ピールブロット法により、多層および濃縮された生物学的クライオEMサンプルを単層に分離して、厚さを減らし、濃度を高め、画像処理を容易にすることができます。グリッド調製前にサンプル濃度を上げることができ、ピールブロットを調整して単層標本の密な分布を実現し、非常に効率的なデータ収集を行うことができます。まず、20〜25マイクロメートルの孔径のろ紙を2枚積み重ね、紙を上に向けて長いパラフィンフィルムを隣に置きます。
サブミクロンのろ紙を、さらに2枚のろ紙の上に置きます。曲がった脚を上に向けてまっすぐな脚を下に向けて毛細管防止鉗子を配置し、滑らかな面または光沢のある面を上にして600メッシュグリッドを選択します。きれいなグリッドが他のアイテムと接触しないように、鉗子をペトリ皿または他の隆起した面に置きます。
パラフィンフィルムから紙を取り除き、側面を引っ張って小さな縁を作ります。ピペット2個150マイクロリットルをパラフィンフィルムの片方の短辺から約1〜2センチメートルで4%トレハロース溶液に滴下する。2滴は約1センチ離れているはずです。
次に、別のベンチまたは床に、液体窒素を小さな発泡スチロール容器に注ぎ、小さなクライオEMグリッド容器を液体窒素に入れます。発泡スチロール容器を糸くずの出ないワイプで覆います。雲母から炭素膜を浮かせるには、デュモン5鉗子を使用し、トレハロース溶液の滴の1つに雲母の片側をわずかに下向きに接触させます。
雲母を下に動かして、水圧がカーボンフィルムをゆっくりと持ち上げるようにします。カーボン膜が液滴の表面に浮いたら、マイカを放出します。カーボン膜を目視検査して、破壊の形で損傷のあるカーボンを使用しないようにします。
毛細管防止鉗子によって20〜30度の角度で保持されているグリッドを隣接する位置のトレハロースドロップに挿入し、次にグリッドをカーボンフィルムの下に中央に配置します。カーボンフィルムを手に取り、グリッドを同じ方向に保ち、ドロップの表面張力を損なうことなく、グリッドをトレハロースの2番目のドロップの表面にゆっくりと下げます。これにより、グリッドの縁を粗い側に巻き付けた可能性のある不要なカーボンフィルムが除去されます。
毛細管防止鉗子を回転させ、グリッドのカーボン側を下に向けてペトリ皿に置きます。1.3マイクロリットルのサンプルをグリッド上部のわずかなトレハロースメニスカスにピペットで入れます。次に、溶液を約8〜10回ピペットでピペットして、トレハロースとサンプルをグリッドの両側に混合して分配します。
1つ以上の1.7マイクロリットルのトレハロース溶液をパラフィンフィルム上にピペットで送り、サンプルのトレハロース溶液をグリッド上で1分間インキュベートします。カーボンフィルムを上に向けてグリッドを元の位置に回転させ、毛細管防止鉗子を使用してグリッドをサブミクロン濾紙に押し付けます。溶液がろ紙に吸収され、炭素膜が平らになったら、3秒間待ってからグリッドを持ち上げ、1.7マイクロリットルのトレハロース溶液の上に垂直に移動します。
これらの手順は、サンプルに応じて、1〜3回以上繰り返すことができます。2枚のろ紙でグリッドを拭き取り、ろ紙からグリッドを持ち上げます。約13秒後、湿度とサンプルバッファーに応じて、グリッドを小さな発泡スチロール容器の液体窒素に突っ込み、クライオEMグリッドコンテナに入れるか、クライオEMスクリーニングまたはデータ収集のために直接転送します。
ピールブロット法に供したヒトロイコトリエンC4合成酵素の2D結晶サンプルをここに示します。矢印の左側の領域は、剥離ブロットされてからシフトした炭素膜とグリッドバーとの接触領域で、単層の2D結晶に大きく縮小されました。矢印の右側の領域は、ピールブロットの影響を受けませんでした。
画像の下半分は、ピールブロットの適用から生じる大きな、ほとんどが単層のリン脂質二重層を有する領域を表しています。上半分はグリッドバーと炭素膜の間の接触ゾーンになかったため、2つのリン脂質二重層を有する完全なリポソームが含まれていた。400メッシュグリッドのグリッド四角形は、グリッドバーのフットプリントと結果として生じるピールブロット領域、およびグリッドバーと接触しなかった領域、またはピールブロット反復回数が少ない領域を示します。
これらの画像は、非常に薄いカーボン膜を用いたサブミクロン濾紙へのバックインジェクションによって調製されたEMグリッドのブロッティングを示した。画像は、膜との最初の接触時、接触後1, 000ミリ秒、および接触後2, 000ミリ秒の単一フレームです。矢印は、毛細管圧が炭素膜を破裂させたグリッドの正方形を示しています。
炭素膜の割れ目を避け、サブミクロンのろ紙と1.7マイクロリットルのトレハロース滴を組み合わせて吸引し、層を分離することが重要なステップです。ピールブロットサンプルは、高解像度のクライオEMデータ収集に使用され、その後、構造決定のための画像処理が行われます。ピールブロットにより、以前はクライオEMには厚すぎた単層タンパク質2D結晶の構造測定が可能になります。
さらに、さまざまなサンプルを炭素膜上の単層に濃縮することができます。
