この共培養法は、間葉系幹細胞調節のマクロファージ食細胞調節の背後にある細胞接触機構を取り巻く主要な質問に答え、したがって、自然免疫を調節するMSCの役割を明示するのに役立ちます。この手法は、ハイスループット分析で適用できます。pH感受性の色素に結合した生体粒子は、酸性ファゴリソソーム環境でのみ蛍光を発する。
そのため、洗浄と焼入れが必要です。この方法は、好中球および他の食細胞を含む様々な共培養モデルにも適用することができる。この手順のデモンストレーションは、現在私の研究室の学部生であるイーサン・チェトコフです。
まず、培養間葉系幹細胞の合流性を観察する。70~80%の合流が達成されると、培養細胞から培養液を100ミリメートル皿に吸引し、5ミリリットルのPBSを加える。PBSを吸引した後、0.05%トリプシンEDTA溶液の2ミリリットルを加え、細胞を3分間インキュベートします。
3分後、逆顕微鏡を使って細胞剥離を確認します。そして、細胞が剥離されていない場合は、再び1〜2分間インキュベートします。すべての細胞が切り離されたら、5ミリリットルの新鮮な成長培地をプレートに加えます。
トリプシン培地混合物を使用してプレートをすすった後、無菌血清ピペットを使用して、清潔で無菌の50ミリリットル円錐形チューブに細胞を収集します。次に、遠心分離により細胞をペレットダウンさせる。上清を吸引した後、細胞ペレットを上下に軽くピペット化して10ミリリットルの新鮮な成長培地で再懸濁する。
セルカウントの場合、0.4%のトリパンブルー溶液の30マイクロリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に10マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、その後、ヘモサイトメーター計のカバースリップの下に10マイクロリットルの混合物を加えます。反転顕微鏡またはブライトフィールド顕微鏡の下で、10X対物レンズと4つの1平方ミリメートル室を使用して染色されていない生存細胞を数え、テキスト原稿に記載されているように細胞数を計算します。C1V1はC2V2と等しい式を使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に10〜5番目の細胞の最終濃度で細胞懸濁液を調製するために必要な新鮮な培地および細胞懸濁液の所望の体積を決定する。
マルチチャンネルマイクロピペッタを使用して、プレート設計に従って96ウェルプレートのウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。マイクロピペットを使用して、プレート設計に従ってチャンバースライドの各1つに細胞懸濁液の530マイクロリットルを加え、一晩インキュベートします。100ミリメートル皿でマクロファージ細胞を活性化するために、1ミリリットル当たり250ナノグラムの濃度でインターフェロンガンマを含む活性化培地の10ミリリットルを調製する。
マクロファージ細胞培養物から増殖培地を吸引し、インターフェロンガンマを欠いた活性化培地を5ミリリットルで細胞をすすくする。実験皿の中でリンス培地を吸引した後、インターフェロンガンマを補った活性化培地を10ミリリットル添加する。そして、コントロールディッシュに、インターフェロンガンマなしで10ミリリットルの活性化培地を加え、16〜24時間細胞をインキュベートする。
インキュベーションの終わりに、共培養を調製するために、マクロファージ細胞から活性化培地を取り出し、新鮮な増殖培地を5ミリリットル添加する。セルリフターを使用して細胞を優しく削り取り、50ミリリットルの円錐管に細胞を集めます。次に、トリパンブルー排除および血球測定を用いて細胞を数え、続いて、間葉系幹細胞について先に示したように、1ミリリットル当たり2倍の10〜5番目の細胞の濃度でマクロファージ細胞懸濁液を調製し、処置した。
間葉系幹細胞を含む実験井戸から培地を穏やかに吸引する。マルチチャネルマイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの処理物を添加し、かつ、プレート設計に従って適切な実験井戸に制御マクロファージ細胞懸濁液を加え、実証したように一晩インキュベートする。間葉系幹細胞を含む四壁のチャンバースライドから培地を穏やかに吸引する。
マイクロピペットを使用して、530マイクロリットルのマクロファージ細胞懸濁液を適切なウェルに追加し、一晩インキュベートします。1ミリグラムのZymosan粒子を含むバイアルに生細胞イメージング培地を1ミリリットル加え、培地粒子混合物をガラス培養チューブに集める。さらに1ミリリットルのイメージング溶液でバイアルをすすった後、ガラスチューブにリンスイメージング媒体を移し、3ミリリットルのイメージング溶液を追加して、1ミリリットルのZymosan粒子懸濁液あたり0.2ミリグラムを達成する。
30〜60秒間クイックパルスを使用してZymosanサスペンションをボルテックスし、プローブ超音波処理器を使用して60のクイックパルスでサスペンションを超音波処理します。培地を吸引した後、実験井戸と試薬ブランクウェルを100マイクロリットルの生細胞イメージング溶液でリンスします。次に、生細胞イメージング溶液をウェルから吸引し、100マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。
タッチパッドインターフェイスを使用して、蛍光リーダーのプレートトレイを開きます。トレイの蓋を付けずにプレートを左上にA1ウェルにセットします。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、トップメニューの緑色の読み取りボタンをクリックします。
食塩基性アッセイを行うために、イメージング培地の750マイクロリットルで第1の実験をよくすすった後、残りのウェルを成長培地に残して400マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。次に、撮像システムのインキュベート段階にスライドを置きます。イメージング ソフトウェアを使用します。
[探す] タブの [明るいフィールド] オプションを選択し、接眼アイコンをクリックします。10Xの目的を所定の位置に置いて、接眼レンズとフォーカスノブを使用して細胞に焦点を当てます。取得タブを選択します。
実験ドロップダウンメニューを開き、509ナノメートルの励起とpH感受性色素の533ナノメートルの発光波長に対応するように設定されたEGFPフィルタを含む波長のセットを選択します。タイマーに約2分残っている場合は、目的メニューの20Xアイコンをクリックして目的を20Xに変更し、チャンネルメニューをクリックしてEGFPフィルタを選択し、露出メニューでpH感受性の緑色のフルオロフォアを検出するために露出時間を400ミリ秒に設定し、ライブでクリックします。フォーカスを調整した後、停止をクリックしてライトをオフにし、トップタイムラプス実験設定の横にあるチェックボックスをオンにします。
フォーカス戦略メニューでソフトウェアのオートフォーカスを選択し、ドロップダウンメニューからスマート設定とコア設定を選択して、オートフォーカスの実行中の光への露出時間を短縮します。タイムラプスメニューで、必要な取得数を30~60、間隔を1分に設定し、実験開始ボタンをクリックして取得を開始します。インターフェロンガンマの共培養に及ぼす影響を検討した。
本代表結果は、間葉系幹細胞とマクロファージの共培養がマクロファージの貪食活性を高めることを示す。インターフェロンガンマ治療は、マクロファージの活性を低下させる。しかし、間葉系幹細胞の存在下では、マクロファージ貪食活性が部分的に救出された。
これらの研究では、最適な細胞密度が重要です。また、マクロファージ細胞が低密度でめっきされた場合、蛍光強度の変化は検出されなかった。マクロファージ細胞を高密度でめっきした場合、蛍光強度は全群で急速に上昇し、差異は見分けができなかった。
この手順で最も重要なことの 1 つは、細胞密度が最適化され、実験間で一貫性を保つようにすることです。
