Biz ses donanımları için eleştirel okuma / görüntüleme Matyáš Fendrych ve Stephan STADLBAUER teşekkür ederiz. OpenSPIM katkılarından dolayı IST Avusturya&#39;da Miba Makine Shop teşekkürler. Bu sonuçlara önde gelen araştırma REA hibe anlaşması n ° [291734] ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC projesi-2011 kapsamında Avrupa Birliği&#39;nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) İnsanlar Programı (Marie Curie Eylemleri) fon aldı -StG-20101109-PSDP).

Görüntüleme 1. Arabidopsis Kültürleme önce <ol><li> 2.15 g, MS-ortamı, 10 g sakroz, 0.97 g MES (2- (N-morfolino) etansülfonik asit) ve 1 L GKD 2 O (iki kez damıtılmış su eklenmesi ile yarım MS ortamı (yarı-kuvvetli Murashige ve Skoog ortamı) hazırlanması ) 1 L&#39;lik bir şişeye. KOH kullanılarak 5.8&#39;e pH ayarlayın. </li><li> ½ MS ortamına 15 g / l jellan zamkı ekleyin ve 121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle otoklav. </li><li> yaklaşık 2 mm bir kalınlığı olan bir jel tabakası oluşturmak için köşeli Petri kapları (245 x 245 x 25 mm) içine sıcak ortam, 30 ml dökün. Yemekler orta katılaşmaya izin oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 1 ml steril H2O cam pipet ya da 1000 uL bir pipet ucu kullanılarak tohumları kaldırmak ve jelin yüzey üzerine ekmek ihtiva eden 1.5 ml reaksiyon tüpüne sterilize Arabidopsis tohumlar konulur. tohumları ayrı ayrı yaklaşık 10 mm yerleştirin. bant ile plaka mühür. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe levhasını° C (tabakalaşma). </li><li> 6 gün boyunca ışık 120-140 umol / m / s miktarı ile 16/8 h gündüz / gece döngüsünde 22 ° C&#39;de, örneğin büyüme inkübatör plaka, geliştirin. 10 güne kadar eski bitkiler kullanılabilir. </li></ol> 2. Bitki Numune Hazırlama Yöntemi Not: numune tutucu 3D basılı veya elden Şekil 2C tasvir boyutları kullanarak bir makine atölyesinde yapılabilir ya. 3D model dosyası ek malzemenin (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl) sağlanır. Malzeme listesinde 3D baskı siparişi için bağlantıya göz atın. <ol><li> 5 g 50 ml yarım MS ortamı içeren 50 ml şişe içine agaroz düşük eriyen ve 121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle otoklav ekleyin. </li><li> 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri içinde% 1 düşük erimeli agaroz bir çözüm kısım. 4 ° C&#39;de saklayın (en az iki ay için kullanılabilir). </li><li> 80 ° C&#39;de 1 %% düşük erime agaroz bir kısım eritin ve için soğumasını bekleyin33 ° C. </li><li> bir ultrason ünitesi örnek tutucu temizleyin. % 70 etanol ile numune tutucu sterilize ve steril su ile yıkayın. </li><li> Bir neşter kullanılarak bitki etrafında jel kesti. </li><li> Düz spatula ile blok kaldırın ve ikinci spatula ile numune tutucu üzerinde dikkatle kaydırın. </li><li> Bir 100 uL pipet kullanılarak (33 ° C&#39;de),% 1 agaroz ile örneği üzerindeki jel Tutkal. </li><li> 10 mcL pipet kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde bir bitki Tutkal. Yaprakları jel ile kaplı olmadığını doğrulamak için bir stereo mikroskop kullanın. ilgi bölgeye doğrudan jeli yerleştirmeyin. </li><li> kurumasını bitki önlemek için, kesintisiz çalışır. Mümkün 1.000 mcL pipetlemeyin ucu içine numune tutucu yerleştirin. bir kap olarak pipet ucu kullanın ve bitki bulunduğu numune tutucu bir ucuna dikkatlice kaydırın. </li><li> Bir pipet kutusunda numune tutucu koymak ve gerekirse daha fazla bitki hazırlamak. Bitkiler doğrultularda olabilirtly görüntülü veya büyüme inkübatör geri koymak. </li></ol> 3. Mikroskop kurma NOT: LED aydınlatma sistemi özel olarak oluşturulmuş lamba olduğunu. LED-ring oluşturmak için gerekli teknik detaylar Şekil 3 ve malzeme listesinde bulunabilir. Yönetim Kurulu tasarımı için ek malzeme dosyası (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) bakın. <ol><li> Vida veya tutkal (örneğin çift taraflı bant) OpenSPIM x / y / z / θ aşamalı kolunun alt tarafında LED halka. </li><li> ayarlanabilir bir güç kaynağı (0-30 V, maksimum 2 A) LED halka bağlayın. </li><li> İstenilen ışık yoğunluğu gerilim ayarlayın (Arabidopsis, 120-140 mmol / m 2 / s Şekil 3D için). </li><li> % 70 etanol ile Örnek odacığının sterilize ve steril su ile yıkayın. </li><li> benzin ve lens temizleme dokusu ile objektif lens temizleyin. % 70 etanol ile objektif lens sterilize edin. </li><li> perfusi bağlayıntek yönlü bir düzenlemesi örnek odasına borular üzerinde. Bir sonraki peristaltik perfüzyon pompa taze ½ MS orta ve başka boş şişeyi içeren 1 L şişe koyun. bir perfüzyon tüpü kullanılarak örnek odasının alt girişi ile orta şişeyi bağlayın. Başka bir perfüzyon tüp kullanılarak kullanılan orta çöp boş şişe numune odasının üst çıkışını bağlayın. </li><li> 1 ml / dk akış hızını ayarlamak. Not: Örnek odası Overspill olup için, akışından daha yüksek bir çıkış olması önemlidir. Her iki pompalama hızını arttırmak ya da çıkış için daha geniş bir iç çapa sahip bir tüp kullanın. </li><li> % 70 etanol ile yıkayın ve su yüzeyinden örnek bölmesine yerleştirmeden önce kurumaya bırakın, 3 mm&#39;lik küçük kareler halinde siyah plastik folyoyu kesin. </li><li> numune tutucu gelen pipet ucu çıkarın ve örnek odasındaki numune tutucu takın. yeni üretilen numune tutucu sahne koluna uymuyorsa, bir ince kum kullanmakKağıt daha ince yapmak veya çok ince olması durumunda bir O-ring (∅ 6 mm) kullanın. </li><li> kapakları oluşturmak için, iki adet 50 x 25 mm parçalar halinde siyah alüminyum folyo kesti. her bir parçanın bir tarafta orta kesim 5 mm yapın. Bir üçgen girinti (Şekil 1D) oluşturmak için katlayın. Numune tutucu bakan üçgen çentikler ile örnek odasının üstünde kapakları koyarak iki kapaklı numune odasına kapatın. Bitki yaprakları kapak gölgede olmadığından emin olun ve ışıklandırma sistemi ışık alır. </li><li> görüş alanında yükselen bir yanal kök yerleştirmek için X / Y / Z ve rotasyon sahne kullanarak ilgi bölgeyi bulun. </li><li> Kayıttan önce, sistem en az 15 dakika boyunca dengeye gelmesi sağlar. </li><li> Kur görüntü elde etme. <ol><li> 3 um z aralığı (650 um) ile birlikte 217 bir görüntü yığını ayarlamak ve 17 saatlik bir toplam süre 15 dakika için görüntüleme aralıklarla geçen süreyi ayarlayın. NOT: A ayrıntılı belgelerOpenSPIM yazılım bulunabilir nasıl işletmek (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Kayda başla. </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G., Guo, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science.">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., Moore, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Zebrafish+Early+Embryonic+Development+by+Scanned+Light+Sheet+Microscopy.">Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy.">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li><li>H&#246;ckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Embryogenesis:+A+Perspective+for+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy.">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).</li><li>Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Dynamics+in+Root+Cells+of+Arabidopsis+thaliana+Visualized+with+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy.</a> PLoS ONE. 8 (10), (2013).</li><li>&#352;amajov&#225;, O., Tak&#225;&#269;, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+methods+and+techniques+to+study+endocytosis+in+plants.">Update on methods and techniques to study endocytosis in plants.</a> Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).</li><li>Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin+transport+mechanism+restricts+positive+orthogravitropism+in+lateral+roots.">An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots.</a> Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).</li><li>Lucas, M., Kenobi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+root+morphogenesis+is+dependent+on+the+mechanical+properties+of+the+overlaying+tissues.">Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).</li><li>Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spatial+Accommodation+by+Neighboring+Cells+Is+Required+for+Organ+Initiation+in+Arabidopsis.">A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis.</a> Science. 343 (6167), 178-183 (2014).</li><li>Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Arabidopsis+Development.">Live Imaging of Arabidopsis Development.</a> Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).</li><li>Berson, T., von Wangenheim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Golgi+network+localized+small+GTPase+RabA1d+is+involved+in+cell+plate+formation+and+oscillatory+root+hair+growth.">Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).</li><li>Langhans, M., Meckel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+detection+and+tracking+in+plants.">Single-molecule detection and tracking in plants.</a> Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).</li><li>Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+nuclear+localization+and+quantification+of+GFP-tagged+EB1c+in+Arabidopsis+root+using+light-sheet+microscopy.">Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy.</a> Front Plant Sci. 6, (2015).</li><li>Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+and+Self-Organizing+Properties+of+Post-embryonic+Plant+Organ+Cell+Division+Patterns.">Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns.</a> Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).</li><li>Berthet, B., Maizel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+and+live+imaging+of+plants.">Light sheet microscopy and live imaging of plants.</a> J Microsc. , (2016).</li><li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSPIM:+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform.">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li><li>de Luis Balaguer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-sample+Arabidopsis+Growth+and+Imaging+Chamber+(MAGIC)+for+long+term+imaging+in+the+ZEISS+Lightsheet+Z.1.">Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1.</a> Dev Biol. 419 (1), (2016).</li><li>Ove&#269;ka, M., Va&#353;kebov&#225;, L., Komis, G., Luptov&#269;iak, I., Smertenko, A., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plants+for+developmental+and+cellular+imaging+by+light-sheet+microscopy.">Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).</li><li>Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Balu&#353;ka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+of+Arabidopsis+roots+induces+immediate+burst+of+ROS+production.">Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production.</a> Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).</li><li>Silva-Navas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Root:+a+system+for+cultivating+plants+with+the+roots+in+darkness+or+under+different+light+conditions.">D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions.</a> Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).</li><li>Aoyama, T., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants.">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).</li><li>Brand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+and+reliable+two-component+system+for+tissue-specific+gene+induction+in+Arabidopsis.">A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Işık Sac Flüoresan Mikroskobu düşük fototoksisite ve fizyolojik durumda örnek tutarken yüksek uzamsal-zamansal çözünürlüğe sahip büyük bir hacmi yakalamak için kullanılabilecek ultra hızlı alım hızı, birleştirmek için büyük bir avantaja sahiptir. Işık levha mikroskobu çözünürlüğü konfokal mikroskop 9 ile karşılaştırıldığında edilebilir. Ancak, ışık saçılması ve emme bireysel uyarma ve emisyon yol boyunca meydana gelir ve genel görüntü kalitesi yüzeyine göre opak dokuların içinde önemli ölçüde daha düşük olabilir. Bu komplikasyonu aşmak için bir dikey eksen boyunca örnek döndürmek ve farklı yönlere aynı hacmi gözleyin imkanı kullanabilirsiniz. Ama bu, örneğin yan kökler daha fazla bilgi almadan düşük görüntü kalitesiyle sonuçlanacaktır arkasından kök ve görüntüleme bir tarafta ortaya, her zaman avantajlı değildir. Bununla birlikte, dönme esas SAMP konumlandırmak için kullanılabilmektediren iyi şekilde le. objektifler klasik yatay düzenlemesi örnek montaj yeni yollar sağlar. Bitkiler, bir dikey konumdan yarar. Montaj yöntemi &quot;ifadesi, jel yüzeyi üzerindeki&quot;, burada sunulan bir jel 24,25 iç kök gömme kütlesi olarak diğer montaj yöntemlerine göre birçok avantajı vardır. 1) kök sistemi sıvı ortam ile doğrudan temas halindedir. örnek odası sürekli taze ortam sağlayan bir perfüzyon sistemine bağlanır. Aynı zamanda, hızlı bir şekilde, farklı ortam veya ilaç uygulamak için örnek odasının tüm hacmi değiştirmek için kullanılabilir. Onlar laboratuvarlarda büyümek için kullanılan olarak 2) Önceki hazırlık bitkilerin büyüdüğü örnek. Bitkiler flöresanlı bir mikroskop altında seçilebilir ve sadece arzu edilen bitkiler elde edilmesi gerekir. 3) bitki basılmadan numune tutucu Petri kabı aktarılır. Böylece bitki ayrıca, büyüme incubato üzerinde büyüyen aynı jel üzerinde gelişebilirR ve mekanik gerilim minimuma indirilir. 4) numune görünümü engelsiz ve numune ve algılama hedefi arasındaki boşluk sadece orta ve kırılma indeksleri farklı olan başka malzemeler ile doldurulur çünkü optik sapmaları en aza indirilir. Uzun süreli görüntüleme gerçekleştirmek için, bitki aydınlatma sistemi bitkinin fotosentezik aktivitesi sağlamak için gereklidir. Laboratuarların çoğunda bitkileri, şeffaf bir jeli üzerinde büyümeye kökleri ışığa maruz yani. Bu çevrelerine farklı tepkiler neden olur ve bunların biyokimya ve geliştirme 26,27 değişikliğe sebep olabilir. Kök sistemi üzerindeki ışık miktarını azaltmak amacıyla, siyah plastik folyo, su yüzeyini yanı sıra siyah alüminyum folyodan yapılmış kapak örneği odasını kapalı kapak kullanıldı. bitki ulaşabilir ışık kapağının ortasındaki delikten bırakır. Bu kurulumda, arka plan ışığı bir artış, suggestin gözlenmiştirKırmızı ve mavi LED&#39;ler gelen kaçak ışık miktarı önemli ölçüde GFP filtresi ve gölgeleme yaklaşımları azalmıştır g. Bu kamera arka plan gürültüsünü artırmadan görüntü alımı sırasında açık ışığı tutarak izin verdi. numune tutucu 3D baskı için tasarlanmıştır. Ancak, seçim malzemesi isimli önemli gibi çeşitli plastik yönündeydi test edildi% 100 stabil, Oluşan bir sürüklenme içinde örnek. Bu nedenle, bunun yerine reçine kullanılabilir veya bir polietilen (PEP) çubuk öğütülmesiyle numune tutucu oluşturmak için tavsiye edilir. çift ​​taraflı aydınlatma sistemi ile hafif levha mikroskobu kurulumu kullanırken numune tutucusu dönme açısına bağlı ışık yaprak biriyle etkileyebilir. plakadan bitki sıvı çekme sırasında mekanik stresi azaltmak için, spatula düz açı kullanılır. bitki hızla kurumasına ve ilk defa tecrübe hava akımı olabilir. wo, herhangi bir hava taslağı (hızlı hareketler, air-condition akışı) önlemek için deneyinMümkün rk kesintisiz ve 1000 mcL pipetlemeyin ucu içine örnek yuvasını kaydırın. mikroskop İçinde, sıvı bütün bitki daldırma ve kuru yaprakları tutmak için çok önemlidir. teknik yanal kök oluşumunun erken aşamalarında görüntüleme için idealdir. olgun kök uçları uzun vadeli görüntüleme yaparken bir Arabidopsis kökleri görüş alanının dışında hızla 100-300 mm / h ile büyümek olduğunu akılda tutmak gerekir. Çok kullanışlı bir gelecekte uygulama süresi uzun süreler boyunca aşağıdaki kök ucu büyümesini sağlayacak bir otomatik izleme algoritması, olabilir. satın alma işlemi sırasında bu tür ışık ve ortamın besin kompozisyonu olarak çevresel koşulları kontrol etme yeteneği bitkiler değişimlere uyum nasıl araştırıyor sağlar. Kök 28 uyarılabilir deksametazon veya β-Estr kullanılarak, örneğin, kimyasal olarak gen ekspresyonu aktive etmek için ilaç uygulamak için kullanılabilecek sıvı bir ortam ile doğrudan temas halinde olanuyanlabilir sistem 29 adiol. Bununla birlikte, bir ilaç yıkamak için numune odasının tüm hacmi değiştirmek için zaman alır. Kurulum ortam değişikliği hızlandırmak için numune odasının hacminin en aza düşürülmesiyle iyileştirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik büyük bir potansiyele sahiptir. montaj prosedürü, standart yetiştirme koşulları ve ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak yumuşak görüntü elde kombinasyonu fizyolojik düzeyde yüksek çözünürlüklü bitki gelişiminin uzun vadeli çalışmalar sağlar. Bu bitki gelişiminin temel mekanizmaları keşfetmek için araştırmacıların yardımcı olacaktır.

tek hücre organ farklılaşması ve büyüme sırasında nasıl davrandığını anlamak bitki gelişiminde önemli sorulardan biridir. İdeal olarak, gen ekspresyonu ve hücre içi protein lokalizasyonu gibi hücresel olaylar, doku daha geniş bir bağlamda ışığında görülebilir. Bu amaç, teknik zorluklar teşkil ve yüksek uzaysal ile tüm organ gözlem yanı sıra fotoğraf-toksisite etkilere neden olabilir zaman uzun süreli, aşırı zamansal çözünürlüğü gerektirir. bitkiler hızla çevresel değişimlere uyum beri, yetişme koşulları sıkı kontrol edilmelidir. bitkinin fizyolojik durumu ile müdahale etmeden uzun vadeli görüntüleme yapmak için, üç şey numune odasında, 1) büyüme koşulları sağlanmalıdır var, 2) istikrarlı uzun süre boyunca montaj örnek, ve 3) görüntüleme düşük ışık şiddetleri ile foto-hasar ve non-fizyolojik koşulları önlemek için. Fizyolojik büyüyen Conditimikroskop numune odasında ons uzun vadeli deneyler için çok önemlidir. 3 - konfokal mikroskoplar 1 görüntüleme büyüme odaları açıklayan mevcut protokoller vardır. Ancak, konfokal mikroskopi stres yanıtları neden olabilir bitki, yüksek ışık yoğunluğu tanıtır ve genellikle 4 büyümesini engeller. Buna ek olarak, en geleneksel mikroskoplar kendilerini yeniden yönlendirmek ve ağırlık vektörü doğru büyümeye deneyin beri bitkiler için optimal değildir numune, sadece yatay konumlandırma izin verir. 9 - Son on yılda, ışık sayfalık mikroskobu birkaç gün 5 varan süreler için hücresel çözünürlükte büyük örneklerin gelişimini yakalamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Işık sayfalık mikroskobu dikey numune konumlandırma izin verir ve giderek kök gelişimi 10 okuyan bitki araştırmalarında kullanılan - Son zamanlarda Berthe tarafından gözden 21,t Maizel 22. Söz konusu çalışmaların 10,13 birçoğu - 18,21 optimize edilmiş ve örnek özel bir şekilde kullanan Ernst HK Stelzer laboratuarında gerçekleştirilmiştir bir jel 17 yüzeyindeki kök büyüyen karakterize montaj. Bu çalışmalarda, ısmarlama bir mikroskop burada bitki alt tutulur kullanılmıştır. Buna karşılık, genel olarak mevcut ışık sayfalık mikroskopları çoğunluğu üst örnek tutun. Bu nedenle, bu örnekte görülen yöntem hali hazırda uygulanamaz. Burada sunulan yöntem OpenSPIM 23, uygulanması ve Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPIM) artırılması için açık erişim platformu için geçerli köklü üzerinde yüzeye montaj yöntemi için bir protokol sağlar. Bu protokolün genel amacı OpenSPIM ışık sayfalık mikroskop Arabidopsis kökleri uzun vadeli görüntüleme sağlamaktır. Bu s dik bir bitkinin yetiştirilmesi gerçekleştirilirbir sıvı ortam içinde kökleri ile bir jel, sert bir yaprak havada kalmaya devam ederler. Bitkinin fotosentezik aktivitesi sağlamak için, ısmarlama bir aydınlatma sistemi yaprakları, kökleri etkilememektedir (Şekil 1) yanar.

<table><tbody><tr><td>Agarose, low melting</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Black aluminum foil</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Black plastic foil</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blue (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&amp;nbsp;CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED red (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED board - PCB design software</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohydrate</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sample holder 3D print</td><td>i.materialise</td><td>&lt;a href=&quot;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&quot;&gt;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

Işık sayfalık mikroskobu (Şekil 1) ile kök sistemi izlerken Bu numune hazırlama yöntemi mikroskop numune haznesi içerisindeki bitki ekimi sağlar. Bitki, özel tasarlanmış örnek tutucu (Şekil 2) üzerine monte edilen jel (½% 1.5 jellan zamkı içeren MS ortamı) bir tabaka yüzeyi üzerinde büyür. numune tutucu 3D malzemesi olarak şeffaf bir reçine kullanılarak basılır olduğunu. Boyutları vurgulayan bir imal versiyonu Şekil 2C&#39;de gösterilmektedir. kökler sürekli perfüzyon sistemi ile yenilenir sıvı (½ MS ortamı) daldırılır. Yaprakları havada kalır ve sürekli / bitki (Şekil 1A, B ve Şekil 3A-C) üzerinde bir halka halinde düzenlenmiş mavi ve kırmızı LED&#39;ler gelen s 130 mol / m² ışık yoğunluğu ile aydınlatılmaktadır. LED halka bizim makine atölyemizde imal edilmektedir veBiz Şekil 3 ve malzeme listesinde LED-ring nasıl oluşturulacağı konusunda teknik ayrıntıları. Işık yoğunluğu sürekli 30-250 umol / m2 / s (Şekil 3B) arasında değişen ayarlanabilir. Kök sistemi, su yüzeyini kaplayan siyah plastik folyo küçük yaprak (Şekil 1) gölgeli. Algılama lens tarafından toplanır aydınlatma herhangi bir kaçak ışık GFP filtresi (Şekil 3E) tarafından filtre edilir. Bu ayar ile, büyüyen bir Arabidopsis yanal kökü bir zaman atlamalı bir 20X / 0.5 lensi (Şekil 4) kullanılarak 17 saat süreyle kaydedildi. yan kök birincil kökü derinlerde bulunduğu perisiklden hücre tabakası, aslına vardır. uzun süreli dönemler için, bir doku içinde daha derin bir görüntüleme yeteneklerini göstermek için, daha yüksek bir büyütme (40X / 0.75) bir yanal ro oluşumunu çekmek için kullanılanot Birinci aşama primordiumunun gelen kadar 38 saat (Şekil 5) bir süre içinde birincil kök dışarı çıkması. Veri kümesinin bir örnek teşkil eden bir 2D dilim Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5B. Bu kayıt hücresel çözünürlüğe sahip 3D (Şekil 5A) lateral kök oluşumu dinamiklerini takip etmemizi sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Şekil 1: OpenSPIM örnek odasının içine koşulları Büyüyen. A) görüntüleme odasının Sketch. Bitki jel yüzeyi üzerindeki dik büyümektedir, (bakınız Şekil 2), özel bir dahili numune tutucu üzerine yerleştirildi. kökler sürekli perfüzyon sistemi ile değiştirilen bir sıvı ortam içinde büyümektedir. Bitki havada büyür ve kırmızı ve mavi LED (ayrıca bakınız Şekil 3) tarafından aydınlatılır bırakır. Kök sistemi zekâ gölgeli<html> Su yüzeyi kaplayan siyah plastik folyo h küçük levhalar. siyah alüminyum folyo iki parçadan oluşan bir kapak ayrıca su yüzeyinin altında ışık miktarını azaltır ve numune odasına nem tutar. Sağdaki büyütülmüş paneli likit ortamına daldırılmış jel bloğun yüzeyi üzerinde büyüyen bitki vurgular. agaroz bir damla jel üzerine kök bağlar. kesik kutu mikroskop tarafından gözlemlenen faiz bölgeyi gösterir. Kapaksız görüntüleme odasının (B) Fotoğraf). Sayılar (1) - (10) A ve B temsil etmektedir: (1): LED halka x / y / z / θ kademeli, (2): örnek tutucu (3): kapak (4): Arabidopsis thaliana (5): perfüzyon sistemi, (7): algılama objektif lens, (8): sıvı ortam, (9): örnek odası, (10): aydınlatma objektif lens siyah plastik folyo, (6) yaprak. C) kapak siyah alüminyum folyo iki parçadan oluşmaktadır.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Şekil 2: numune tutucu. A) 3 boyutlu modeli. 3D veri dosyası ek malzemenin sağlanır. Saydam akrilik plastikler (4) ve (5): Reçine (6): şeffaf bir reçine (3) - (1) farklı malzemeler kullanılarak 3D baskı B) fotoğrafı. C) numune tutucu Teknik çizim, rakamlar milimetre temsil etmektedir. Bir bitki ile üretilen numune tutucu D) Fotoğraf monte edilebilir. kesik alan mikroskopla görülebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;upload /&gt; Şekil 3: Bitki aydınlatma ayarı. Lambanın A) şematik diyagramı. LED&#39;lerin çiftleri yönlü yıldırım için ayrı ayrı açma / kapama açılabilir. LED: ışık yayan diyot, R: direnç, T: transistör, JP: pinhead. Baskılı devre kartı): B) aydınlatma lambası nihai tasarım bir PCB yazılımı (PCB kullanılarak çekildi. Biz ek malzemenin devre tasarımı dosyası sağlar. Yönetim Kurulu daha sonra üretilen ve bizim enstitünün MIBA makine dükkanında toplandı. LED halkasının C) Fotoğraf açık. Kırmızı ve mavi LED dört çift bir halka olarak düzenlenmiştir. D) voltaj aralığı 3,5 V ve 14,0 V Direnişleri arasında ayarlanabilir 30-250 umol / m arasında değişen ışık miktarını ulaşmak için kullanılan 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1220 Ohm ). E) lamba, GFP ve YFP emisyon spektrumu.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Şekil 4: Arabidopsis Zaman atlamalı kayıt thaliana yan kök. 5 gün eski fide bir membran işaretleyici (pUBQ10 :: YFP Pip1 4) ifade ve nükleer muhabir (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) özel bir yanal kök içine geliştirmek hücrelerin perisiklden işaretleme. 217 görüntü (3 mikron z-boşluk) bir yığın 20X / 0.5 lens kullanarak 17 saat kayıt için her 15 dakikada yakalandı. A) 69 üzerinden dört kez noktaları maksimum yoğunluk projeksiyonu gösterilmiştir. B) bir zaman noktasında z-yığınının Altı 217 üzerinden tek dilim gösterilir. A ve B Ölçek çubukları 100 um temsil etmektedir.yük / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Şekil 5: Arabidopsis Zaman atlamalı kayıt thaliana yan kök. 6 gün eski fide bir membran işaretleyici (pUBQ10 :: YFP Pip1 4) ifade ve nükleer muhabir (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) özel bir yanal kök içine geliştirmek hücrelerin perisiklden işaretleme. 200 görüntü (1.5 mikron z-boşluk) bir yığın 40X / 0.75 lens kullanarak 38 saat kayıt için her 15 dakikada yakalandı. A) Dört zaman noktalarının 3D render, ızgara numaraları, ana kök merkez düzlemi boyunca um, B) Tek dilim temsil etmektedir. Ölçek çubuğu 50 uM temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D model dosyası sağlanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Company Dosya Halka Board.brd LED. devre tasarımı dosyası sağlanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel at JoVE.com

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

light-sheet-fluorescence-microscopy-plant-roots-growing-on-surface

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Görüntüleme.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Video: Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Biyomühendislik

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Gelişim Biyolojisi

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Biyokimya

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.

Topraktaki Labile, Inorganik Bitki Besinleri ve Kirleticilerin İki Boyutlu Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

Çevre

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biyoloji

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...