この作品は、VAへのアントワープ大学から博士課程の交わりによってサポートされていました。 KSへフランダース科学財団（FWO、11ZI916N）から博士課程の交わり。 FWO（G0D0514N）からプロジェクト助成金。協調研究活動（GOA）研究助成金、アントワープ大学の研究会から「葉の形態形成のシステムバイオロジーのアプローチ」。そして、大学間アトラクションGTSBハンAsard、Bulelani L. Sizaniと浜田AbdElgawadにベルギー連邦科学政策室（BELSPO）からポーランド（IUAP VII / 29、MARS）、「トウモロコシやシロイヌナズナ根と成長を撃つには、「すべてのビデオに貢献します。

注：運動学的分析のための以下のプロトコールは、定常状態の成長中の葉にのみ有効です。これは、数日間6の期間中に安定した葉の伸び率とセル長と葉の拡大の空間パターンを意味します。 1.植物の成長と葉の伸び率の測定（LER） <ol><li>定常状態の成長の葉や関心の発達段階を選択してください。 注：同一の軸上に連続した葉に類似の空間パターンを意味し、定常状態の成長および繰り返し成長の差があります。苗の成長の初期段階では、連続した葉は、通常、成長ゾーン7の大型化にますます速くによる成長します。少数の高い葉の位置が同様の成長パターン8を持つことができますが、これは調査中での処理によって影響を受ける可能性がある過渡的な段階です。行及びTRとを比較することが重要です<html>それは異なる時間で開発することができるにもかかわらず、厳密に同じ葉位にeatments。でも一定の伸び率で、成長率プロファイルは、必ずしも異なる発生段階で同じではありません。したがって、典型的には、出芽後の日数によって定義された同じ発達段階8で葉を分析することが重要です。 </li><li>単子葉植物で葉の成長の完全な運動学的分析を実行するには、成長の部屋で制御された条件下で各治療と遺伝子型のため、少なくとも15植物を育てます。 </li><li>当時関心の葉は、（周囲の葉の渦巻きから出現）が表示され、葉が完全に展開されるまで（ 図1I）定規で毎日葉の長さの測定を開始します。葉長、葉の先端に土壌レベルからの長さを意味します。これは、その成長を変えるかもしれないので、破損したり、葉を傷つけないように注意してください。 </li></ol>1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：トウモロコシの葉の運動学的分析の概略関心の葉は、葉の伸長率（LER）を計算するために3日間連続定規で測定されます。その後、葉を収穫し、三センチセグメントが分裂組織のサイズを決意するために使用されます。これは、DAPI染色後の最も遠位の有糸分裂の図をベースまでの長さを測定することによって行われます。 （A）増殖性有糸分裂像の実施例、（B）造形有糸分裂像。ミッド静脈の反対側の葉の基部から最初の11センチセル長測定のための1001年センチのセグメントを切断するために使用されています。これらの測定は、成熟細胞の長さ（L マット ）および分裂組織（ リットルDIV）を残して、細胞の長さを決定するように機能するセルの長さのプロファイルを作成するための基礎を提供します。ザ<eLのDIV およびL マーは、分裂組織（N マー ）中の細胞の数を計算するために使用されるM&gt; LER 及びL マットは 、細胞産生率（P）を計算するために使用されます。次に、PおよびN マーは、細胞周期の継続時間（T c）がの逆数の平均細胞分裂速度（D）を計算するために使用されます。同じ色の矢印は、これらの矢印で次のパラメータを計算するために使用されるパラメータを示します。スケールバー=40μmの。ローマ数字は、プロトコルに記載された特定の実験手順を参照するために使用されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.収穫<ol><li>関心（ 例えば、出芽後三日目）の発達段階では、少なくとも5つの代表的なPを選択運動学的分析を実施する上でバッチからlants。最後の葉の長さを決定するために、ステップ1.3で説明したように、植物の残りの部分を測定続けます。 </li><li>植物の地上部分をカットします。無傷の分裂部分を維持するために、（ 図1II）の根にできるだけ近いを切りました。 </li><li>外側の葉から出発して、静かにそれらを一つずつをアンロールすることにより、関心の葉までのすべての葉を削除します。必要に応じて、葉を分離するためにベースからいくつかの余分なミリメートルを削除します。また興味深いの葉（ 図1iii）で囲まれた頂点と小さな葉を取り除きます。 </li><li>中間静脈の一方の側にベースから出発し、3センチセグメントを切断し、3を充填した1.5 mlの試験管に保存：1（V：V）無水エタノール：酢酸溶液（注意：手袋を着用する）に数ヶ月に24時間のアップのために4℃（ 図1iv）。このセグメントは、後に分裂組織の長さを決定するために使用されます。 </li><li>から静脈の反対側は、ベースから11センチメートルセグメントをカットし（ 図1 V）および顔料（ 図1のvi）を除去するために、少なくとも6時間、4℃で無水エタノールを充填した15mlチューブに入れてください。 注：その後、（説明を参照）セル長プロファイルを決定するためにのみ最初の10センチ使用しています。 </li><li>少なくとも24時間（ 図1vi）、4℃での洗浄の別のラウンドのために無水エタノールを更新。 </li><li>最後に、純粋な乳酸と無水エタノールに置き換えて（注意：手袋を着用）クリーニングと保管のために4℃で24時間、またはさらに使用する（ 図1vi）まで。 </li></ol> 3.分裂組織の長さの測定<ol><li> 50 mMの塩化ナトリウム（NaCl）、5mMのエチレンジアミン四酢酸を含有するリンス緩衝液を調製する（EDTA;注意：手袋を着用）および10mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（TRIS-HClを、pHが7）。 </li><li>セクション2.4から3センチメートルセグメントを取るので、20分（ 図1vii）用のバッファでそれをのk。 </li><li>待っている間、氷上、暗所でそれを維持する、を1μg/ mlの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色溶液を調製するためにすすぎバッファを使用。 </li><li> DAPI染色溶液中で2~5分間分裂組織セグメントを配置することによって核を染色します。氷の上で、暗い（ 図1vii）で働いています。 </li><li>すぐに顕微鏡ガラス上のセグメントをマウントし、カバーガラスで覆うことにより、蛍光シグナルを確認してください。基礎となる細胞層はいけないしながら、表皮細胞は、蛍光を示すべきです。 </li><li>染色が十分でない場合、いくつかの余分な分間DAPI染色溶液中にバックセグメントを入れます。 </li><li>染色を停止するには、カバーガラスと顕微鏡スライドとカバーにバッファをすすぐのドロップセグメントをマウントします。 </li><li>約1,000表皮の可視化を可能にする、20X倍率でのUV蛍光を備えた顕微鏡を使用してくださいアル細胞を一度に。セグメント全体でスクロールして、増殖性有糸分裂像（中期、後期、終期、および細胞質分裂）を探し、途上気孔（ 図1viii）の造形細胞分裂を回避する9。最も遠位の有糸分裂の数字が配置されている場所を定義します。 </li><li>葉のベースと最も遠位の表皮の有糸分裂の数字の間の距離を測定することによって、分裂組織の長さを決定します。画像フレームの全長を測定するために、画像解析ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。 <ol><li> （葉の根元から最も遠位の有糸分裂の図のように）完全な分裂組織の長さをカバーするフレームの数をカウントし、完全な分裂組織長（ 図1ix）を得るために、1フレームの長さによって、この数を乗算します。 </li></ol></li></ol> 4.セル長プロフィール<ol><li>乳酸（ステップ2.5）に格納されているセグメントを取り、ベンチに慎重に置きます。セグメントのウィットをカット1センチメートル各（ 図1×）の10セグメントにおけるヘクタールメス。 </li><li>乳酸の小滴に顕微鏡スライド上の連続した葉切片をマウントします。一貫向軸または背軸面を上のいずれかに直面することを確認します。原理的には、特定の側には優先順位がありません。 </li><li>葉の基部から始まって、セグメントを分析するために微分干渉コントラスト（DIC）光学系を備えた顕微鏡を使用してください。一貫して同じ細胞型を選択するために画像解析ソフトウェアを用いて気孔ファイルに直接隣接したファイル内の少なくとも20の反復の表皮細胞の長さを測定します。 <ol><li>セグメント（セグメントで十分あたり4箇所）のそれぞれに沿って等間隔の位置でこれを行い、そして葉（ 図1xi）を通じて、各測定のための対応する位置を書き留めてください。 </li></ol></li><li>局所多項式平滑pを用いて、葉軸に沿って各ミリにおける平均セル長を決定しますrocedure、R-スクリプト（;補足ファイル1 図1xii）に実装されています。 注：R-スクリプトはスムージングの増加に伴う一連のデータを提供します。必要な平滑化の量は、ある程度任意であり、理想的にはちょうど地元のノイズを除去するが、全体的な曲線に影響を及ぼさないはずです。一つの実験内の全てのサンプルについてスムージングの同じ量を使用してください。 </li><li>植物間の各位置でのセル長を平均葉の軸に沿った細胞の長さプロファイルを作成するための標準誤差を計算します。 </li></ol>機構パラメータの5.計算（補足ファイル2を参照してください） <ol><li> （ステップ1.3と同様に、例えば、24時間、）は、2つの連続する時点間葉の長さの変化を取得し、時間間隔で割ることにより、LERを計算します。 </li><li>細胞が成熟したCEの95％に達する、ベースからの位置の遠位に対応する成長ゾーン（LのGZ）の長さを計算します平滑化セル長プロファイル上のLL長。 <ol><li>その位置（ 図2）は、次の平滑セル長分布の各位置のすべてのセルの長さの平均の95％を取ります。 </li><li>各位置で計算された95％の細胞の長さを有する平滑細胞長（ステップ4.4）を比較します。 （;補足データ2を図2を参照）、葉の基部から開始し、成長ゾーンは、実際のセルの長さは、次のセルの長さの95％に等しい位置で終了します。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> 図2：成長ゾーンの終了を決定する分裂組織：赤い星で示す位置で、実際のセルサイズは、95％（赤点線）よりも小さい全てのセルの平均セルサイズのこの位置以下の（赤色の固体ライン）。成長ゾーン（LのGZの終わり;、abで示されていますLUEスター）は、この位置以下のすべてのセルの平均セルサイズ（青の実線）の95％（点線青線）は、実際のセルサイズに等しい位置しています。分割領域（D）、延伸ゾーン（E）、および成熟領域（M）。破線の矢印は、地元の大きさや葉の先端までの基礎の位置から移動した葉の先端部全体の平均サイズの95％の間の収束を示す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li>成長ゾーン（LのGZ）の長さと分裂組織の大きさ（;ステップ3で決定したLのマー ）との差として伸長領域（L エル ）の長さを計算します。 </li><li>成熟したゾーン内の平均セル長として成熟細胞の長さ（L マット）を計算します 。 </li><li>取得するには、l マットによってLERを割り細胞産生速度（P）。 </li><li> NのGZとN マーとの差である伸長領域（N エル ）のセルの数を計算します。分裂組織（N マー ）での細胞の数は、分裂組織に対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。成長ゾーン（NのGZ）中の細胞の数は、成長ゾーンに対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。 </li><li> P / Nのマーとして平均細胞分裂速度（D）を計算します 。細胞周期の継続時間（T c）は 、LN（2）/ Dに等しいです。 </li><li> PでN エルを分割することにより伸長領域（T エル ）で時間を計算します。分割ゾーン内の時間は、ログ2（N マー ）* T cを等しくなります。分裂組織を離れる細胞の長さ（L divの ）分裂組織の終わりに平滑化セル長プロファイルからセル長に等しいです。 </li><li> LN（ リットルマット ）-ln（ リットルdivの ）] / T エル ：平均以下の式を用いて細胞増殖率（R エル）を計算します 。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

トウモロコシの葉の完全な運動学的分析は葉の成長の細胞基盤の決意を可能にし、効率的なサンプリング戦略を設計することができます。プロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの注意が次の重要なステップで推奨されている：分裂組織の長さの決意（ステップ3）が完了を必要とするため、（1）分裂組織に損傷を与えることなく、若い、同封の葉（ステップ2.3）を取り外すことが重要で?...

成長の分析は、一般的に環境要因への遺伝子型決定の成長の違いおよび/または表現型の応答を記述するために、植物の科学者によって使用されている一連のツールに依存します。彼らは、サイズと重量植物全体または器官の測定と成長の基礎となるメカニズムを探求する成長率の計算を含みます。臓器成長は細胞分裂および細胞レベルで膨張することによって決定されます。そのため、成長中のこれらの2つの方法の定量化を含めて、全体の臓器の成長1の違いを理解する鍵と分析しています。これにより、非専門の研究所によって使用することが比較的容易である細胞の成長パラメータを決定するための適切な方法を有することが重要です。 キネマティック解析はすでに臓器成長モデル2の開発のための強力なフレームワークを提供するアプローチとして確立されています。技術は線形システム用に最適化されました、このようなシロイヌナズナの根と単子葉植物の葉などが、また、このような双子葉葉3のような非線形システムのため。今日では、この方法はますますどの遺伝子、ホルモン、発達研究するために使用され、環境要因が、様々な器官（ 表1）に細胞分裂および増殖に影響を与えます。制限は、植物材料のより高い量を必要とする技術（ 例えば、代謝産物のための器官の大きさ及び空間的構成によって課すことができるが、また、それはまた、その基礎となる生化学分子、および生理学的規則（ 表2）に細胞プロセスをリンクするためのフレームワークを提供します測定、プロテオミクス、 など ）。 例えば、トウモロコシ（ トウモロコシ ）の葉、単子葉葉は、順次成熟に到達するために分裂組織と伸びゾーンを通過し、細胞が先端に向かって葉の基部から移動する線形システムを表しますゾーン。これは、成長4の空間パターンの定量的研究のための理想的なモデルシステムになります。また、トウモロコシの葉は、大きな成長ゾーン（数センチメートル5に及ぶ分裂組織と伸びゾーン）を持っているし、他の組織レベルでの研究の可能性を提供します。これは、分子技術、生理学的測定、および細胞生物学のアプローチ（ 表2）の範囲で運動学的分析により定量化し、細胞分裂と拡張を制御する（推定）調節機構の調査を可能にします。 ここでは、単子葉植物の葉に運動学的解析を行うためのプロトコルを提供します。まず、葉軸に沿った位置とどのように運動学的パラメータを計算するの関数として細胞分裂と細胞伸長の両方の適切な分析を行う方法について説明します。第二に、我々はまた、このサンプリングの設計のための基礎として使用することができる方法を示します。高解像度のサンプリングAN：ここでは、2例を議論しますdはそれぞれ、改善されたデータの解釈と時間/お金の節約を可能にする、サンプリングを集中しました。 動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 器官 </td><td> 参照 </td></tr><tr><td>単子葉植物の葉</td><td> 16、20、21、22 </td></tr><tr><td>根の先端</td><td> 2、23、24、25、26、27、28、29 </td></tr><tr><td>双子葉植物の葉</td><td> 21、30、31 </td></tr><tr><td>頂端分裂組織を撃ちます</td><td> 32 </td></tr></tbody></table> 動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。 分子レベルでそれらの調節に運動学的分析によって定量化細胞プロセスの間に、表2のリンク。様々な種及び臓器における生化学的および分子アッセイからの結果に細胞プロセスの定量化を結ぶ様々な研究への参照。キシログルカンendotransglucosylase（XET）、マロンジアルデヒド（MDA）、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td></tr><tr><td>Planting substrate</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Any</td><td>Any</td><td>An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td></tr><tr><td>Seeds</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Seeds can be ordered from a breeder.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL falcon tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td></tr><tr><td>Lactic acid&amp;nbsp;&gt;98%</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &amp;ndash; Single exposure, category 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidine-2&amp;prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Ice</td><td>Any</td><td>NA</td><td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td></tr><tr><td>Microscopic slide</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td><td>NA</td><td>The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td></tr><tr><td>Microscope equipped with DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td></tr><tr><td>R statistical analysis software</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>R script</td><td>NA</td><td>NA</td><td>We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&amp;nbsp; Kernel Smoothing: Chapman &amp;amp; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.</td></tr></tbody></table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

ここで、我々は彼らの葉の成長の面ではよく水やり植物（対照、54％土壌水分量、（SWC））と乾燥ストレス条件に付し植物（干ばつ、34％SWC）間の比較を示します。すべての植物は、制御された条件（16時間の日/ 8時間の夜、25℃/ 18℃の昼/夜、300-400μEm-2秒-1光合成有効放射（PAR）の下で成長チャンバー中で増殖させた。干ばつ正しいSWCに達した後、さ?...

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Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化<em&gt;トウモロコシ</em&gt;葉

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K ビュー.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

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Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

生化学

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

発生生物学

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in indentation mode, we show how to measure an elastic modulus and use it to evaluate cell wall mechanical properties. In addition, we also explain how to evaluate turgor pressure. The main advantages of atomic force microscopy are that it is non-invasive, relatively rapid (5~20 min), and that virtually any type of living plant tissue that is superficially flat can be analyzed without the need for treatment. The resolution can be very good, depending on the tip size and on the number of measurements per unit area. One limitation of this method is that it only gives direct access to the superficial cell layer.

Here, we present atomic force microscopy (AFM), operated as a nano- and micro-indentation tool on cells and tissues. The instrument allows the simultaneous acquisition of 3D surface topography of the sample and its mechanical properties, including cell wall Young's modulus as well as turgor pressure.

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

生物工学

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

生物学

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

細胞拡散時の細胞エッジダイナミクスの定量的解析

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化

要約

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この動画の章

レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

別の植物種から茎頂の共焦点のライブイメージング

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングとシロイヌナズナの微小機械的操作

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

細胞拡散時の細胞エッジダイナミクスの定量的解析

細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化

要約

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レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

細胞拡散時の細胞エッジダイナミクスの定量的解析

別の植物種から茎頂の共焦点のライブイメージング

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングとシロイヌナズナの微小機械的操作