電子顕微鏡では、公平なサンプリングプロトコルが不可欠です。ある脳領域のシナプスや他の構造の数値密度を定量化したい場合、私たちの技術の主な利点は、それが公平であり、最小限のユーザー介入で電子顕微鏡写真を自動的に生成することができるということです。この技術は、神経科学などの他の研究分野でも有益であり、神経ネットワークの強度を評価するのに使用できます。
プロトコルを適用するためには、サンプル調製や遷移電子顕微鏡の操作など、電子顕微鏡技術の経験が必要です。私たちの手順を実証するのは、私の研究室のポストドクターであるステファン・ヴェルニッツニッヒ博士です。このプロトコルは、電子顕微鏡用の脳サンプルを準備し、薄いセクションのペアを切断するで構成されています。
次に、特定の分野で定義された数の電子顕微鏡写真を自動的に生成する方法を説明する。次に、計数フレームを使用して、構造フィーチャの数値密度を評価します。まず、添付のテキストプロトコルに従って、目的のサンプルを解剖、修正、修正後、および埋め込み樹脂に埋め込みます。
次に、サンプルをウルトラミクロトームに置き、55ナノメートルの超薄型シリアルセクションを生成します。1ミリメートルの寸法を2ミリメートルずつ、ピオラ状でコーティングしたスロットグリッド上にセクションを配置します。次いで、2%の酢酸を使用してスロットグリッド上の超薄いセクションを30分間対抗し、続いて室温で30秒間クエン酸鉛を付ける。
グリッドを TEM に配置し、TEM を使用して、TEM を使用して、セクションの方向を調整し、その品質を評価するグリッド上のセクションを確認します。次に、TEM シリアル セクション ソフトウェアを起動し、[セクション]を選択し、[挿入]を選択して参照セクションとルックアップ セクションのコーナー ポイントを追加します。ポップアップ ウィンドウの指示に従います。
参照セクションから開始し、ルックアップ セクションに進みます。点 1 と 2 が入力されるため、断面のエッジが次のセクションに平行であることを確認します。次に、低倍率で参照セクションを視覚化し、対象領域を特定します。
参照セクションの TEM 画像解析を使用して、ROI の複数のコーナー ポイントに顕微鏡ステージを移動し、ROI のアウトラインを作成します。ランダム ポイント サンプリング ソフトウェアを使用して、結果のポリゴンの座標を記録します。このためには、セクションの ROI のアウトラインを作成するために必要なポリゴンの各ポイントで、ランダム ポイント サンプリング ソフトウェアのダイアログ ボックスで[座標の追加]を押します。
次に、ランダムポイントサンプリングソフトウェアに、サンプリングエリアとエリア間の距離に適したサイズを定義して入力します。次に、[ラスターを計算]を押して、ポリゴン内のマイクログラフの位置に対して、体系的で均一でランダムな方法で座標を生成します。ランダムポイントサンプリングソフトウェアとTEMシリアルセクションソフトウェアを使用して、参照セクションとルックアップセクションにサンプリングポイントを保存します。
これらは、その後に記録されるモンタージュの座標です。ランダムポイントサンプリングソフトウェアで、次の位置に移動して、顕微鏡ステージを参照セクションの各サンプリング領域のx、y座標に移動します。次に、[場所] を選択し、[挿入] を選択して、参照セクションの TEM シリアル セクション ソフトウェアでこれらの座標をインポートします。
すべての座標に対してこの手順を繰り返します。参照セクションの座標をルックアップセクションに反映するには、[セクション]を選択して[セクションへ移動]を選択します。ダイアログ ウィンドウでルックアップ セクションの番号を入力します。
モンタージュの記録については、前に説明したように参照セクションとルックアップセクションを切り替え、参照セクションの位置を場所で変更して番号に移動します。ダイアログウィンドウで次の座標を選択します。SerialEM モンタージュの場合、各サンプリング座標で[ファイル]に移動し、ドロップダウンメニューから[新しいモンタージュ]を選択します。
ダイアログ ウィンドウで、正しいタイル数とオーバーラップの割合を選択します。本研究では、5000倍率で研究上のシナプス特徴を認識するのに十分である。しかし、CCDカメラの限られた視野は、2枚の画像でモンタージュを作る必要があります。
モンタージュはシリアルEMに作られています。各モンタージュを記録する前に、フォーカスを再調整するか、録音ソフトウェアのオートフォーカスオプションを有効にします。モンタージュファイルを保存するフォルダを選択し、SerialEM の左側にあるモンタージュサブメニューで Start キーを押してモンタージュの記録を開始します。
マイクロディセクタを開始し、必要に応じて、カウント フレームのサイズとセグメント数を定義します。デセクタ マクロを使用してシナプス密度をカウントします。ツールバーにあるマルチポイントツールを使用して、非セクタの 2 本の禁止線と交差するシナプスを制限しますが、逆の受け入れラインでシナプスをカウントします。
参照セクションに表示されるが、参照セクションには表示されないカウントフレーム内のすべてのシナプスを、楕円形の選択でマークします。シナプスパラメータを測定する場合は、参照セクション上にある断面でシナプス裂孔を持つシナプスのみを選択します。これは、デセクタに使用されるイメージ フレーム内に収まる必要があります。
次に、プラグインに移動し、次に分析に移動し、ドロップダウンメニューからプラグイン ObjectJ を起動します。[ObjectJ] ドロップダウン ダイアログから新しいプロジェクトを開き、マーカー ツールで構造のアウトラインとマークを付けるためのウィンドウが開きます。まず、マーカーツールを使用して、構造に沿って線を引くことによってシナプス前膜の長さとシナプス後の密度の長さを測定します。
次に、多角形を描くことによってシナプス裂の平均幅を求め、シナプス前およびシナプス後膜の両方を覆う。ドッキングされた小胞の数を決定するには、1小胞径以下のシナプス前膜からの最大距離を有するすべての小胞を数えます。次に、同じシナプスでドッキングまたは他のドッキングされていない小胞からの1つの小胞径の最大距離を持つ小胞を数えることによって、ドッキングされていない小胞の数を決定する。
プロトコルの適合版は超薄いセクションの中で公平に得られた場所で元素分析を可能にする。このためには、TEMイメージングモードで、SerialEMを起動し、新しいプロジェクトを開きます。次に、ナビゲータを開き、カメラコントロールとスクリプトコントロールでカメラの設定を確認し、ビューと記録と開始ビューを確認します。
超薄いセクションのコーナーマップを作成するには、「ナビゲータ」ウィンドウで「ポイントを追加」を選択します。次に、超薄い断面のエッジにコーナーポイントを設定します。右マウスキーを押しながら、ステージをコーナーポイントに移動します。
セクションの角に達したら、左クリックでコーナーポイントを追加します。この手順を繰り返して、さらに 3 つのコーナーポイントを追加します。「ナビゲータ」ウィンドウで、格納されているポイントのコーナーポイントの C ボックスにチェックが付いていることを確認します。
コーナーモンタージュを開始するには、シリアルEMメニューバーのナビゲーターに移動し、ドロップダウンメニューからモンゲジンググリッドとセットアップコーナーモンタージュを選択します。「ナビゲータ」ウィンドウで「多角形を追加」を選択し、マウスの右クリックを複数回実行して対象領域の輪郭を描きます。次に、[ナビゲータ] ドロップダウン メニューで [ポイントのグリッドを追加] を選択し、ポイント間の距離を定義します。
EFTEMSerialEM スクリプトを起動し、スクリプト・コマンドに従い、ナビゲーターに示すようにグリッドポイントの数を入力し、取得ポイントの数を入力します。次に、スクリプトがグリッド バーを回避できるように、イルミネーションのしきい値を設定します。スクリプト コマンドに従って、グリッド バーの 4 分の 1 で視野を覆うようにステージを手動で移動します。
表示された値に従って、表示される値よりも高いしきい値のイルミネーション値を入力します。取得ポイントが選択され、調理ルーチンが終了するまで待ちます。これは長い時間がかかり、一晩で行うことができます。
エネルギーフィルタによる TEM 要素解析の設定後、要素固有の設定で要素マップを取得します。偏りのないサンプリングアプローチは、特定の脳領域のシナプス特徴をカウントして分析するのに役立ちます。さらに、シリアルEMソフトウェア用のEFTEMSerialEMスクリプトは、これらの各点でエネルギーフィルタ電子顕微鏡写真を得ることを目的として、超薄型セクション全体から取得ポイントをランダムに選択することができます。
スクリプトは、グレーディングでマークされたものからユーザーによって事前に定義された多数の点をランダムに選択しました。テスト顕微鏡写真を作成し、その勾配レベルを確認することで、スクリプトは、選択されたポイントがセクションの可視部分に配置されているかどうかを確認し、グリッドバーに着陸した点を拒否しました。ワークフローのほとんどは、ユーザーの操作を最小限に抑え、スクリプトによって処理されました。
しかし、ここに示すサンプルでは、SerialEM のオートフォーカスルーチンに対しては光が少なすぎました。そのため、スクリプトがステージを各ポイントに移動するとすぐに、フォーカスが調整され、元素マップが鉄でできています。関心領域を慎重に選択し、同じ数のサンプリング ポイントが各対象領域に入るようにすることが重要です。
検体の調製に使用される化学物質の多くは有毒であることを忘れないでください。だから、ラボコートと保護手袋を着用し、煙のカバーの下で動作します。
