本研究では、FP7の容量計画（認可番号インフラ2010から262163）の下で欧州共同体研究インフラによって賄われているQNanoプロジェクトhttp://www.qnano-ri.euから支援を受けた。 我々はまた、財政支援のための研究協議会Formasに感謝。

注：このプロトコルで指定されたすべてのパラメータは、ここに示されている楽器やモデルに有効です。他のメーカーやモデルが使用されている場合（本文中に*でマーク）これらのパラメータの一部が異なる場合があります。 FIB / SEMの1。スタートアップ <ol><li> anticontaminator（AC）に銅編組を結び付けずに、特注の冷たいナノマニピュレータ（NM）チップをマウントします。代わりに三つ編みが先鋭化ステップ（1.2）中に電荷を防止するための絶縁点以上のNMの残りの部分に接続されていることを確認してください。 <ol><li>高真空と画像のNM先端にポンプ、SEMチャンバーを閉じます。 </li><li>先端は、鈍曲がったり、前の使用によって汚染されている場合には、イオンビームを用いて削り：先端部の側面に沿って、多角形フライスパターンを選択し、粉砕後、先端が1μm以下にまで先細りになるようにします。 </li><li>先端の辺が離れてミリングされたら、手動で全体NMロッド90°だけ回転SEM室の外から。 </li><li>別の角度から回転先端を繰り返しフライス加工に適応するために、多角形フライスパターンを調整します。 </li></ol></li><li>先端は、1ミクロン未満であるNMを後退させるとガス注入システム（GIS）の針を挿入するために鋭利された後; （代わりに、通常の175μmの）作動距離より約1ミリメートルになるように針の位置を変更。 </li><li>白金前駆体を用いた場合は、（代わりに通常の40℃）24〜26℃にその動作温度を変更してください。これらのステップは、Ptを低温堆積13のために必要とされる。 </li><li> SEM室を開き、クライオ試料ステージと交流を装着することにより、低温モード用のFIB / SEMを準備します。 </li><li>挿入された位置に、NMを切り替えて、ACにその銅編組を接続してください。誤っNM先端には手を触れないようにしてください。システムは、極低温で銅編組の柔軟性の喪失は、NMの動きを妨げないことを確認するために挿入されたNMで冷却されるMENT。 </li><li>数分間乾燥窒素ガスを冷却するためのパイプをパージします。 </li><li>クライオ準備室と高真空に主試料室ポンプ。 </li><li>両室を冷却するためにデュアーに液体窒素を追加します。所望の温度に到達するまでお待ちください。 </li></ol> 2。サンプル凍結 <ol><li><ol><li> SEMの転写ホルダーのFIB試料について2 TEMグリッドをマウントします。ドライバーで対応するネジを締めて固定します。 </li><li>検体のサンプルスタブ適切にマウントし、試料の一部を追加します。試料の種類に応じて、試料は、低温接着剤で又はクランプで固定することができる。最適な凍結を確実にするために、できるだけ少量を使用する。 </li><li>真空搬送装置（VTD）に、SEMの転写ホルダーを取り付けます。 </li></ol></li><li><ol><li>流し込みステーションに液体窒素を加え、窒素スラッシュを得るために、ポンプダウン。 </li><li> SLを開く駅やプランジ凍結のSEM転写ホルダーをushing。沸騰が完了し、スラッシュが再び得られるまで再びポンプダウン。それは、エタン又はプロパンスラッシュまたは高圧凍結試料のガラス化を得るためにより適した技術であることに留意されたい。 </li></ol></li><li><ol><li> VTDの真空チャンバ内にSEM転送ホルダを後退させると、それを密封する。 </li><li>流し込み駅やクライオ準備室のエアロックベント。 </li><li>クライオ準備室とポンプのエアロックとVTDシールを一致させる。 </li><li>良好な真空レベルに達すると、VTDおよび外側エアロックのシールを開くために、エアロックピンが係合する。 SEMの転写ホルダーを挿入します。スパッタリング及び破砕のためのサンプル位置を示す準備チャンバ内で摺動接点上のマーキングがある。 </li></ol></li><li>必要であれば、サンプルができます冷たいナイフを骨折。より高い温度（通常は-100を設定することにより、昇華6、C）;冷たいスパッタリング装置を用いてのAu / Pd又はPtを被覆（300 V、10ミリアンペア、2〜3ナノメートルのAu / Pdのキャップは60秒）*。昇華は彼らの再結晶化を回避するために、ガラス化したサンプルには使用しないでください。 </li><li><ol><li> TEM格子スロットの保護蓋を開くために冷たいナイフを使用してください。 </li><li>受信の高さ（16ミリメートル*）に試料室中のコールドステージを持参してください。 </li><li> FIB / SEMにHTを切り、内側のエアロックを開きます。 </li><li>試料室にSEMホルダーを転送するVTDを使用する。部屋の照明の調光は、このステップで役立つことがあります。 </li><li> SEMホルダーがコールドステージになると、押し、回転させることによって、VTDを外す。 </li><li> VTDの真空チャンバ内にVTD棒を奥まで後退させ、内側エアロック、アウターエアロックとVTDシールを閉じます。外側のエアロックは現在、VTDシールを除去して排出することができます。この最後のステップは必要ありませんが、VTD棒が簡単に誤って外れることがありますようにそれが損傷を引き起こす可能性がある、お勧めしますVTDまたはエアロックへ。 </li></ol></li></ol> 3。イオンミリング <ol><li>両方の列にハイテンションの電源をオンにして、適切な撮像パラメータ（加速電圧設定：電子ビームのための10 kVの、イオンビームのための30 kVの、スポットサイズ：3;作動距離：5ミリメートル、イオンビーム電流：10〜100をイメージングのためのPA、フライス加工用1-3 NA）*。 </li><li>関心対象の特徴を見つけるためにラメラの抽出前の試料の状態を記録するために画像を取得するために電子ビームを使用する。 </li><li>抽出のための関心領域（ROI）が識別されると、サンプル自体の地形でもPtの堆積後のROIを簡単に識別するために許可しない限り、イオンビームパターニングによってそれをマーク。増加精度を、Pettersson氏らの方法を使用します。14マーキングは、深く広く、非SELであるクライオ白金蒸着（でカバーされた後、まだ目に見えるであることが十分でなければならないectiveと試料表面の数mm 2）をカバーする。 </li><li> 24〜26℃に前駆体ガスを加熱し、試料表面の上方約1mmの高さGIS針を挿入する（工程1.3も参照）。 </li><li>電子ビームをイメージしながら、数秒間ガス弁を開く。クライオのPt堆積速度は、GIS針、試料粗さおよびユーザーのシステムの距離に依存し、100〜500Å/秒以上である。これは、最適なパラメータを決定するために、いくつかのテストの堆積を実行することをお勧めします。 </li><li>生のクライオ-PT堆積は非常に粗く、不均一である。低倍率（例えば、2,000 X）で1000 pAのイオンビームを用いてROIの上に堆積物を硬化させる。クライオ沈着とは異なり、この硬化は、サイト選択的であり、ROIのみで実行する必要があります。この第低温堆積の目的は、イオンビーム損傷から試料の表面を保護するために、イオン間引き13の間カーテニングを低減することである。 </li><li>にサンプルを傾けて52℃の表面がイオンビームに対して垂直になるように。離れてミルROIの両側に2段々のトレンチ。トレンチのための典型的な寸法は、抽出すべきラメラ、垂直方向（Y）における可変で10〜15ミクロンの方向（X）に並列に20〜30μmであり、最深点で、深さ（Z）を傾斜投資収益率に近い。傾斜は45〜55℃である必要があります。いくつかの楽器では、棚田のトレンチは上部の最深部に粉砕することができる。このような場合には、投資収益率の下でミル1は、イメージ180°、ミル、他側の第1回転させます。材料のスパッタ速度が既知であれば、ミリングの深さを選択することができる。ほとんどの凍結水和試料については、氷のスパッタ速度は、07を使用することができる。 </li><li>戻って0°にサンプルを傾け、ラメラの側面および下面を切り取るためにイオンビームを使用し、必ずカットマークが全体のラメラを通過させる（これらは棚田の斜面ミルで製粉跡を残す必要があります前のステップでのED）。サンプルの残りの部分にラメラを接続するだけ2小さな橋を残す。 </li><li> （これは少しのサンプルをシフト可能）、GIS針を挿入します。その先端は、好ましくは側で、ラメラと物理的に接触するまでNMを操縦。 NMは2小さい接続ブリッジのイオンビームビューを妨げていないことを確認します。 </li><li><ol><li>数秒のためのGISバルブを開いて、電子ビームを連続撮影によってクライオ沈着を監視します。 </li><li> Ptをさらに1〜2ミクロンの層がクライオ寄託されている場合には、バルブを閉じてください。 </li><li>唯一のNMはラメラと接触している点の周りの数μmでPT（ステップ2.6を参照）を硬化。 </li><li>無料のラメラをカットする高いイオンビーム電流を使用してください。 2接続するブリッジは離れて粉砕されただけでなく、ラメラとサンプルの残りの部分との間の新たな接点を形成した可能性のPtの余分する必要があります。まだ、GIS針を撤回しないでください。 </li></ol></lI&gt; <li>慎重にトレンチからラメラを抽出し、少なくとも500μmの試料表面の上に移動し、NMを操縦。唯一のこのステップの後、GIS針を後退させる。 </li><li>試料ステージの数mmを下げ、TEMグリッドの1が表示されているまでそれを移動します。作業位置にグリッド上の取り付け領域を移動して、GIS針を挿入します。 </li><li><ol><li>慎重にTEMグリッド上に取付け領域と物理的に接触添付ラメラを持って来るために、NMを操縦。ラメラ、TEMグリッドとNMの間には圧力や緊張があってはならない。 </li><li>数秒と低温堆積物のPtのさらに1〜2ミクロンの層のためのガスのバルブを開きます。 </li><li>唯一のラメラとTEMグリッドとの間の接触点の周りの数μmでPT（ステップ2.6を参照）を硬化。 </li></ol></li><li>メキシコの自由ラメラをカットする高いイオンビーム電流を使用してください。これは、NMチップまたはサンプルのいずれかの側に離れて粉砕することによって達成することができる。 T中彼最初のケースは、先端部が、ステップ1.2で説明したように、次回の使用の前に再び先鋭化する必要があります。 </li><li> OPTIONAL：この段階では、SEMの転写ホルダーを取り、液体窒素で満たされたデュワーでO / Nに格納するVTDを使用することが可能である。液体窒素は空気中の湿気にさらされると、氷の結晶が既に存在しているおよび/または場合は、この転写及びO / Nストレージは、ラメラの表面上の氷の形成を引き起こす可能性があり;しかし、このような汚染は、比較的短時間で次の工程によって除去される。前の手順が完了するまでに数時間を取っている可能性がある次のステップの後に、ストレージ·O / Nが推奨されていないので（昇華により除き、氷の汚染を除去する方法はないだろうとして、それは、これを行うことが適切で可能性がある試料のガラス化が維持される場合）を行うことができない。 </li><li> 52℃にサンプルを傾け、透明度7を電子薄いそれにイオンビームを使用しています。それは、より高い、rougで始めることをお勧めします彼女のビーム電流は、大部分を除去し、最終的にも、加速電圧を低減し、低ビーム電流で表面を研磨微に進みます。ラメラの最終的な厚さはサンプル組成に応じて、100〜200 kVのTEMでの超微細構造解析のための100〜200 nm以下または300 kVのTEMでの断層撮影では最大500程度にする必要があります。間伐時には、サンプルの内部応力がカールするラメラや曲がりの原因となります。このような場合には、薄くなった領域が制限されるべきである。これは、 図11および12に、例えば、起こった。 </li></ol> TEMに4。クライオトランスファー <ol><li><ol><li>数分間乾燥窒素ガスをクライオ乗換駅をフラッシュします。 </li><li> TEM交流のデュワーへとクライオトランスファーステーションに液体窒素を追加します。 </li><li>クライオ搬送ステーションの適切なスロットにクライオトランスファーTEMホルダーを挿入し、同様にそのデュワーを埋める。各コンプまで待ってonentは、所望の温度（約15分）に達した。可能であれば、クライオ転写TEMホルダのコントローラは、転写時の温度を監視するために接続されるべきである。これは、（温度センサが配置されている）TEMホルダの先端がクライオ搬送ステーションと接触するので、TEMホルダの残りの部分よりもはるかに速くを冷却することを認識することが重要である。したがって、冷却する全体クライオトランスファーTEMホルダーのために必要な時間は、予め測定し、システムは時間の少なくともその量のために熱化を許可されていることをお勧めします。 </li><li>液体窒素で極低温カップを満たし、その中に浸す。所望の温度にそれらの先端を冷却するために、TEM試料クランプツール、ドライバーとピンセットを。操作者の手に冷たい火傷を引き起こさないように、すべてのツールが正しく他端に絶縁されるべきである。 </li></ol></li><li>外側のエアロックにVTDと一致する。冷たいクワガタをもたらす搬送高（16ミリメートル*）へのE。ハイテンションの電源をオフにします。 </li><li><ol><li> VTDシール、外側と内側のエアロックエアロックを開きます。 </li><li>時計回りに押し、回転させることで、SEM転送ホルダーにロックするVTDロッドを使用してください。 </li><li>クライオ準備室に、SEMの転写ホルダーを撤回。 </li><li> TEMグリッドの保護蓋を閉じるように冷たいナイフを使用してください。これは、転送中の可能な氷の汚染を低減する必要がある。 </li><li> VTDの真空チャンバー内に試料を移動するためにVTDロッドを使用してください。 </li><li>エアロックを閉じて密閉する。 </li></ol></li><li>外側のエアロックをベントし、VTDを切り離す。クライオ乗換駅のSEMポートにVTDと一致する。乾燥窒素でフラッシュしながら、VTDのシールを開き、クライオ乗換駅のデュワーへのSEM転写ホルダーをスライドさせるステーションでピンを使用しています。 </li><li><ol><li>クライオ搬送ステーションでのレベルが十分に高いように、十分な液体窒素を入れるサンプルのみを沈めた。 </li><li>蓋の1を開いて、所定の位置にTEMグリッドを保​​っている、対応するネジを緩めるために、以前に冷却されたドライバーを使用しています。 </li><li> TEMグリッドを選択し、TEMホルダーにそれを置くために、以前に冷却されたピンセットを使用してください。 </li><li> TEMホルダーにTEMグリッドを固定するために冷却hexringを使用しています。 </li><li>クライオトランスファーTEMホルダーのシャッターを閉じます。サンプル移送工程が重要であり、小型のTEM試料の可視性を減少させる窒素ガスによって妨げられるかもしれない。 </li><li>一緒クライオトランスファーTEMホルダーのヒータコントローラと、ポンプシステムからクライオ搬送ステーションを取り外し、TEMの近くにそれを輸送。 </li><li> TEMのエアロックにバッキングラインを送り出す、TEMのターボ分子ポンプを起動します。 </li><li> -70°のチルト*へのTEM試料ステージを設定します。 </li><li>乾燥窒素ガスでパージの1サイクルのみで、エアロック（30〜60秒）のための最短のポンピング時間を設定します。 </李&gt; </ol></li><li>クライオトランスファーTEMホルダーの保護シャッターが閉じていることを確認してください。クライオ乗換駅からのTEMホルダーを外し、傾いた角度計（液体窒素は、TEMホルダーデュワーからこぼれん）に挿入します。ポンピングサイクルが開始されます。サイクルが完了すると、0°に戻って傾斜するゴニオメータを設定し、それはゴニオメーターで回転しないようにし、同時に、TEMホルダを保持する。 TEMの中に完全に挿入します。このステップの間に、クライオ転写TEMホルダは、温度を監視するためのヒーターコントローラに接続されるべきである。 TEM内に試料ホルダーを挿入する手順が異なるのTEM間で異なる場合があります。したがって、適切な手順を取得するために、TEMの製造元に連絡することをお勧めします。 </li><li>クライオトランスファーTEMホルダーデュワーを補充します。許容可能なレベルに到達するために、TEMの真空を待つ。 </li></ol>

<ol>
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Microsc. 226, 263 (2007).</li><li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision.">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).</li><li>W&#228;tjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu+out-diffusion+in+kesterites—A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact.">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、室温での材料科学で使用される標準的なFIB / TEM試料作製の極低温にかなり単純化したものです。試料表面が不均一である場合カーテニングが発生することがありますがこの方法は、機械的変形とナイフマーク（切片作成の主な欠点）の自由なTEMサンプルを生成します。これは、13滑らかで特徴となるまで硬化さキャッピング層（この研究でPtを使用した）の低温堆積によって減少させることができる。非常に異なる硬さの成分を有する試料は、それらが製造の間に応力下壊す危険性なしに同様に調製することができる。内部応力は依然として薄いラメラ部のサイズが縮小されなければならない場合には、曲げたり、カールさせることができる。他の方法と比較して欠点は、イオンビームと試料中のイオンの注入を可能に曝露する生物学的構造を変化させる可能性がある。これらの欠点は、試料た準備のためにRTで起こる材料科学15でATION。彼らは、イオン（500〜1,000 V）の最低加速電圧での最終研磨工程で間伐を完了することによって低減することができる。この非常に穏やかな研磨工程は、ラメラのダメージ層を除去します。 原因クライオ成長（3.5、3.10および3.13ステップ）の性質上、サンプルの大部分は、それによって、元の表面の表示を妨げる​​、カバーされます。これは、ステップ3.3で提案されているように、複数のマーキングが使用されない限り、それが困難な、ROIを追跡することができる。 ステップ4.5と4.7の間に薄いラメラリスクは、空気と接触する。これはおそらく重要な特徴を不明瞭にする点まで、試料の表面上の氷の結晶を形成するために、空気中の水分を引き起こすとして避けなければならない。これらのステップは、可能な限り迅速に行われるべきであるが、同時に転送中の誤操作は、試料の損失をもたらす可能性があるit自己。これは、ユーザーが実際の試料上での試行が行われる前に、空のTEMグリッドを使用してこれらのステップを実践することをお勧めします。 材料科学では、FIB装置は、その商業化の10年以内に、TEM試料作製のチーフ方法となっている。それは実質的に任意の試料で使用することができるので、試料の種類に調製技術を調整する必要性を除去する。私たちは強く同じことが、極低温で、ここで詳述した手順のおかげで発生する可能性が信じている。より大きなサンプルへの応用はまだクライオ保持するガラス化状態にして能力の対象となりますが、3,5の凍結などプランジ凍結や高圧のような技術は、この問題に対する最適なソリューションであることを証明することができます。

このプロトコルでは、以前はcryo-FIB/SEM SEM分析によって高精度に同定された試料の特定領域からのTEM試料を作製するために使用される。生体試料の電子顕微鏡（走査または透過）分析は研究および診断のために使用されるルーチン的な技術である。 SEMはかなり早く採用し、解釈が容易であるが、情報は、試料表面から1.5 nmの範囲の解像度が得られる。 TEMは、より高い解像度を有するが、実装がより困難であり、画像解析はあまり簡単であり、大容量情報が取得されるのに対し、サンプル（約500nm未満の厚さ）の透明性を電子を薄くする必要がある。さらなる問題は、それらの機器の真空要件はほとんど水を含有する試料によって許容されないことである。ほとんどの場合、生物学的サンプルを化学的に固定（例えば、水に代えて、ポリマー）又は乾燥させるのいずれかがある。両方の場合において、有意な変化試料の形態および構造が生じやすい。水和した試験片のTEMクライオ調製物は、最小限の化学的変化を誘発し、それは氷のガラス化が1-6が得られる場合は特に、それらの天然の状態にできるだけ近いサンプルを生成する。 FIBは広く、その多くの利点のために7 TEMサンプルを調製するために使用される。少数を示すために：近垂直入射での高エネルギーイオンの使用は、材料関連の差動ミリング速度の影響を最小限に抑える。バルクサンプルから抽出された領域は、サブミクロンの精度で選択することができる;材料の非常に少量を抽出する。最近の技術開発は、極低温2,8-10でTEM試料調製のためにも、FIBを使用可能にした。このようなスライスされたラメラの機械的変形の欠如などのソフトマターのサンプルのために主に使用クライオミクロトーム11,12の伝統的な製造法に比べていくつかの利点がありますが、ナイフマークとハード/ソフトのインターフェイスやコンポーネントとコンポジット試料を調製する可能性がないこと。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

ここでは、 アスペルギルス·ニガー胞子の低温TEMサンプルを調製するために使用されるプロトコルを提示したが、容易に微生物または溶液の任意の数に適合させることができる。私たちは、特注のクライオ乗換駅と修正されたクライオSEMの準備室2を利用する。胞子を液体窒素スラッシュ内プランジ凍結し、関心領域を選択するためにクライオSEMで観察され、培養物から採取する。薄いラメラ次に、FIBを使用して抽出され、TEM格子に付着し、その後、電子透過まで薄く。グリッドは、クライオTEMホルダに、高分解能TEM研究のために転送される。冷却されたナノマニピュレータの先端とクライオ搬送ステーションの導入のおかげで、このプロトコルは、TEM試料の日常的に使用されるFIBの準備の極低温に簡単で最適化したものです。このように、既存の機器、セットアップおよび手順への修正に少量を必要とするという利点を有する。それをI実装するのは簡単。それは原則クライオTEMサンプル調製と同様に、広範囲の用途を有する。一つの制限は、汚染を回避又は最小限にするために重要なステップで標本の取り扱い熟練を必要とすることである。

本研究では、の使用なさ：ナノマニピュレータと低温準備室を搭載したデュアルビームFIB / SEMで;クライオ転写ホルダーとTEM;プロトタイプクライオ乗換駅。 anticontaminator（AC）クライオ準備室のブレードおよびナノマニピュレータ（NM）の先端がガタンによって変更された。標準的な凍結準備チ​​ャンバに対して、ACブレードは、NM先端より大きなヒートシンクを提供することが大きい。また、ACは、NMチップとの熱交換のための銅編組を接続するためのクランプが取り付けられている。 FIB / SEMの空気圧はNMがあることや、試料室をガス抜きしても、挿入されたままにできるように変更された。なお、この研究で使用されるパラメータは、最良上記機器に適していることに留意すべきである。これらのパラメータは、他のタイプの装置を操作するときに調整する必要もよい。このプロトコルを使用するには、極低温の液体窒素や真空システムを処理するための通常の予防措置をすべき続くこと。 この方法は、ナノ粒子を含有する溶液またはポリマーマトリックスから、線虫の単細胞生物に至るまで、良好な結果が得られ、異なるタイプのサンプル上でテストされている。手順の様々な工程の例は、A.に、図1-12に示されているニガー胞子は、四酸化オスミウム、および過マンガン酸カリウムで染色した。胞子は最初の抽出のための部位を同定するためにSEM（ 図1）によって画像化される。この場合、任意の胞子の断面は十分であったが、それは、例えば、細胞膜からの特定の距離で特定のセルをスライスするサブマイクロメートルの精度で抽出用ROIを位置決めすることができる。関心対象の特徴が識別されると、低温のPt堆積の最初の工程は、イオンミリングからのビームによる損傷からサ ​​ンプルを保護するために、（ 図2）に実装される。サンプルは、最初のステップOを続行し52°に傾いているfはミリング（ 図3）：ラメラの両側の2つのトレンチのスパッタリング。次に、試料を倒し、さらにバルクに接続するだけ2小さな橋（ 図4）を残すように粉砕される。冷却されたナノマニピュレータは、ラメラと接触する（ 図5）とPtの他の低温堆積を一緒に半田付けする（ 図6）にされる。小さ ​​な接続ブリッジは離れて粉砕し、次いで、NMは、それが白金（ 図8）の最終クライオ沈着に半田付けされるTEMグリッド（ 図7）の取付領域の近傍にラメラを移動している。 NMは、その後、イオンビーム（ 図10および11）を用いて、透明性を電子ために薄くされるラメラ（ 図9）から分離される。ラメラは、最終的に高解像度イメージング、分光法、断層撮影および他の技術を約TEM（ 図12）に転送されるN採用する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> 図1。Aの胞子のクライオSEM像白金堆積前ニジェール 、。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> 図2。白金を堆積した後、図1にあるが、硬化前の同じ領域。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> 【図3】図2の同じ面積のクライオSEM像は、進行中のトレンチミリングして、Ptを蒸着および硬化後に、52度傾い（ステップ3.7を参照）。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> 図4。ラメ ​​ラ、リフトアウトの準備ができて。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> 図5。冷たいナノマニピュレータの先端がラメラと接触する。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> 図6。第2PT低温堆積は、ナノマニピュレータとラメラを一緒にはんだ付けするために使用されます。 <iFOコンテンツ幅= &quot;5インチ&quot;：FOミリグラムのalt = &quot;図7&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; 図7コールドナノマニピュレータはTEMグリッドの取り付け領域にラメラを転送するために使用される。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> 図8。クライオ堆積は、TEMグリッドにラメラを取り付けるためにもう一度使用されています。 <img alt="図9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> 図9。ラメ ​​ラは、ナノマニピュレータの自由カットし、現在ではストレージや透明性を電子ために間伐いずれかの準備ができている。 図10。間伐の中間工程を、断面が見える少数の胞子で。 <img alt="図11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> 最終的な間伐後の試料の図11クライオSEM像;他の胞子のほとんどはラメラがカールし始めていたので、すぐに粉砕しなければならなかった。 <img alt="図12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> 図12。ラメ ​​ラの複合クライオTEM写真。アル·スタブの一部が含まれていますラメラ（黒矢印）にある。

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

クライオ電子顕微鏡、走査型（SEM）のいずれか、または送信（TEM）は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム（FIB）は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.4K ビュー.  Uppsala University. クライオ電子顕微鏡、走査型（SEM）のいずれか、または送信（TEM）は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム（FIB）は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。 

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

個別散在セルの優位を持つ細胞診標本からのセルブロックの準備

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

の検討<em&gt;ショウジョウバエ</em光学顕微鏡で&gt;幼虫気管ターミナルセル

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. For many years electron microscopy (EM) has remained an inherently two-dimensional technique. With the advent of serial scanning electron microscope imaging techniques (volume EM), using either an integrated microtome or focused ion beam to slice then view embedded tissues, the third dimension becomes easily accessible. Serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) uses an ultramicrotome enclosed in the SEM chamber. It has the capability to handle large specimens (1,000 &#181;m x 1,000 &#181;m) and image large fields of view at small X,Y pixel size, but is limited in the Z dimension by the diamond knife. Focused ion beam SEM (FIB-SEM) is not limited in 3D resolution, (isotropic voxels of &#8804;5 nm are achievable), but the field of view is much more limited. This protocol demonstrates a workflow for combining the two techniques to allow for finding individual regions of interest (ROIs) in a large field and then imaging the subsequent targeted volume at high isotropic voxel resolution. Preparing fixed cells or tissues is more demanding for volume EM techniques due to the extra contrasting needed for efficient signal generation in SEM imaging. Such protocols are time consuming and labor intensive. This protocol also incorporates microwave assisted tissue processing facilitating the penetration of reagents, which reduces the time needed for the processing protocol from days to hours.

Here, we present a protocol for efficiently combining serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy to target an area of interest. This allows for efficient searching, in three dimensions, and locating rare events in a large field of view.

シリアルブロック面と集値イオンビームスキャン電子顕微鏡を用いた標的研究

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.