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を配置します。 </li><li>優しくピペットまたはアスピレーターを用いて、各ウェルから培地を除去します。 注意：チャンバーカバーガラスシステムの各ウェルが小さい慎重にこの手順を実行します。ピペットの先端またはアスピレータの強い気流で細胞を乱すことは容易です。 </li><li>細胞培養培地を用いて、蛍光標識された粒子を混合する（上記のように調製しました）。細胞に、（10のMOIで）、蛍光共役ザイモサンまたはラテックスビーズウサギIgG-FITC（1細胞当たり10粒子） カンジダ -BFPを追加します。すべてのセルがカバーされることを保証するためにも1室のために200μlの培地の最終容量を使用してください。 </li><li> 277でチャンバースライドをスピンダウン10℃で3分間XG。 注：この遠心分離工程は、微粒子と細胞の間の接触を増加させるのに役立ち、これは、結合プロセスを同期させます。 </li><li>すぐに5分間、5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送します。 </li><li>インキュベーターからチャンバースライドを削除し、メディアを吸引除去します。 </li><li>細胞を氷冷PBSで3回洗浄します。 注：光学顕微鏡で結合していない粒子の存在を確認し、必要に応じてPBSで複数回洗浄します。分析中にバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために井戸から結合していない粒子を除去することが不可欠です。 </li><li>室温で30分間インキュベートすることにより、PBSで希釈した500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加えることにより細胞を固定。 注意：このステップは非常に、毒性、腐食性、および潜在的な発がん性物質である4％PFAを使用する必要があります。この液体を使用する際に適切な注意が取られるべきです。また、光からサンプルを保護します。 </li><li&gt;チャンバー内に500μlのPBSを加えることによって、細胞を洗浄し、溶液を穏やかに吸引除去します。 </li><li>二回3.1.9手順を繰り返します。 注：このステップでは、直前のPBSを除去した後、各バイアルを補充します。 </li><li> 10分間、PBS中の50mMのNH 4 Clを500μlとインキュベートすることにより固定を停止します。 </li><li>ステップ3.1.10で説明したように、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>室温で30分間（PBS中0.1％サポニン、0.2％BSA）結合緩衝液250μLを添加することにより細胞を透過性。 </li><li>蛍光共役ファロイジン（：結合緩衝液中で1：500に希釈）を添加することにより染色F-アクチン。室温で1時間細胞をインキュベートします。 </li><li>ステップ3.1.10で説明したようにPBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>共焦点顕微鏡（63X対物レンズ、および402 nmおよび488 nmレーザー）を使用して画像をキャプチャし、ImageJの16を使用して画像を分析。 注：結合に成功粒子は、食のCuの存在によって特徴付けられます粒子状の接触食細胞（ 図1）サイトのp。ステップ3.2.5を参照してください。 </li></ol></li><li> 貪食取り込みアッセイ 注記：この実験は、共焦点顕微鏡（ 図2）を用いて食細胞による蛍光標識された粒子の完全な内在化を監視するように設計されています。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。代替的に、カバースリップ上にプレート細胞またはガラス底の96ウェルプレート（24-または12-ウェル形式）。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。 </li><li> 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を保管してください。 注：冷却はエンドサイトーシスをブロックするためだけでなく、不要な食作用に必要であり、その後同期食作用を有すること。 </li><li> PERF3.1.3から3.1.5へのORMのステップ</li><li> 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送し、そして異なる時点インキュベート。 30、60および90分後の感染後に細胞を固定。 C.アルビカンスは、60分後の感染に菌糸を形成し始める観察します。食細胞は、90分8後の細胞死（pyroptosis）を示し始めます。 注：これは推奨され、最適化は、細胞の種類や粒子状に応じて必要不可欠です。 </li><li> 3.1.7から3.1.15までの手順を実行します。 ImageJの16を使用して画像を分析します。 注：成功した取り込みは食細胞の細胞質内部の微粒子を完全に内在化することを特徴とする（ 図2）。このようなファロイジン等の細胞表面マーカーで食細胞を染色すると、細胞の輪郭を描くのに役立ちます。粒子が細胞表面またはCOMPLに結合しているかどうかを決定するために、Zスタックを実行するためにも不可欠ですetely内在化。 </li></ol></li><li> 貪食のライブイメージング 注：このプロトコルでは、我々は、蛍光共役ザイモサンを用いて、食作用の異なる段階を捕捉するために、共焦点顕微鏡の使用を記載しています。我々は安定してmCherryをタグ付きF-アクチン8を発現する樹状細胞株DC2.4、生きた細胞内の繊維状アクチンの分布を示しているバイオセンサーを使用しています。食作用は、アクチン駆動プロセスであるので、このセル内のライブイメージングは、F-アクチンネットワークの動きとダイナミクスをキャプチャするだけでなく、生きた細胞（ 図3、映画1）内の異なる食細胞のイベントを可視化することを可能にするだけでなく。 <ol><li>それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、濃度のチャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。 注：細胞は、血球計数器または使用してカウントすることができます同様の技術。 </li><li> 10分間氷上でチャンバースライドにしてください。 注：冷却は望ましくない取り込みをブロックするために必要であり、同期食作用を有すること。 </li><li> 3.1.3から3.1.5への手順を実行します</li><li> 37℃に顕微鏡ステージを予め加温し、5％CO 2を用いてチャンバを平衡化。撮影を開始する前に安定させるために、温度およびCO 2のために30から45分を待ちます。 注：CO 2と温度レベルは食作用のために重要であるので、環境室を平衡化するために、実験前に、顕微鏡用ヒータをオンにすることが重要です。 </li><li> 37℃、5％CO 2で平衡化した顕微鏡インキュベーターエンクロージャ内の細胞を含むチャンバースライドを置きます。 </li><li>ライブイメージング17、18を実行します 。 注：レーザパワーの設定（ゲイン、ピンホールなど ）番目の種類に応じて変えることができます電子顕微鏡と蛍光プローブを使用します。したがって、我々はあなたのライブイメージング17,18のための最適条件のための顕微鏡のマニュアルに相談することをお勧めします。 <ol><li>ライブイメージングのための共焦点レーザー走査顕微鏡（および関連するソフトウェア）を使用します。 1から1.1エアリーユニットのピンホールで63X 1.4NA油の目的を使用してください。 </li><li>撮影を開始するには、チャンバースライド上の代表的な地域を見つけるために、明視野を使用していました。次に、ソフトウェア上の位置のオプションをクリックしてフィールドを選択します。 488と582 nmの間の波長を検出するために、582 nmでのビームスプリッタを用いて488 nmレーザーのフィルタセットを使用トラック1にGFPを検出します。 </li><li>トラック2にmCherryを（RFP）は578 nmでビームスプリッタを使用し、578〜600nmの波長を検出するための最適なフィルタセットを選択します。 50％のレーザー出力と600から700のゲイン出力と488 nmおよび578 nmのレーザーを使用してください。 90分の合計のための画像を30秒ごとに取得します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors declare no conflicts of interest.

例えば、マクロファージや樹状細胞などのプロフェッショナル食細胞、飲み込みため、侵入病原体宿主防御システムの重要なコンポーネント食作用を作る排除。このプロセスの間に食細胞は、その細胞表面8、19、20で大規模な膜の再編成および細胞骨格再配列を受けます。よりよいこのダイナミックなプロセスを理解する?...

例えば、細菌、ウイルス、真菌などの病原体への連続暴露にもかかわらず、私たちの体はよく感染に対する保護を提供する免疫機構が装備されています。自然免疫系は、侵入する病原体に対する防御の第一線であると認識し、外国人のターゲットを内在食細胞に主に依存しています。 食作用は、0.5ミクロンより大きく、不要な粒子の飲み込みを含む進化的に保存された細胞プロセスです。食細胞は、飲み込み3の前に、病原体上に存在する病原体関連分子パターン（PAMP）を認識することを可能にする細胞表面に（また、パターン認識受容体のPRRとして知られる）は、免疫受容体の広い範囲を表します。結合病原体は、細胞表面での受容体のクラスター化が続き、食作用カップの形成をトリガします。これは、周りに突出しているアクチン駆動膜リモデリングをもたらしますターゲットは、最終的にそれを包むとピンチオフする離散ファゴソーム液胞2,5を形成します。ファゴソームは、その後成熟し、ファゴリソソーム6を形成後期エンドソームとリソソームとのその後の融合によって酸性化。 食作用は、受容体媒介とアクチン駆動型のイベントとして記載されているが、このプロセスはまた、ホスホイノシチド（主任研究者）とスフィンゴ脂質7、8などのプラズマ膜を構成する脂質の空間的・時間の変更に依存しています。アクチン重合を貪食カップの基部にホスホイノシトール-4,5-二リン酸（PI（4,5）P 2）の局所的蓄積によって決定されているが、アクチン脱重合は、（PI（4,5）Pの変換に依存します2にするホスホイノシトール3,4,5-をビホスフェート（PI（3,4,5）P 3）3、9。両方の修正ターゲットの周りの偽足の成功延長前者リードとして不可欠であり、後者は、食細胞10の細胞質ゾル中の粒子の沈降を可能にします。 貪食する能力を有する細胞は、マクロファージ/単球、顆粒球/好中球のような専門の貪食細胞、および繊維芽細胞および上皮細胞11として樹状細胞（DC）またはノンプロ食細胞、のいずれかです。プロの食細胞によって行われる食作用は病原体に対する自然免疫と適応免疫応答の調整を担当している間、すべての食細胞によって行われる食作用は、組織維持およびリモデリングにおいて中心的な役割を果たしています。プロフェッショナル食細胞は、適応免疫系のリンパ系細胞にも存在する抗原を巻き込むと病原体を殺すが、ありません。従って、これは、につながる、炎症性サイトカインの放出およびリンパ系細胞の係合に寄与します感染12の成功封鎖。 従来の生化学的手法は、このような翻訳後修飾とタンパク質との間の様々な高親和性の関連付けなどの食作用中に異なる細胞過程の分子機構に関する知識を得るに尽力してきました。しかし、従来の生化学的方法を用いて、食作用事象の空間的および時間的動態に関する情報を得ることは困難です。ライブセルイメージングだけでなく、私たちは時間に敏感な方法で細胞イベントを監視することができますだけでなく、単一細胞レベルでの情報を得るために私達を可能にします。ここでは、食作用の異なる段階を調査するため、並びに、共焦点顕微鏡を使用して時空間的に全体のプロセスを分析する方法を記載します。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Minimal Eagle&amp;rsquo;s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122&quot;&gt;15-140-122&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 with grids</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the early stages of phagocytosis

哺乳動物の体は、病原体の侵入から身を守るために役立つメカニズムの様々な層が装備されています。このような好中球、樹状細胞、およびマクロファージなど- -免疫系のプロフェッショナル食細胞が検出され、食作用1を介して、このような病原体の侵入をクリアする生得的な能力を保持します。食作用は、細胞表面2、3における膜の再編成とアクチンリモデリングの振り付けイベントを伴います。食細胞が正常に内在し、食作用のすべての段階が満たされた場合にのみ、外来分子を根絶します。これらのステップは、認識し、細胞表面に存在するパターン認識受容体（PRR）によって病原体の結合は、粒子を取り囲むようにアクチンに富む膜状の突起（偽足）を介して貪食カップの形成、およびファゴソームの切断がファゴリソソームの成熟が続くことが含まれますで結果病原体3、4の殺害。 食作用の様々な段階のイメージングと定量化は、この細胞過程の分子機構を解明するためのインストゥルメンタルです。本原稿は、食作用の異なる段階を研究するための方法を報告します。私たちは、結合、貪食カップ形成を可視化し、定量化するための顕微鏡ベースのアプローチを説明し、食細胞によって微粒子の内部。食作用が起こると食細胞上の生得的な受容体が0.5μmよりも大きい標的粒子上のリガンドに遭遇したとき、私たちはここに提示アッセイは、病原性真菌カンジダ・アルビカンスなどザイモサンなどの他の粒子とのIgG被覆ビーズの使用を含みます。

食作用の様々な段階を監視するための顕微鏡ベースの方法が提供されます。 DC2.4細胞による様々な蛍光粒子の貪食中に異なるイベントが示されています。ここに記載された技術を用いて、我々は、食作用の初期段階においてスフィンゴ脂質の役割を調べました。この目的のために、Sptlc2、スフィンゴ脂質生合成経路における第一及び律速段階を触媒する酵素で遺伝的に欠損DC2.4樹状細胞を用?...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

食作用の初期段階の可視化

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K ビュー.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

ビデオ: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

免疫・感染学

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

IgGオプソニン化赤血球のマクロファージ食作用のリアルタイムイメージング

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

食作用の初期段階の可視化

要約

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真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

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マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

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マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

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