私たちは、オーディオ機器のための重要な読書/視聴のためにマーチャーシュFendrychとステファンStadlbauerに感謝します。 OpenSPIMへの貢献のためのISTオーストリアでMIBAマシンショップに感謝します。これらの結果につながる研究がREAグラント合意N°[291734]と欧州研究評議会（プロジェクトERC-2011の下で、欧州連合（EU）のセブンス枠組み計画（FP7 / 2007-2013年）の人々プログラム（マリー・キュリー・アクション）から資金提供を受けています-StG-20101109-PSDP）。

1.シロイヌナズナ培養イメージングの前に<ol><li> 10グラムのスクロース、0.97グラムのMES（2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸）と1のLのddH 2 O（二重蒸留水、2.15グラムMS-培地を加えることによって、（半強ムラシゲ・スクーグ培地）½MS培地を準備）1リットルボトルに。 KOHを使用してpHを5.8に調整します。 </li><li> ½MS培地に15グラム/ Lのジェランガムを追加し、121℃で20分間、それをオートクレーブ。 </li><li>約2mmの厚さを有するゲルの層を作成するために、正方形のペトリ皿（245 X 245 X 25ミリメートル）に熱い培地30mlを注ぎます。料理は、媒体が固化することを可能にするために、室温まで冷却してみましょう。 </li><li> 1 mLの滅菌H 2 Oは、ガラスピペットまたは千μLのピペットチップを使用して種をピックアップし、ゲルの表面上にそれらをまく含む1.5 mLの反応管に滅菌したシロイヌナズナの種子を置きます。別に約10mm離れて種子を置きます。テープでプレートをシール。 </li><li> 4で24時間プレートをインキュベート°C（成層）。 </li><li> 6日間の光の120〜140マイクロモル/㎡/ sの量で16/8時間昼/夜サイクルで22℃で例えば 、成長インキュベーター内でプレートを育成。 10日まで、古い植物を使用することができます。 </li></ol> 2.植物試料調製方法注意：試料ホルダーは、3Dプリントすることができるのいずれか、または手が図2Cに示されている寸法を使用してマシンのワークショップで行われました。 3Dモデルファイルは、補足資料（Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl）に設けられています。材料リストに3Dプリントを注文するためのリンクを参照してください。 <ol><li> 5gを50mlの半MS培地を含む50mLのボトルにアガロース低融点及び121℃で20分間、それをオートクレーブ加えます。 </li><li> 1.5mLの反応チューブ中の1％低融点アガロース溶液のアリコート。 4℃で保存は（少なくとも二ヶ月のために使用することができます）。 </li><li> 80℃で1 %%低融点アガロースのアリコートを融解し、それがダウンして冷まします33°C。 </li><li>超音波ユニット内の試料ホルダーを清掃してください。 70％エタノールで試料ホルダーを滅菌し、滅菌水で洗浄します。 </li><li>メスを用いて植物の周りにゲルをカットします。 </li><li>平らなへらでブロックを持ち上げて、第二のスパチュラを用いて試料ホルダーに慎重にスライドさせます。 </li><li> 100μLのピペットを使用して（33℃）を1％アガロースを用いて試料ホルダーにゲルを接着。 </li><li> 10μLピペットを用いて、1％アガロースでゲル上で植物を接着。葉はゲルで覆われていないことを確認するために、立体顕微鏡を使用してください。関心のある領域に直接ゲルを配置しないでください。 </li><li>乾燥から植物を防ぐために、途切れることなく動作します。可能な限り千μLのピペットチップ内に試料ホルダーを挿入します。キャップとしてピペットチップを使用し、植物が配置されているサンプルホルダの一端の上に慎重にスライドさせます。 </li><li>ピペットチップボックスに試料ホルダーを入れ、必要に応じてより多くの植物を準備します。植物はDIRECすることができますTLY画像化され又は成長インキュベーターに戻さ。 </li></ol> 3.顕微鏡を設定します注：LED照明システムは、特注のランプです。 LEDリングを構築するために必要な技術的な詳細は、図3および材料のリストに記載されています。基板設計のための補足資料ファイル（Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd）を参照してください。 <ol><li>ネジや接着剤（ 例えば両面テープ）OpenSPIM X / Y / Z /θステージアームの下側のLEDリング。 </li><li>調整可能な電源（0-30 V、最大2 A）でLEDリングを接続します。 </li><li> （シロイヌナズナ、120〜140マイクロモル/メートル2 / s で 、 図3Dのための）所望の光強度に電圧を調整します。 </li><li> 70％エタノールで試料室を滅菌し、滅菌水で洗浄します。 </li><li>ベンジンやレンズクリーニングティッシュで対物レンズを清掃してください。 70％エタノールを用いて対物レンズを滅菌します。 </li><li> perfusiを接続します一方向の配列内の試料室にチューブに。新鮮な½MS培地と蠕動灌流ポンプの隣に別の空のボトルを含む1リットルのボトルを置きます。 1灌流チューブを使用して、試料室の下側の入口と媒体とボトルを接続します。別の灌流チューブを使用して使用される媒体をゴミ箱に空き瓶と試料室の上部の排気口に接続します。 </li><li> 1mL /分への流れの速度を設定します。 注：試料室をオーバースピルしないために、それが流入よりも流出を有することが重要です。ポンプ速度を増加または流出のための大きな内径を有する管を使用しますか。 </li><li> 70％エタノールで洗浄し、水面上に試料室に置く前に、それらを乾燥させ、3ミリメートルの小さな正方形に黒いプラスチックホイルをカット。 </li><li>試料ホルダーからピペットチップを取り外し、試料室に試料ホルダーを挿入します。新たに製造されたサンプルホルダーがステージアームの形状に合わない場合は、細かい砂を使用しますそれは薄くするか、それが薄すぎる場合には、Oリング（∅6ミリメートル）を使用する紙。 </li><li>ふたを作成するには、2 50×25ミリメートル片に黒のアルミ箔をカット。各ピースの一辺の中央でカット5ミリメートルを行います。三角形のくぼみ（ 図1D）を作成するために折ります。三角形のくぼみは、試料ホルダーを向けた状態で試料室の上部に蓋を置くことにより、2つの蓋でサンプルチャンバーを閉じます。植物の葉は、蓋の日陰ではなく、照明系からの光を受けていることを確認してください。 </li><li>視野内の新興側根を配置するためにX / Y / Zと回転ステージを使用して、関心領域を探します。 </li><li>記録する前に、システムは、少なくとも15分間平衡化することを可能にします。 </li><li>セットアップ画像取得。 <ol><li> 3μmのzの間隔で217の画像（650ミクロン）のスタックを設定し、17時間の全期間の15分の撮像間隔で経過時間を設定します。 注：上の詳細なドキュメントOpenSPIMソフトウェアを動作させる方法（http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack）で見つけることができます。 </li></ol></li><li>記録を開始します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

光シート蛍光顕微鏡は、低毒性及び生理学的状態で試料を保持したまま、高時空間解像度で大容量をキャプチャするために使用することができる超高速取得速度を、結合する大きな利点を有します。光シート顕微鏡の解像度は、共焦点顕微鏡9のそれと比較することができます。しかし、光の散乱や吸収が個別に励起および放出経路に沿って発生し、全体的な画質は、表面に比べて不透明な組織内部の有意に低いことができます。この合併症を回避するために1は、垂直軸に沿ってサンプルを回転させ、異なる方向から同じボリュームを観察する可能性を使用することができます。しかし、これは必ずしも有利ではない、 例えば側根は、より多くの情報を得ることなく、低画質の結果後ろから根およびイメージングの一方の側に現れます。しかしながら、回転は、主SAMPを正確に位置決めすることができます最良の方法でル。対物レンズの古典的な水平方向の配置は、サンプル実装の新しい方法を可能にします。植物が垂直位置から利益を得ます。ここで紹介する、「ゲルの表面上の「実装方法は、このようなゲル24,25の内側に根を埋め込むなど、他の取り付け方法に比べていくつかの利点があります。 1）根系は、液体媒体と直接接触しています。試料室は、連続的に新鮮な培地を提供する灌流システムに接続されています。また、急速に、異なる媒体または薬剤を適用するために、サンプルチャンバの全体積を交換するために使用することができます。彼らは実験室で成長させるために使用される2）前準備植物が成長サンプリングします。植物は、蛍光顕微鏡下で選択することができ、唯一の希望植物が用意する必要があります。 3）植物がタッチされることなく、シャーレから試料保持部に転送されます。これにより、植物は、さらに、それが成長incubato中に成長していた同じゲル上で開発することができますrおよび機械的ストレスが最小限に低減されます。 4）試料上の図は、サンプルと検出目的との間の空間は、単に屈折率が異なる媒質なし他の材料で充填されているため、遮るもののない、光収差が最小になります。 長期的イメージングを行うために、植物の照明システムは、植物の光合成活動を確保する必要があります。ほとんどの研究室では植物は根が光にさらされている。すなわち 、透明なゲルに成長します。これは、自分の環境に対して異なる応答を引き起こし、それらの生化学および開発26,27の変化を誘導することができます。根系の光の量を低減するために、黒いプラスチック箔を水表面を覆うために使用されるだけでなく、黒色アルミニウム箔製の蓋は、サンプルチャンバをカバーしました。植物に達することができる光は、蓋内の中央穴を通って出ます。この設定では、背景光の増加は、suggestinを認められませんでした赤色および青色LEDからの迷光の量が有意にGFPフィルター及び遮光アプローチによって減少したG。この光は、カメラのバックグラウンドノイズを増加させることなく、画像収集中にオンに保つことができました。 サンプルホルダーは、3D印刷のために設計されています。試験されたいくつかのプラスチックは、試料のドリフトで、その結果、100％安定していなかったとしてしかし、材料の選択が重要です。したがって、代わりに樹脂を使用するか、またはポリエチレン（PEP）ロッドを粉砕することにより、試料ホルダーを構築することをお勧めします。両面照明システムの光シート顕微鏡セットアップを使用する場合、試料ホルダは、回転角度に応じて光シートの干渉する可能性があります。プレートから植物をすくう時の機械的ストレスを低減するために、スパチュラの平らな角度を使用します。植物はすぐに乾燥して、非常に最初の時間のための空気の流れを体験することができます。ヲ、任意の風（急速な運動、エアコンの流れ）を避けるようにしてください可能な限りrkが途切れ1,000μLのピペットチップ内に試料ホルダーをスライドさせます。顕微鏡の内部では、液体でプラント全体を浸し、乾燥した葉を保持しないことが重要です。 技術は、側根形成の初期段階を撮像するための理想的です。成熟した根の先端の長期撮影を行う場合には1は、シロイヌナズナの根が視野の外に急速に、100〜300ミクロン/時間と一緒に成長することを心に留めておく必要があります。非常に便利な将来の実装では、長期間にわたって、次の根の先端成長を可能にする自動化された追跡アルゴリズムである可能性があります。取得プロセスの間に、光媒体の栄養組成物などの環境条件を制御する能力は、植物は、変化に適応する方法を検討可能にします。ルートは、デキサメタゾン誘導性28またはβ-ESTRを使用して、例えば、化学的に遺伝子発現を活性化する薬剤を適用するために使用することができる液体媒体と直接接触します誘導システム29を adiol。しかし、それは、薬物を洗い流すために試料室の容積全体を交換するために時間がかかります。セットアップは、培地交換を促進するために試料室の容積を最小化することによって改善することができます。それにもかかわらず、この技術は、大きな可能性を秘めています。光シート顕微鏡を用いた実装手順、標準化された生育条件と穏やかな画像取得の組み合わせは、生理的なレベルでの高解像度で、植物の開発の長期的な研究を可能にします。これは、研究者は、植物の開発の基本的なメカニズムを探求するのに役立ちます。

単一細胞は器官分化と増殖の間にどのように動作するかを理解所の開発における重要な問題の一つがあります。理想的には、遺伝子発現パターンと細胞内のタンパク質の局在化のような細胞事象は、組織のより大きな文脈に照らして見ることができます。この目的は、技術的な課題を提起し、高い空間だけでなく、光毒性作用を引き起こす可能性があり、長期間にわたって時間分解能で全臓器の観察を必要とします。植物はすぐに環境の変化に適応するので、成長条件を厳密に制御しなければなりません。植物の生理学的状態に干渉することなく、長期的画像化を行うために、三つの試料室内に、1）成長条件を確保しなければならない、2）安定した長期間にわたって実装サンプル、および3）イメージング低光強度で光損傷および非生理的条件を避けるために。 生理的成長conditi顕微鏡試料室におけるアドオンは、長期の実験のために重要です。 3 -共焦点顕微鏡1のためのイメージング成長チャンバーを記述する利用可能なプロトコルの数があります。しかし、共焦点顕微鏡は、ストレス反応を引き起こす可能性が植物に高い光強度を紹介し、通常4増殖を阻害します。また、ほとんどの従来の顕微鏡は、彼らが自分自身を再配向し、重力のベクトルに向かって成長しようとするので、植物には最適ではないサンプルの唯一の水平方向の位置を、可能にします。 9 -過去10年間で、光シート顕微鏡は、数日から5までの期間のための細胞の解像度で大標本の開発をキャプチャするための強力なツールとして浮上しています。ライトシート顕微鏡は、垂直方向に試料を配置することができますし、ますます10根の発達を研究する植物の研究に使用されている-最近、ベルテによってレビュー21、トンとMaizel 22。上記の研究10,13の多く- 18,21-は、ゲル17の表面に根を成長させることによって特徴付け実装サンプルの特別な方法を採用したエルンストHK Stelzerの実験室に最適化され、実施されました。これらの研究では、特注の顕微鏡た植物を下から保持され、使用されました。これとは対照的に、広く利用可能な光シート顕微鏡の大部分は上部からのサンプルを保持します。したがって、この特定の調製方法を容易に適用することができません。ここで紹介する方法はOpenSPIM 23、選択平面照明顕微鏡（SPIM）を適用し、強化するためのオープンアクセスプラットフォームに適用可能な十分に確立された上で、表面実装方法のためのプロトコルを提供します。 このプロトコルの全体的な目標は、OpenSPIM光シート顕微鏡でシロイヌナズナの根の長期的なイメージングを可能にすることです。これは、複数の直立した植物を成長させることによって達成されます液体培地にルーツを持つゲルのurface葉は空気中のまま。植物の光合成活動を確保するために、カスタムメイドの照明システムは、葉ではなく、根（ 図1）を照明します。

<table><tbody><tr><td>Agarose, low melting</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Black aluminum foil</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Black plastic foil</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blue (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&amp;nbsp;CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED red (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED board - PCB design software</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohydrate</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sample holder 3D print</td><td>i.materialise</td><td>&lt;a href=&quot;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&quot;&gt;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

光シート顕微鏡（ 図1）を用いて根系を観察しながら、この試料調製方法は、顕微鏡試料室内部に植物の栽培を可能にします。植物は、カスタム設計されたサンプルホルダー（ 図2）に搭載されたゲル（1/2 1.5％ジェランガムを含むMS培地）の層の表面上に成長します。サンプルホルダーは3Dは、材料として透明樹脂を使用して印刷されます。寸法を強調製造バージョンを、 図2Cに示されています。根は、連続的に灌流システムによって更新された液体（1/2 MS培地）中に浸漬されています。葉は空気中に残り、継続的に130マイクロモル/㎡/ sは、植物（ 図1A、Bおよび図3A-C）上記リング状に配置されている青色と赤色LEDからの光強度で照明されています。 LEDリングは、私たちのマシンのワークショップで製造されており、我々は、 図3及び材料リストにLEDリングを構築する方法についての技術的な詳細を提供します。光強度は、連続的に30〜250マイクロモル/ m 2 /秒（ 図3D）の範囲に調整することができます。根系は、水面を覆う黒色プラスチックホイルの小シート（ 図1）によって遮光されます。検出レンズにより集光された照明の任意の迷光がGFPフィルタ（ 図3E）によってフィルタリングされます。 この設定では、成長しているシロイヌナズナ側根の時間経過は、20X / 0.5レンズ（ 図4）を使用して、17時間記録しました。側根は、プライマリルートの奥深くに位置している鞘細胞層、中にその起源を持っています。延長期間にわたって組織の内部より深い撮像能力を実証するために、より高い倍率（40X / 0.75）は、横方向ROの形成を捕捉するために使用しました。38時間（ 図5）の期間内にプライマリルートのうち出現までの第一段階の原基からOT。データセットの典型的な2Dスライスは、図に示されています。図5（b）。この記録は、細胞の解像度で3D（ 図5A）における側根形成のダイナミクスに追従することを可能にします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> 図1：OpenSPIM 試料室内の成長条件。 A）は、撮像室のスケッチ。植物は、ゲルの表面上に直立成長している（ 図2も参照）、カスタム構築されたサンプルホルダーに取り付けられました。根は継続的に灌流システムにより交換された液体培地中で成長しています。植物は、大気中で成長し、赤色及び青色LED（また図3を参照）によって照明される葉。根系は、ウィットを網掛けされています<html>水面を覆っている黒いプラスチックホイルのH小さなシート。黒色アルミ箔の2つの部分からなる蓋はさらに水面下の光の量を減少させ、試料室の湿度を維持します。右側の拡大パネルには、液体培地に浸漬ゲルのブロックの表面上に成長する植物を強調しています。アガロースの低下は、ゲル上にルートをマウントします。破線のボックスは、顕微鏡で観察した関心領域を示しています。蓋なしの撮影室（のB）写真）。 シロイヌナズナ ：LEDリングとX / Y / Z /θステージ（2）：（1）： -数字（1）A及びB中の（10）を表す試料ホルダー（3）の蓋（4） （5）ブラックプラスチックホイルのシート（6）：灌流システム（7）：検出対物レンズ（8）液体媒体、（9）：試料室（10）の照明対物レンズ。 C）蓋は黒色アルミ箔の2つの部分からなります。<html>ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> 図2： 試料ホルダー。 A）3Dモデル。 3Dモデルファイルは、補足材料に設けられています。 、透明なアクリルプラスチック（4）及び（5）：樹脂（6）透明樹脂（3） - （1）は、異なる材料を使用して、3D印刷のB）写真。試料ホルダーのC）技術的な図面、数字はミリ表します。 D）工場で製造されたサンプルホルダーの写真を搭載しています。破線の領域は、顕微鏡で観察することができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> / &quot;/ 55044 / 55044fig3.jpgをアップロード&gt; 図3： 工場照明のセットアップ。ランプA）概略回路図です。 LEDのペアは、方向雷のために個別にオン/オフすることができます。 LED：発光ダイオード、R：抵抗、T：トランジスタ、JP：ピンヘッド。プリント回路基板）：B）照明ランプの最終的な設計は、PCB-ソフトウェア（PCBを使用して描かれました。私たちは、補足資料で基板設計ファイルを提供します。ボードは、その後、製造され、当研究所のMIBAの機械工場で組み立てました。 LEDリングのC）写真はオン。赤と青のLEDの4対がリング状に配置されています。 D）の電圧範囲は3.5 Vと14.0 V.抵抗との間で調整することができますが30から250マイクロモル/メートルの範囲の光の量に到達するために使用された2 /秒（R1-8：220オーム、R9-12：1220オーム）。 E）ランプ、GFPおよびYFPの発光スペクトル。<html> TP：//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> 図4： 側根 シロイヌナズナ の時間経過の記録 。 （pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4）5日齢の苗は、膜マーカーを発現し、特に側根に発展鞘細胞をマーキング核レポーター（pGATA23 :: NLS-GUS-GFP）。 217の画像（3μmのz軸間隔）のスタックは、20X / 0.5レンズを使用して、17時間の記録のために15分ごとに捕獲されました。 A）69のうち4時間点は、最大値投影に示されています。 B）1つの時点のzスタックの六217のうち、単一のスライスが示されています。 AとBの中のスケールバーは100μmで表します。ロード/ 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> 図5： 側根 シロイヌナズナ の時間経過の記録 。 （pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4）6日齢の苗は、膜マーカーを発現し、特に側根に発展鞘細胞をマーキング核レポーター（pGATA23 :: NLS-GUS-GFP）。 200の画像（1.5μmのz軸間隔）のスタックは、40X / 0.75のレンズを使用して、38時間の記録のために15分ごとに捕獲されました。 A）4時点の3Dレンダリング、グリッド内の数字は、主根の中心面を通してミクロン、B）単一のスライスを表します。スケールバーは50μmで表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">お願いします</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl。 3Dモデルファイルが提供されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ファイルは、リングBoard.brdをLED。ボード・デザイン・ファイルが提供されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K ビュー.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

生物工学

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

発生生物学

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

生化学

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.

土壌中の不安定な植物、無機植物の栄養素および汚染物質の二次元可視化と定量化

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

環境学

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

生物学

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

要約

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この動画の章

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

土壌中の不安定な植物、無機植物の栄養素および汚染物質の二次元可視化と定量化

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

要約

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RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

土壌中の不安定な植物、無機植物の栄養素および汚染物質の二次元可視化と定量化

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉