このプロトコルは、植物における微小管細胞骨格の挙動の発生を理解するのに役立ちます。同時に、細胞や臓器の形状に影響を与えるこれらの構造成分が機械的な力の変化にどのように反応するかを理解するのにも役立ちます。しかし、この方法はほとんど洗練された必要はありませんが、それは堅牢な、定量的な読み取り後、異なる遺伝子型と条件間の機械的応答の違いを提供します。
1週間の長い日の条件下で20度と6°Cで、土壌中の緑色蛍光タンパク質と融合した微小管結合ドメインを発現するシロイヌナズナズの種子を成長させることから始めます。発芽後、強力な栄養成長を可能にする十分な成長スペースを持つ新しいポットに苗を移し、短い日の条件下で20度と16度の植物を置きます。3~5週間後、植物をボルトまで同じ温度で長い一日の条件に戻し、花序を2〜5センチメートルまで成長させます。
シュートアピカルメリステム解剖のために、花序を入れて、古い花の芽を取り除くために肉眼でペダンクを見ることが困難になるまで、ペダンルクの基部の花を剥がすために鋭い鉗子を使用します。鉗子を使用して、解剖皿の中にアグロスにスリットを作成し、花序ベースを厚いオーグルに植えます。皿を解剖顕微鏡の下に置きます。
最も古い花芽から始まり、植物から花の芽を削除するために鉗子でプッシュ。シュート・アペリカル・メリステムは、通常、ステージ6〜7までの古い花が取り除かれると露出します。そして、シュートのアピカルメリステムが見えるまで、各花芽を押し下げるために鉗子を使用してください。
すぐに、シュートの叙液状メリステムが露出されると、エタノール滅菌された長方形のプラスチックヒンジ培養ボックスに新たに解剖したサンプルを培地表面の上に露出させたシュートのアピカルメリステムと共に培養ボックスに入れておきます。培養ボックスの端に滅菌脱イオン水を数滴加え、蓋を閉じて箱の中の湿度を維持します。箱をマイクロポアテープで包み、成長箱を12〜24時間摂氏22度の長いまたは連続した日の条件下に置きます。
解剖手順から植物が回復したら、滅菌脱イオン水でサンプルを覆い、解剖顕微鏡の下で気泡をチェックします。培養ボックスをアップリ直立型共焦点顕微鏡ステージに移し、40または60X水浸漬レンズを選択します。水に目的を下げ、物体の前面レンズに気泡がないか確認します。
気泡を取り除くために、ステージを下げ、光学組織でレンズを静かに拭きます。その後、パスツールピペットを使用して、水にレンズを再浸漬する前に、目的のフロントレンズに少量の水を追加します。次に、コンフォーカル顕微鏡のGFPフィルタとエピイルミネーションモジュールを使用して、サンプルを見つけるためにXYコントローラを調整します。
眼の位置を調整し、光源の直下に射目のアピオメリステムを配置し、頂点が配置されるまでZ軸に沿って焦点を合わせます。サンプルを照らすのにGFPを励ますことができるレーザーを使用し、顕微鏡の光学ズームを調整して、撮影の全てのパイオメリステムとステージ1の花のプリモリアが視野に入るようにします。次に、レーザー出力のパワーとゲイン設定を調整し、最適な信号対雑音比を得ます。
サンプルを2~5分間落ち着かせ、0.25~0.5マイクロメートルのZスライス間隔でサンプルの共焦点Zスタックを取得し、約0.3マイクロメートルのピクセルサイズの解像度を追加します。取得終了時に、すぐに水を取り出し、培養箱を成長室に戻します。マイクロメカニカルシュート・アピカル・メリステム・摂動のために、先述のように皮質微小管組織のアブレーション前画像スタックを取得し、培養箱から培養皿に水をデカフします。
分析顕微鏡の下でシュートのアピカルメリステムを移し、ゆっくりときれいな0.4 x 20ミリメートルの注射針でシュートのアピカルメリステムに近づいた。アブレーションが完了したことを確認するために、針先でシュートのアピカルメリステムのドームの周辺を簡単に接触します。そして、滅菌脱イオン水で培養皿を補充します。
次に、ヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり10マイクログラムを皿に加え、2時間ごとに6時間ごとに実証したように画像スタックをすぐに取得し、各時間の間の培養皿をインキュベーションに戻します。データ解析では、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して画像スタックの表面投影を生成し、フィジーのフィブリルツールマクロを使用して皮質微小管異方性の抽出を行います。ここで、組織化されていない皮質微小管を含むドームの中心にある細胞を有する微小管結合ドメインGFP線から得られた典型的な投影画像は、周囲の細胞、細胞の長い軸に平行に整列した皮質微小管を含む周回分布および境界ドメイン細胞を有する。
タイムラプスイメージングは、アブレーションの6時間以内に、非常に乱れたアレイからより組織化されたアレイに変化する皮質微小管アライメントを示す。テンソルは皮質微小管画像に重ね合わせることができ、抽出された情報は時間の経過とともに平均異方性をプロットすることによって表すことができる。レーザー出力の出力電力とゲイン設定を調整する際には、フィラメントを明確に観察し、飽和した信号が後の分析で引張方向に偏る可能性がありますので、過度の露出を避けるようにしてください。
原子間力顕微鏡を用いて、機械的な力の変化が実際に細胞壁の物理的状態に与える影響を評価することもできます。
