Wir danken Matyáš Fendrych für das kritische Lesen / Betrachten und Stephan Stadlbauer für die Audiogeräte. Dank der Miba Machine Shop bei IST Österreich für ihren Beitrag zur OpenSPIM. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben Mittel aus dem Programm Menschen (Marie-Curie-Maßnahmen) der Europäischen Union des Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter REA Finanzhilfevereinbarung Nr [291734] und European Research Council (ERC-Projekt-2011 erhalten -StG-20101109-PSDP).

1. Arabidopsis Anzucht vor der Bildgebung <ol><li> Bereiten Sie ½ MS - Medium (halbkonzentriertem Murashige und Skoog - Medium) durch Zusatz von 2,15 g MS-Medium, 10 g Saccharose, 0,97 g MES (2- (N - Morpholino) ethansulfonsäure) und 1 l ddH 2 O (doppelt destilliertem Wasser ) in einen 1-l-Flasche. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH. </li><li> Werden 15 g / l Gellan gum zum ½ MS Medium autoklaviert und für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Gießen 30 ml des heißen Mediums in quadratische Petrischalen (245 x 245 x 25 mm), um eine Gelschicht mit einer Dicke von etwa 2 mm zu schaffen. Lassen Sie die Gerichte auf Raumtemperatur abkühlen, um das Medium lassen sich zu verfestigen. </li><li> Setzen Sie sterilisierten Arabidopsis Samen in ein 1,5 - ml - Reaktionsröhrchen mit 1 ml sterilem H 2 O , die Samen mit einer Glaspipette Pick - up oder eine 1000 ul Pipettenspitze und säen sie auf die Oberfläche des Gels. Legen Sie die Samen getrennt ca. 10 mm auseinander. Verschließen Sie die Platte mit Klebeband. </li><li> Inkubiere die Platte für 24 h bei 4° C (Schichtung). </li><li> Pflegen Sie die Platte in einem Wachstums Inkubator, zB bei 22 ° C in einem 16/8 h Tag / Nacht - Zyklus mit 120-140 &amp; mgr; mol / m² / s Lichtmenge für 6 Tage. Bis zu 10 Tage alten Pflanzen eingesetzt werden. </li></ol> 2. Pflanzenprobenvorbereitung Hinweis: Der Probenhalter kann entweder 3D - Druck oder die Hand in eine Maschine Werkstatt hergestellt unter Verwendung der dargestellten Dimensionen in 2C. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Siehe den Link in der Materialliste der 3D-Druck zu bestellen. <ol><li> 5 g niedrigschmelzende Agarose in einen 50 ml-Flasche mit 50 ml MS-Medium ½ und autoklaviert für 20 min bei 121 ° C. </li><li> Aliquot der 1% niedrigschmelzende Agarose-Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Lagerung bei 4 ° C (für mindestens zwei Monate verwendet werden). </li><li> Schmelzen Sie eine aliquote Menge von 1 %% niedrigschmelzende Agarose bei 80 ° C und lassen Sie es abkühlen33 ° C. </li><li> Reinigen Sie den Probenhalter in einem Ultraschallgerät. Sterilisieren Sie den Probenhalter mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Schneiden Sie das Gel um die Pflanze mit einem Skalpell. </li><li> Heben Sie den Block mit einem flachen Spatel und schieben Sie sie vorsichtig auf den Probenhalter eine zweite Spachtel. </li><li> Kleben das Gel auf den Probenhalter mit 1% Agarose (bei 33 ° C) unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Kleben Sie die Anlage auf dem Gel mit 1% Agarose unter Verwendung einer 10 &amp; mgr; l-Pipette. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um zu überprüfen, dass die Blätter nicht mit Gel bedeckt sind. Sie nicht das Gel direkt auf die interessierende Region zu positionieren. </li><li> Um zu verhindern, die Pflanze vor dem Austrocknen, ohne Unterbrechung arbeiten. Setzen Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Verwenden Sie die Pipettenspitze als eine Kappe und schieben Sie sie vorsichtig über ein Ende des Probenhalters in dem die Anlage steht. </li><li> Setzen Sie den Probenhalter in einer Pipettenspitze Feld und bereiten mehr Pflanzen, wenn nötig. Pflanzen können Richtungen seintly abgebildet oder im Wachstums Inkubator zurückgestellt. </li></ol> 3. Das Mikroskop einrichten HINWEIS: Die LED-Beleuchtungssystem ist ein custom-built-Lampe. Die technischen Details erforderlich , um die LED-Ring zu bauen ist in Abbildung 3 und der Materialliste zu finden. Siehe die zusätzliche Materialdatei (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) für das Board-Design. <ol><li> Schrauben oder Kleber (zB doppelseitiges Klebeband) der LED - Ring an der unteren Seite des OpenSPIM x / y / z / θ-Stufe Arm. </li><li> Schließen Sie den LED-Ring mit einer einstellbaren Stromversorgung (0-30 V, max 2 A). </li><li> Einzustellen , die Spannung auf die gewünschte Lichtstärke (für Arabidopsis, 120-140 &amp; mgr; mol / m 2 / s, 3D). </li><li> Sterilisieren Sie die Probenkammer mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Reinigen Sie das Objektiv mit Benzin und einem Objektivreinigungstuch. Sterilisieren der Objektivlinse mit 70% Ethanol. </li><li> Schließen Sie die perfusian Rohren zur Probenkammer in einer Einweganordnung. Setzen Sie einen 1-l-Flasche mit frischem ½ MS-Medium und eine weitere leere Flasche neben der peristaltische Perfusionspumpe. Schließen Sie die Flasche mit Medium, das mit dem unteren Einlass der Probenkammer ein Perfusions-Rohr. Schließen Sie den oberen Ausgang der Probenkammer mit der leeren Flasche, die die verwendete Medium unter Verwendung eines anderen Perfusion Rohr in den Papierkorb. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf 1 ml / min. ANMERKUNG: Um nicht die Probenkammer Überlaufen ist es wichtig, eine höhere Ausfluss als der Zufluß zu haben. Entweder die Pumprate zu erhöhen oder ein Rohr mit einem größeren Innendurchmesser für das Ausströmen verwenden. </li><li> Schneiden Sie eine schwarze Kunststofffolie in 3 mm kleine Quadrate, Waschen mit 70% Ethanol und trocknen lassen, bevor sie in der Probenkammer auf der Wasseroberfläche platzieren. </li><li> Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Probenhalter und legen Sie den Probenhalter in der Probenkammer. Wenn der neu hergestellten Probenhalter nicht in die Stufe Arm passt, mit einem feinen SandPapier es dünner zu machen oder einen O-Ring (∅ 6 mm) verwenden, falls sie zu dünn ist. </li><li> Um die Deckel schaffen, schneiden Sie die schwarzen Aluminiumfolie in zwei 50 x 25 mm große Stücke. Machen Sie ein 5 mm geschnitten in der Mitte einer Seite jedes Stück. Fold ein Dreieck Einbuchtung (Figur 1D) zu erzeugen. Schließen Sie die Probenkammer mit den beiden Deckeln durch den Deckel auf der Oberseite der Probenkammer mit dem Dreieck Vertiefungen setzen den Probenhalter gegenüber. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenblätter nicht im Schatten der Lider und empfangen Licht von dem Beleuchtungssystem. </li><li> Finden Sie die Region von Interesse mit der x / y / z und Rotationsstufe eine neu auftretende Seitenwurzel im Blickfeld zu positionieren. </li><li> Vor der Aufnahme kann das System für mindestens 15 min äquilibrieren. </li><li> Richten Sie die Bildaufnahme. <ol><li> Legen Sie einen Stapel von 217 Bilder mit 3 &amp; mgr; m z-Abstand (650 &amp; mgr; m) und stellen Sie den Zeitablauf mit 15 min Abbildungsintervall für einen Zeitraum von insgesamt 17 Stunden. HINWEIS: Eine ausführliche Dokumentation zuwie die OpenSPIM Software bedienen kann auch gefunden werden (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Starte die Aufnahme. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie hat den großen Vorteil niedrige Phototoxizität und ultraschnelle Aufnahmegeschwindigkeit zu kombinieren, die verwendet werden können, ein großes Volumen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen, während die Probe in einem physiologischen Zustand zu halten. Die Auflösung eines Lichtblatt - Mikroskop kann mit dem von einem konfokalen Mikroskop 9 verglichen werden. Jedoch tritt Lichtstreuung und Absorption entlang der Anregungs- und Emissionspfad individuell und die Gesamtbildqualität kann innerhalb opaken Gewebe im Vergleich zu der Oberfläche deutlich geringer sein. Um diese Komplikation zu umgehen kann man die Möglichkeit verwenden, um die Probe entlang der vertikalen Achse zu drehen, und das gleiche Volumen aus verschiedenen Richtungen beobachten. Aber dies ist nicht immer von Vorteil, zB Seitenwurzeln entstehen auf der einen Seite der Wurzel und Bildgebung von hinten führt zu einer niedrigen Bildqualität ohne weitere Informationen zu gewinnen. Jedoch kann die Drehung hauptsächlich die samp Positionierung verwendet werden,le in der besten Weise. Die klassische horizontale Anordnung der Objektive ermöglicht neue Wege der Probenmontage. Pflanzen profitieren von einer vertikalen Position. Hier vorgestellte, die &quot;auf der Oberfläche des Gels&quot; Montageverfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Befestigungsarten , wie beispielsweise die Wurzel innerhalb eines Gels 24,25 einzubetten. 1) Das Wurzelsystem ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium. Die Probenkammer ist mit einem Perfusionssystem verbunden, die kontinuierlich frisches Medium zur Verfügung stellt. Es kann auch schnell verwendet werden, um das gesamte Volumen der Probenkammer auszutauschen, um verschiedene Medien oder Medikamente anwenden. 2) Vor der Probenvorbereitung Pflanzen wachsen, wie sie in Laboratorien verwendet werden, um zu wachsen. Die Pflanzen können müssen die gewünschten Pflanzen vorbereitet werden unter einem Fluoreszenzmikroskop und nur dann ausgewählt werden. 3) Die Anlage ist aus der Petrischale an den Probenhalter übertragen, ohne berührt zu werden. Dadurch kann die Anlage weiter zu entwickeln auf dem gleichen Gel wurde in der Wachstums incubato wachsen aufr und mechanische Beanspruchung auf ein Minimum reduziert. 4) Die Ansicht auf der Probe ist frei und optische Aberrationen minimiert werden, da der Raum zwischen der Probe und dem Erfassungsziel nur mit Medium und keine anderen Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gefüllt ist. Um eine langfristige Bildgebung, die Anlage Beleuchtungssystem zur Durchführung notwendig photosynthetische Aktivität der Anlage zu gewährleisten. In den meisten Laboratorien Pflanzen wachsen auf einem transparenten Gel, dh die Wurzeln Licht ausgesetzt werden. Dies kann unterschiedliche Reaktionen auf ihre Umwelt verursachen und induziert Veränderungen in ihrer Biochemie und Entwicklung 26,27. Um zu reduzieren, wurde die Menge des Lichts auf das Wurzelsystem, schwarze Plastikfolie verwendet, um die Wasseroberfläche sowie einen Deckel aus schwarzem Aluminiumfolie zu bedecken bedeckt die Probenkammer. Licht kann die Anlage verlässt durch das zentrale Loch im Deckel erreichen. In dieser Konfiguration wurde kein Anstieg der Hintergrundlicht beobachtet, suggesting, die die Menge an Streulicht von den roten und blauen LEDs wesentlich durch die GFP-Filter und die Abschattung Ansätze reduziert wurde. Dies erlaubt das Licht während der Bildaufnahme gedreht zu halten, ohne die Kamera Hintergrundrauschen zu erhöhen. Der Probenhalter ist für den 3D-Druck entwickelt. Jedoch ist die Auswahl des Materials wichtig, da einige Kunststoffe, die nicht zu 100% stabil getestet wurden, waren, in einer Drift der Probe resultiert. Daher wird empfohlen, Harze stattdessen zu verwenden oder den Probenhalter aufzubauen, indem ein Polyethylen (PEP) Stange Fräsen. Wenn ein Lichtbogen Mikroskopaufbau mit einem doppelseitigen Beleuchtungssystem unter Verwendung der Halter Probe könnte mit einer der Licht Blätter stören auf dem Drehwinkel abhängig. während Schöpfen die Pflanze von der Platte, mit einem flachen Winkel der Spachtel, um mechanische Belastung zu reduzieren. Die Anlage kann schnell austrocknen und Erfahrung Luftstrom zum ersten Mal. Versuchen Sie, jede Zugluft zu vermeiden (schnelle Bewegungen, Klimaanlage Fluss), work ohne Unterbrechung und schieben Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Im Inneren des Mikroskops ist es entscheidend, die ganze Pflanze in Flüssigkeit nicht tauchen und die Blätter trocken halten. Die Technik ist ideal für frühe Stadien der Seitenwurzelbildung Bildgebung. Wenn langfristige Darstellung von reifen Wurzelspitzen durchführt, muss man bedenken, dass Arabidopsis Wurzeln mit 100-300 &amp; mgr; m / h wachsen schnell aus dem Blickfeld. Eine sehr nützliche zukünftige Implementierung könnte ein automatisiertes Tracking-Algorithmus sein, der folgende Wurzelspitze Wachstum über längere Zeiträume ermöglichen würde. Die Fähigkeit, Umgebungsbedingungen zu steuern, wie Licht und Nährstoffzusammensetzung des Mediums während des Akquisitionsprozesses ermöglicht es zu untersuchen, wie Pflanzen an Veränderungen anpassen. Die Wurzel ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, die verwendet werden können Medikamente anwenden , um chemisch - Genexpression, beispielsweise unter Verwendung des Dexamethason induzierbar 28 oder die β-estr aktivierenAdiol induzierbares System 29. Allerdings dauert es Zeit, um das gesamte Volumen der Probenkammer zum Austausch eines Arzneimittels auszuwaschen. Das Setup kann durch Minimieren des Volumens der Probenkammer verbessert werden Mediumaustausch zu beschleunigen. Dennoch hat diese Technik ein großes Potenzial. Die Kombination von Montageverfahren, standardisierte Anbaubedingungen und die sanfte Bildaufnahme mit Hilfe von Licht-Blatt-Mikroskopie ermöglicht Langzeitstudien der Pflanzenentwicklung mit hoher Auflösung auf physiologischer Ebene. Dies wird den Forschern helfen, grundlegende Mechanismen der pflanzlichen Entwicklung zu erforschen.

Eine der wichtigsten Fragen für das Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie einzelne Zellen während der Organ Differenzierung und das Wachstum verhalten. Idealerweise können zelluläre Ereignisse, wie Genexpressionsmustern und intrazelluläre Proteinlokalisation, in dem Licht einer größeren Kontext des Gewebes gesehen werden. Dieses Ziel stellt technische Herausforderungen und erfordert ganze Organ Beobachtung mit einer hohen räumlichen sowie zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, die phototoxische Effekte verursachen können. Da Pflanzen auf Umweltveränderungen schnell anzupassen, sind die Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Um mit dem physiologischen Zustand der Anlage ohne störende Langzeit-Bildgebung zu tun, müssen drei Dinge sichergestellt, 1) Wachstumsbedingungen in der Probenkammer sein, 2) stabile Probe über lange Zeiträume Montage und 3) die Abbildungs mit geringen Lichtintensitäten Foto-Schäden und nicht-physiologischen Bedingungen zu vermeiden. Physiologische wachsenden conditions in der Kammer Mikroskop Probe sind von entscheidender Bedeutung für die langfristige Experimente. Es gibt eine Reihe von Protokollen zur Verfügung , die Abbildungswachstumskammern für konfokale Mikroskope 1 beschreiben - 3. Jedoch führt der konfokalen Mikroskopie eine hohe Lichtintensität auf die Anlage, die 4 Antworten Stress und in der Regel hemmt das Wachstum führen kann. Darüber hinaus erlauben die meisten herkömmlichen Mikroskopen nur horizontale Positionierung der Probe, die für die Pflanzen nicht optimal ist, da sie versuchen, sich neu zu orientieren und zu dem Vektor der Schwerkraft wachsen. In den letzten zehn Jahren hat sich Lichtbogen - Mikroskopie als ein mächtiges Werkzeug entstand die Entwicklung von großen Proben bei zellulärer Auflösung für Zeiträume von bis zu mehreren Tagen 5 zu erfassen - 9. Lichtbogen - Mikroskopie ermöglicht es, die Probe vertikal positioniert und wird zunehmend in der Pflanzenforschung verwendet Wurzelentwicklung studieren 10-21, kürzlich rezensiert von Berthet und Maizel 22. Viele der genannten Studien 10,13 - 18,21 wurden im Labor von Ernst HK Stelzer optimiert und führten eine besondere Art der Probe unter Verwendung Halterung 17 durch Züchten der Wurzel auf der Oberfläche eines Gels gekennzeichnet. In diesen Studien wurde eine maßgefertigte Mikroskop verwendet wird, in dem die Pflanze aus dem Boden gehalten wird. Im Gegensatz dazu halten die Mehrheit der breit verfügbaren Lichtbogen Mikroskope die Probe von der Spitze. Somit ist diese besondere Herstellungsverfahren nicht ohne weiteres angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode liefert ein Protokoll für die gut etablierte auf Oberflächenmontageverfahren anwendbar für die OpenSPIM 23, einem Open - Access - Plattform für die Anwendung und Verbesserung der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es langfristige Bildgebung von Arabidopsis Wurzeln in der OpenSPIM Lichtbogen Mikroskop zu ermöglichen. Dies wird durch das Züchten einer Pflanze aufrecht auf den s erreichturface eines Gels mit den Wurzeln in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze, eine maßgeschneiderte Beleuchtungssystem , um sicherzustellen , beleuchtet die Blätter , aber nicht die Wurzeln (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>Agarose, low melting</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Black aluminum foil</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Black plastic foil</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blue (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&amp;nbsp;CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED red (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED board - PCB design software</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohydrate</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sample holder 3D print</td><td>i.materialise</td><td>&lt;a href=&quot;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&quot;&gt;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

Dieses Probenherstellungsverfahren ermöglicht den Anbau der Pflanze in der Kammer Mikroskop Probe , während das Wurzelsystem mit einem Lichtbogen Mikroskop (Abbildung 1) zu beobachten. Die Pflanze wächst auf der Oberfläche einer Schicht aus Gel (½ MS Medium , 1,5% Gellangummi enthielt) auf einem kundenspezifischen Probenhalter montiert ist (Abbildung 2). Der Probenhalter ist 3D mit einem transparenten Harz als Material gedruckt. Eine künstlich hergestellte Version die Dimensionen hervorzuheben ist in 2C dargestellt. Die Wurzeln werden in Flüssigkeit (½ MS-Medium) eingetaucht, die kontinuierlich von einem Perfusionssystem aktualisiert wird. Die Blätter bleiben in der Luft und werden kontinuierlich mit einer Lichtintensität von 130 &amp; mgr; Mol / m² / s Herkunft aus blauen und roten LEDs beleuchtet , die über der Anlage (1A, B und 3A-C) in einem Ring angeordnet sind. Der LED-Ring ist in unserer Maschine Werkstatt gefertigt undWir bieten technische Details, wie die LED-Ring in der Abbildung 3 und der Materialliste zu bauen. Die Lichtintensität kann kontinuierlich im Bereich angepasst 30-250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (3D). Das Wurzelsystem wird durch kleine Platten aus einer schwarzen Kunststofffolie Abdecken der Wasseroberfläche (Abbildung 1) schattiert. Jede Streulicht von der Beleuchtung, die durch die Erfassungslinse gesammelt wird , wird durch das GFP - Filter (3E) filtriert. Mit diesem Aufbau wurde 17 h ein Zeitraffer einer wachsenden Arabidopsis Seitenwurzel verzeichnete einen 20X / 0,5 Objektiv (Abbildung 4) verwendet wird . Die seitliche Wurzel hat seinen Ursprung in der Perizykel Zellschicht, die sich innerhalb der primären Wurzel tief liegt. Um die Abbildungseigenschaften noch tiefer im Inneren eines Gewebes für längere Zeitperioden eine höhere Vergrößerung (40x / 0,75) wurde zu demonstrieren, verwendet, um die Bildung eines seitlichen ro einzufangenot von der ersten Stufe bis primordium die Entstehung aus der primären Wurzel innerhalb einer Zeitdauer von 38 h (Figur 5). Eine beispielhafte 2D - Schicht des Datensatzes ist in Fig. 5B. Diese Aufnahme erlaubt es uns , die Dynamik der Seitenwurzelbildung in 3D mit einem zellulärer Auflösung (5A) zu folgen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Anbaubedingungen im Inneren des OpenSPIM Probenkammer. A) Skizze der Imaging - Kammer. Die Pflanze wächst aufrecht auf der Oberfläche eines Gels, montiert auf einem kundenspezifischen Probenhalter eingebaut (siehe auch 2). Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, die kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ausgetauscht wird. Die Blätter der Pflanze in der Luft wachsen und werden von roten und blauen LEDs beleuchtet (siehe auch Abbildung 3). Das Wurzelsystem ist wit schattiert<html> h kleine Blätter eines schwarzen Plastikfolie bedeckt die Wasseroberfläche. Ein Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie verringert weiter die Menge an Licht, unter der Wasseroberfläche und hält Feuchtigkeit in der Probenkammer. Das vergrößerte Panel auf der rechten hebt die Pflanze auf der Oberfläche eines Blocks von Gel in das flüssige Medium eingetaucht wächst. Ein Tropfen Agarose ersteigt die Wurzel auf das Gel. Die gestrichelten Kästchen zeigt die Region von Interesse durch das Mikroskop beobachtet. B) Fotografie der Abbildungskammer (ohne Deckel). Numbers (1) - (10) in A und B: (1): x / y / z / θ-Stufe mit LED - Ring, (2): Probenhalter, (3): Deckel (4): Arabidopsis thaliana (5): Blätter aus schwarzem Kunststoff-Folie, (6): Perfusionssystem, (7): Erkennung Objektivlinse (8): flüssiges Medium, (9): Probenkammer (10): Beleuchtungsobjektivlinse. C) wird der Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie hergestellt.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Probenhalter. A) 3D - Modell. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial zur Verfügung gestellt. B) Fotografie von 3D - Drucke mit unterschiedlichen Materialien (1) - (3): transparentem Acryl Kunststoff, (4) und (5): Harz, (6): transparentes Harz. C) Technische Zeichnung des Probenhalters, Zahlen repräsentieren Millimeter. D) Foto des hergestellten Probenhalter mit einer Anlage montiert. Die gestrichelten Bereich kann durch das Mikroskop beobachtet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> laden / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Pflanzenbeleuchtung Setup. A) Schemaschaltbild der Lampe. Paare von LEDs für die Richtungs Blitz ein- / ausgeschaltet einzeln. LED: Leuchtdiode, R: Widerstand, T: Transistor, JP: Stecknadelkopf. Leiterplatte): B) Das endgültige Design der Beleuchtungslampe wurde mit einer PCB-Software (PCB gezogen. Wir stellen die Board-Design-Datei in dem Zusatzmaterial. Die Platte wurde dann hergestellt und in unserem Institut der MIBA Maschinenhalle zusammengebaut. C) Fotografie des LED - Ring eingeschaltet. Vier Paare von einer roten und einer blauen LED sind in einem Ring angeordnet. D) Der Spannungsbereich zwischen 3,5 V und 14,0 V. Die Widerstände eingestellt werden verwendet , um die Lichtmenge von 30 bis 250 &amp; mgr; mol / m 2 / s (R1-8 bis hin zu erreichen: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) Das Emissionsspektrum der Lampe, und GFP YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Abbildung 4: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Die 5-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 217 Bilder (3 &amp; mgr; m z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 17 h Aufnahme mit Hilfe einer Linse 20X / 0.5 erfasst. A) Vier Zeitpunkte von 69 sind in einer maximalen Intensitätsprojektion gezeigt. B) Sechs von 217 einzelnen Scheiben eines z-Stapel von einem Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken in A und B 100 um.Last / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Abbildung 5: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Der 6-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 200 Bildern (1,5 um z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 38 h Aufnahme unter Verwendung einer Linse 40x / 0,75 erfasst. A) 3D - Rendering von vier Zeitpunkten stellen die Zahlen in der Tabelle um, B) einzelne Scheibe durch die zentrale Ebene der Hauptwurzel. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Bitte</a>hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Das 3D-Modell-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Datei LED Ring Board.brd. Die Board-Design-Datei zur Verfügung gestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Aufrufe.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Serie: Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Forschung

Biotechnik

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Entwicklungsbiologie

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Biochemie

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.

Zweidimensionale Visualisierung und Quantifizierung von labilen, anorganischen Pflanzennährstoffen und Verunreinigungen im Boden

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

Umwelt

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologie

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...