植物細胞の機械的特性は、開発の根底にあるメカニズムを理解しようとする際に考慮に入れ不可欠です。原子間力顕微鏡は、これらの特性を測定し、臓器、組織間、すべての発達段階の間で変化する方法に従うために使用することができます。この技術の主な利点は、それが侵襲的でなく、比較的迅速であり、それが直接生きているサンプルに適用することができるように治療を必要としないことです。
この手順に新しい人のために、サンプルのcisセクションは本当に重要ですので、サンプルの機械的な固定が実際に適切であることを確認してください。この手順の視覚的なデモンストレーションは、サンプル固定、フォスターの品質管理および測定セットアップの複雑さをよりよく理解するために重要である。この手順をデモンストレーションするには、エンジニアのシモーネ・ボビオと、私の研究室のポストドクターであるユーチェン・ロンです。
まず、直径5センチメートルのシャーレの中央に両面テープを入れます。花芽から分離された遺伝子のサンプルをテープに追加します。脱水を避けるためにサンプルが完全に覆われるまで、皿に水を素早く加えます。
次に、サンプルを AFM ステージに置き、サンプルの上になるようにヘッドを移動します。カンチレバーを校正した後、ソフトウェアでは、システムがQIモードであることを確認し、15ナノニュートンの設定点力でサンプルにアプローチします。次に、Z の長さを 4 ミクロンに設定し、スキャン領域を 80 x 80 ミクロンに設定し、ピクセル数を 40 x 40 に設定します。
次に、高度なイメージング設定パネルに移動し、モードを一定の速度に設定します。さらに、トラック速度を毎秒200ミクロンに入力し、サンプルレートを25キロヘルツに設定します。パラメータを設定したら、サンプル上の対象領域にヒントを移動します。
スキャンする領域に破片が含まれないように確認し、可能な限り平坦な領域を見つけて、エンゲージしてからスキャンを開始し、サンプルが動くかどうかを確認するために急速な低力スキャンを使用します。関心のある領域が見つかったら、40~60×60~60ミクロンの領域を選択し、ピクセル数をミクロン当たり2ピクセルに増やします。次に、設定点を500ナノニュートンに増やし、100〜200ナノメートルのインデントを得る。
Z の長さを 2 ミクロンに下げ、延びる速度を毎秒 100 ミクロンに入力し、サンプルレートを 50 キロヘルツに増やして、サンプルのスキャンを開始します。完了したら、出力をイメージとデータ ファイルの両方として保存します。データ処理ソフトウェアを開き、データファイルをロードします。
マップのすべての曲線で同じパラメータを使用するには、[このマップをバッチ処理に使用] ボタンをクリックし、定義済みのプロセスをロードし、ヘルツフィットを選択します。次に、切り替え可能な基本線の操作に移動し、オフセットとチルトに減算を設定し、X 分を 40 ~ 60% に設定します。垂直の先端の位置タブで、生データを操作する場合は、スムーズにタイトに選択します。
適切な適合モデルを選択するには、弾性フィットタブに移動し、予想される接着強度に基づいてオプションの 1 つを選択します。接着性が無いか弱い場合は、アプローチ曲線を使用し、ヘルツイズナードモデルを使用することを好みます。より強い接着の場合は、ダーゲン・ミリア・ドルトプロフまたはDMDのモデルを使用し、遅滞曲線に取り組みます。
ここで、公称先端形状に基づいて、先端幾何学的パラメータを設定します。この実験で使用される先端は、半径400ナノメートルの球状の先端である。次に、ポアソン比を 0.5 に設定し、シフトカーブを選択します。
メイン ウィンドウのアイコンをクリックして、2 つ目の弾性フィット ルーチンを追加し、同じパラメーター設定を繰り返します。最後に、X 分で目的のインデントを指定し、すべてのマップの曲線上で前のステップを反復処理するために、すべてを保持して適用します。結果を保存して、ドット tsv ファイル内のイメージを取得します。
迅速な溶液の変化を測定するには、小さな粘着マスチックを保持して、シャーレにサンプルを取り付けます。マスチックとサンプルベースの間の隙間を生体適合接着剤で素早く密封します。接着剤が固まり、0.1%の植物保存混合物を含む液体の頂点培養培地にサンプルを沈下するのを待ちます。
システムのキャリブレーションが終了したら、取得ソフトウェアを開き、まずチェックパラメータウィンドウに移動します。そこでは、カンチレバーの製造スプリング定数または確定スプリング定数にばね定数を設定します。次に、先端半径を400ナノメートルに、サンプルポアソン比を0.5に、サンプルラインを128に設定して迅速な取得を保証し、スキャンレートを0.2ヘルツに、スキャンサイズを1ミクロンに設定します。
次に、ランプ ウィンドウに移動し、ランプ サイズを 5 ミクロン、トリグしきい値を最大値に、サンプルの数を 4,000 6008 に設定します。すべてのパラメーターを設定して、サンプルを慎重に手動でアプローチします。プローブがサンプル表面に比較的近い場合は、[アプローチ] をクリックします。
接触すると、サンプルまたはチップを損傷することなく、所望のバランスに達するまで、スキャンサイズを徐々に増やし、スキャン速度を変更します。測定領域が希望どおりでない場合は、スキャンを再配置します。満足したら、ポイントとシュートウィンドウを開始するために、ボタンをクリックし、ポイントとシュートを撮影します。
保管ディレクトリーとファイル名を指定します。次のスキャンでランプをクリックして、記録を開始します。スキャンが完了すると、ソフトウェアインターフェイスはランプウィンドウにリダイレクトされます。
スキャンした画像をクリックして、インデントする位置を指定します。ベリーの中心付近のセルごとに少なくとも3つのインデント点を選択し、1 辺に 3 回インデントを繰り返すように設定してから、ランプをクリックしてキャプチャします。解析ソフトウェアでは、ドットMCAファイルを開き、スキャンした画像上の各力曲線の位置を示します。
次に、解析する 1 つの力曲線を開きます。基準線補正ボタンをクリックし、ソースの基準線の開始と延長がソースの基準線の終了位置まで、またはそれぞれ 0%と 80% になるまで、フォース カーブの青い破線をドラッグします。次に実行をクリックします。
次に、ボックスカーのフィルタボタンをクリックし、実行をクリックして力曲線を滑らかにします。次にインデント ボタンをクリックします。入力ウィンドウで、アクティブカーブを延長に設定し、5 番目の方法を線形化モデルに、最大フォース フィット境界を 99% に、最小フォース フィット境界を 75% に設定し、剛性に適合するモデルを設定します。
一括で力曲線を解析します。これを行うには、[実行履歴] ボタンをクリックし、レポート ディレクトリを指定して、同じ処理を必要とする他の力曲線を追加します。完了したら、[実行] をクリックします。
K の値がバッチフィットされたら、[履歴] をクリックし、5 インデントに移動してインデント ウィンドウに戻ります。そこで、最大フォース フィット境界を 10% に変更し、最小フォース フィット境界を 1% に変更します。次に、フィット モデルをヘルツィアンに設定します。
次に、適切なファイルを開いて、スキャンした異なるチャンネルを表示します。ハイチャンネルウィンドウで、セクションボタンをクリックします。これにより、ターゴール圧力の控除に必要なサンプル表面曲率の測定が可能になります。
次に、1 つのセルの長い軸を横切って線を描き、破線の境界をセルのエッジに移動して、半径の値を記録します。最後にテキストプロトコルに沿って、平均ヤング率、ばね定数、E、K、および各セルのturgor圧力を計算します。左の画像は、右側の画像を通してユーザー定義の力セットポイントまでの全体のインデントを分析することによって得られた若者の係数の地図であり、最初の100ナノメートルのインデントの分析の結果を示しています。
この 2 つのマップは非常に類似していますが、インデントの深さの変化によりサンプルの異種が強調される場合があり、場所の特定や内部構造の動作に関する情報の提供に役立ちます。これらのマップ上の各ポイントには、基礎となる力曲線があります。ここに示す曲線は、言及する価値のある2つの効果を持っています。
まず、力曲線の接近部が500ナノニュートンで終了する場合。下向きの先端の動きは続きます。チップによって適用される最終的な力が予想よりも高いことを意味します。
2つ目の点は、楕円で強調されたリトラクトカーブ上の波です。このような振り手は、チップの作用下でのサンプル移動や振動の指標となり得、別の固定方法への切り替えが必要とされ得る。この記事で説明した手順を使用すると、細胞壁の厚さを除くターゴール圧力控除の主要パラメータはすべて、AFMスキャンとインデントから取得できます。
赤十字位置における深いインデントの力曲線は、細胞壁若い弾性率と、曲線の異なるレジームにおけるサンプルの見かけの剛性を表します。サンプル固定は非常に重要です。測定プロセス中、サンプルの不安定性の兆候に注意してください。
垂直なインデントを確保するために、平らなサーフェスを持つ領域を慎重に選択します。この手順に従って、時間の経過と共に機械的特性を監視し、さまざまな条件を監視できます。また、相関研究のための共焦点画像で機械的測定をオーバーレイすることもできます。
この技術は、バイオメカニクスと生理学の開発やその他の生物学的プロセスを結びつける道を開きます。
