우리는 오디오 장비에 대한 중요한 읽기 / 볼 MATYAS Fendrych와 스테판 Stadlbauer 감사합니다. OpenSPIM에 기여하기위한 IST 오스트리아에서 MIBA 기계 공장에 감사합니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 REA 보조금 협정 N ° [291734]와 유럽 연구위원회 (프로젝트 ERC 2011에서 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)의 인민 계획 (마리 퀴리 작업)에서 자금을받은 -StG-20101109-PSDP).

이미징 1. 애기 배양 이전 <ol><li> 2.15 g MS-매체, 10g의 설탕, 0.97 g의 MES (2- (N의 -morpholino) 에탄 술폰산) 1 L의 DDH 2 O (더블 증류수를 추가하여 ½ MS 배지 (반 강도 무라 시게 및 스쿡 매체) 준비 ) 1 L 병에. KOH를 사용하여 5.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> ½ MS 배지에 15g / L의의 젤란 검 추가, 121 ° C에서 20 분 정도 압력솥. </li><li> 약 2mm의 두께를 갖는 겔의 층을 만들 정사각형 페트리 접시 (245 X 245 × 25 ㎜)로 뜨거운 배지 30 ㎖를 붓는다. 요리는 매체가 응고 할 수 있도록 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 1 mL의 멸균 H 2 O가 유리 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 씨앗을 들고 겔의 표면에 그들을 뿌리 포함하는 1.5 ML의 반응 관에 멸균 애기 씨앗을 넣습니다. 씨앗을 따로 따로 약 10mm를 놓습니다. 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 4에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션° C (계층화). </li><li> 육일에 대한 빛의 120-140 μmol / 평방 미터 / s의 금액과 16/8 시간 일 / 밤주기에서 22 ° C에서 예 성장 인큐베이터에서 접시를 육성. 최대 10 일 이전 식물을 사용할 수있다. </li></ol> 2. 식물 시료 제조 방법 주 : 샘플 홀더 3D 인쇄되거나 손으로도 2c에 도시 된 기준을 사용하여 기계 공장에서 제조 될 수 있습니다. 3D 모델 파일은 보조 재료 (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl)에 제공된다. 재료 목록에서 3D 인쇄 주문에 대한 링크를 참조하십시오. <ol><li> 5g을 50ml의 ½ MS 배지를 함유하는 50 ㎖ 병으로 저 용융 아가, 121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브를 추가한다. </li><li> 1.5 mL의 반응 튜브의 1 % 낮은 용융 아가로 오스 솔루션을 나누어지는. 4 ℃에서 저장은 (적어도 두 달 동안 사용될 수있다). </li><li> 80 ° C에서 1 %% 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는 용융하고 아래로 냉각 할 수33 ° C. </li><li> 초음파 장치의 샘플 홀더를 청소합니다. 70 % 에탄올로 샘플 홀더를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 메스를 사용하여 공장 주위에 젤을 잘라. </li><li> 평평한 주걱 블록을 들어 올리고 두 번째 주걱을 사용하여 샘플 홀더에 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 100 μL 피펫을 사용하여 (33 ° C에서) 1 % 아가로 오스와 샘플 홀더에 젤을 접착제. </li><li> 10 μL 피펫을 사용하여 1 % 아가로 오스와 겔에 공장을 접착제. 잎이 젤이 적용되지 않습니다 있는지 확인 스테레오 현미경을 사용합니다. 관심 영역에 직접 젤을 배치하지 마십시오. </li><li> 건조에서 식물을 방지하기 위해 중단없이 작동합니다. 가능하면 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 삽입합니다. 캡으로 피펫 팁을 사용하여 공장이 위치한 샘플 홀더의 한쪽 끝을 통해 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 피펫 팁 상자의 샘플 홀더를 넣고 필요하면 더 많은 식물을 준비합니다. 식물은 direc 될 수 있습니다TLY 군데 나 성장 인큐베이터에 다시 넣어. </li></ol> 3. 현미경을 설정 참고 : LED 조명 시스템은 맞춤형 램프입니다. LED가 링을 구축하는 데 필요한 기술적 인 세부 사항은 그림 3과 재료 목록에서 찾을 수 있습니다. 보드 설계를위한 보충 자료 파일 (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd)를 참조하십시오. <ol><li> 나사 또는 접착제 (예를 들면 양면 테이프)를 OpenSPIM X / Y / Z / θ 스테이지 아암의 하부 측의 LED 링. </li><li> 조정 가능한 전원 공급 장치 (0-30 V, 최대 2 A)와 LED 링을 연결합니다. </li><li> 원하는 빛의 강도에 전압을 조정합니다 (애기 장대, 120-140 μmol / m 2 / s의 그림 3D)입니다. </li><li> 70 % 에탄올로 샘플 챔버를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 벤젠 및 렌즈 청소 조직과 대물 렌즈를 청소합니다. 70 % 에탄올로 소독 대물 렌즈. </li><li> perfusi 연결일방향으로 배치 된 샘플 챔버 튜브. 옆에 연동 관류 펌프에 신선한 ½ MS 매체와 다른 빈 병이 포함 된 1 L 병을 넣습니다. 관류 한 튜브를 이용하여 시료 챔버의 하부 흡입구 배지 병을 연결한다. 다른 관류 튜브를 사용하여 사용되는 매체를 휴지통 빈 병 샘플 챔버의 상부 배출구를 연결합니다. </li><li> 1 mL / 분에 흐름의 속도를 설정합니다. 참고 : 샘플 챔버를 넘쳐하지 않으려면,이 유입보다 유출하는 것이 중요합니다. 어느 펌핑 속도를 증가 또는 유출에 대한보다 큰 내경을 가진 관을 사용한다. </li><li> 70 % 에탄올로 씻어 물 표면에 샘플 챔버에 배치하기 전에 그들을 건조시켜, 3mm 작은 사각형에 검은 색 플라스틱 호일을 잘라. </li><li> 샘플 홀더에서 피펫 팁을 제거하고 샘플 챔버에서 샘플 홀더를 삽입합니다. 새로 제조 된 샘플 홀더 무대 암에 맞지 않을 경우, 미세한 모래를 사용종이는 얇게 만들거나 너무 얇은 경우에 O 링 (∅ 6mm)를 사용한다. </li><li> 뚜껑을 만들려면 두 개의 50 × 25 밀리 조각으로 검은 색 알루미늄 호일을 잘라. 각 부분의 일 측면의 중간에 잘라 5mm합니다. 삼각형 들여 쓰기 (그림 1D)을 만들 접습니다. 샘플 홀더에 대향하는 삼각형 만입 시료 챔버의 상부에 뚜껑을 넣어 두 뚜껑 샘플 챔버를 닫는다. 식물의 잎은 뚜껑의 그늘에없는 것을 확인하고 조명 시스템으로부터의 광을받을 수 있습니다. </li><li> 보기의 분야에서 신흥 측면 루트를 배치하기 위해 X / Y / Z 회전 무대를 사용하여 관심 영역을 찾습니다. </li><li> 기록 전에 시스템은 적어도 15 분 동안 평형을 허용한다. </li><li> 설치 이미지를 획득. <ol><li> 3 μm의 Z-간격 (650 μm의)과 (217) 이미지의 스택을 설정하고 17 시간의 총 기간 동안 15 분 촬영 간격과 시간 경과를 설정합니다. 참고 :에 대한 자세한 설명서OpenSPIM 소프트웨어에 발견 할 수있는 방법을 운영하는 (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> 기록 시작합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

광 시트 형광 현미경 낮은 광독성 및 생리 상태에서 시료를 유지하면서, 높은 시공간 해상도의 대용량을 캡처하는 데 사용할 수있는 초고속 수집 속도를 결합하는 큰 장점을 갖는다. 밝은 장 현미경의 분해능은 공 초점 현미경 (9)의 것과 비교할 수있다. 그러나, 빛의 산란 및 흡수 개별적으로 여기 및 방출 경로를 따라 발생하여 전체 이미지 품질은 표면에 비해 불투명 조직 내부 상당히 낮을 수있다. 이러한 복잡화를 회피 한 세로축 샘플을 회전시키고 다른 방향에서 같은 부피를 관찰 할 가능성을 사용할 수있다. 그러나 이것은 예를 들어, 측면 뿌리는 더 많은 정보를 얻고없이 낮은 화질 결과 뒤에서 루트 및 이미지의 한면에 등장, 항상 유리하지 않다. 그러나, 회전은 주로 SAMP를 정확히 위치 시키는데 사용될 수있다가장 좋은 방법으로 제작. 대물 렌즈의 고전적인 수평 배열은 샘플 장착의 새로운 방법을 수 있습니다. 식물은 수직 위치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 장착 방법은 &quot;겔의 표면 상에&quot;, 여기서 제시하는 등의 겔 (24, 25) 내부에 루트를 내장 등의 다른 실장 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 1) 루트 시스템은 액체 매체와 직접 접촉한다. 샘플 챔버 연속적으로 새로운 배지를 제공하는 관류 시스템에 연결된다. 또한 신속하게 다른 미디어 또는 약물을 적용하는 샘플 챔버의 전체 부피를 교환 할 수있다. 그들은 실험실에서 성장하는 데 사용되므로 2) 이전에 준비 식물 성장 샘플링합니다. 식물은 형광 현미경으로 선택할 수 있으며, 단지 원하는 식물을 제조 할 필요가있다. 3) 식물이 접촉되지 않고 시료 홀더 페트리 접시에서 전송된다. 이에 따라 식물은 또한 그것이 성장에 incubato에서 성장 된 동일한 겔 개발할 수R 및 기계적 응력은 최소로 감소된다. 4) 검체의 도면 탁하고 시료와 검출 목적의 간격만으로 중간 굴절율과 서로 다른 다른 물질로 채워져 있기 때문에 광학 수차를 최소화된다. 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 식물 조명 시스템은 식물의 광합성 활성을 보장하기 위해 필요하다. 대부분의 실험실에서 식물은 투명한 겔상에서 성장 뿌리가 빛에 노출되는, 즉. 이것은 그들의 환경에 서로 다른 반응을 일으킬 및 생화학 및 개발 (26, 27)의 변화를 유도 할 수있다. 루트 시스템에서 빛의 양을 줄이기 위해, 흑색 플라스틱 호는 물 표면과 블랙 알루미늄 박으로 이루어지는 뚜껑 샘플 챔버를 포함을 커버하는데 사용되었다. 식물에 도달 할 수 빛 뚜껑의 중앙 구멍을 통해 나뭇잎. 이 설정에서 배경 빛의 증가는 suggestin를 관찰되지 않았다적색 및 청색 LED로부터의 미광의 양이 크게 GFP 필터 및 차광 방식으로 감소 하였다 g. 그러면 카메라 배경 노이즈를 증가시키지 않고, 화상 취득 동안에 온 광을 유지시켰다. 샘플 홀더는 3D 프린팅을 위해 설계되었습니다. 시험 하였다 여러 플라스틱 샘플의 드리프트 결과 100 % 안정하지만, 소재의 선택이 매우 중요하다. 따라서, 수지를 사용하는 대신 또는 폴리에틸렌 (PEP)로드를 분쇄하여 샘플 홀더를 구축 할 것을 권장한다. 양면 조명계와 광 시트 현미경 설정을 사용하는 경우 샘플 홀더는 상기 회전 각도에 따라 광 시트 중 하나를 방해 할. 플레이트에서 공장을 떠서 동안 기계적 스트레스를 줄이기 위해 주걱의 평평한 각도를 사용합니다. 이 공장은 빠르게 건조하고 아주 처음 경험 공기 흐름 수 있습니다. 우와, 어떤 공기 초안 (빠른 동작, 에어컨 흐름을)하지 않도록하십시오가능하면 RK는 중단없이하고 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 현미경 내부는 액체의 전체 공장을 찍어 마른 잎을 유지하지하기 위해 매우 중요합니다. 이 기술은 측면 루트 형성의 초기 단계의 촬상에 적합하다. 성숙한 뿌리 끝의 장기 이미징을 수행 할 때 하나는 애기 장대의 뿌리가 시야에서 빠른 속도로 100 ~ 300 μm의 / h로 성장할 것을 명심해야합니다. 매우 유용한 미래의 구현은 시간의 연장 기간 동안 다음과 같은 뿌리 끝의 성장을 허용하는 자동화 된 추적 알고리즘이 될 수 있습니다. 획득 프로세스 동안 이러한 빛의 영양 배지 조성 등의 환경 조건을 제어 할 수있는 능력은 식물 변화에 적응하는 방법을 조사 할 수있다. 루트 (28)는 유도 덱사메타손 또는 β-ESTR 등을 사용하여 화학적으로 유전자 발현을 활성화하는 약물을 적용 할 수있는 액체 매질과 직접 접촉유도 시스템 (29) adiol. 그러나, 약물을 씻어 샘플 챔버의 전체 볼륨을 교환하는 시간이 걸린다. 셋업 매체 교환을 촉진하기 위해 샘플 챔버의 체적을 최소화함으로써 개선 될 수있다. 그럼에도 불구하고,이 기술은 큰 잠재력을 가지고있다. 장착 순서, 표준 성장 조건 및 광 시트를 현미경을 사용하여 부드러운 이미지 획득의 결합은 생리적 수준의 고해상도 식물 개발 장기 연구를 허용한다. 이 식물 개발의 기본 메커니즘을 탐구하는 연구자 도움이 될 것입니다.

하나의 세포가 장기의 분화와 성장하는 동안 어떻게 행동하는지 이해 공장 개발의 핵심 질문 중 하나입니다. 이상적으로는, 유전자의 발현 패턴과 세포 내 단백질 위치 파악 등 셀룰러 이벤트는, 조직의 확대 상황에 비추어 볼 수있다. 이 목적은 기술 문제를 제기하고 높은 공간과 전체 장기 관찰뿐만 아니라 사진 독성 효과를 일으킬 수 있습니다 시간의 연장 기간 동안 시간 해상도를 필요로한다. 식물이 환경 변화에 빠르게 적응하기 때문에, 성장 조건은 엄격하게 제어되어야한다. 식물의 생리적 상태를 방해하지 않으면 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 세 가지 샘플 챔버에서, 1)의 성장 조건을 확보 할 수있다, 2) 안정 장시간 장착 샘플, 3), 촬상 낮은 조명 강도와 사진의 손상 및 비 생리적 조건을 방지 할 수 있습니다. 생리 성장 컨디셔닝현미경 시료 챔버의 기능이 장기간 실험 중요하다. 3 - 공 초점 현미경 (1)에 대해 촬상의 성장 챔버를 설명 가능한 프로토콜들이있다. 그러나, 공 초점 현미경은 스트레스 반응을 일으킬 수있는 식물, 높은 광 강도를 소개하고 일반적으로 4 성장을 억제한다. 또한 대부분의 기존의 현미경은 그들 자신의 방향을 중력의 벡터으로 성장하려고하기 때문에 식물을위한 최적하지 않은 샘플의 수평 위치 할 수 있습니다. 9 - 지난 10 년 동안, 빛 시트 현미경은 몇 일 5까지의 기간에 대한 세포 해상도에서 큰 표본의 개발을 캡처 할 수있는 강력한 도구로 떠오르고있다. 빛 시트 현미경 수직 표본의 위치를 허용하고 점점 루트 개발 (10) 연구 식물 연구에 사용되는 - 최근 베르트 검토 (21),t과 Maizel 22. 언급 된 연구 중 많은 10,13 - 18,21 최적화 샘플의 특별한 방법을 채용 에른스트 HK Stelzer의 실험실에서 수행 하였다는 겔 (17)의 표면에 뿌리를 성장하는 것을 특징으로 실장. 이 연구에서, 주문 제작 현미경이있는 공장은 바닥에서 개최, 사용되었다. 반대로, 널리 사용 가능한 광 시트 현미경의 대부분은 상부로부터 샘플을 잡아. 따라서, 특정 제조 방법에 용이하게 적용 할 수 없다. 여기에 제시된 방법은 OpenSPIM (23), 적용하고 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)을 향상시키기위한 오픈 액세스 플랫폼에 적용 할 수있는 잘 확립에 표면 장착 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 OpenSPIM 광 시트 현미경 애기 뿌리 장기 촬상을 가능하게하는 것이다. 이것은들에 똑바로 식물 성장에 의해 달성된다액체 배지에서 뿌리 겔 urface는 나뭇잎이 공중에 남아있다. 식물의 광합성 활성을 보장하기 위하여, 맞춤형 조명 시스템 잎 아닌 루트 (도 1)을 조명한다.

<table><tbody><tr><td>Agarose, low melting</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Black aluminum foil</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Black plastic foil</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED blue (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&amp;nbsp;CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED red (625 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED board - PCB design software</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohydrate</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sample holder 3D print</td><td>i.materialise</td><td>&lt;a href=&quot;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&quot;&gt;https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

밝은 장 현미경 (도 1)과 뿌리 조직을 관찰하면서 시료 전처리 방법은, 현미경의 샘플 챔버 내부의 식물의 재배 할 수있다. 식물은 맞춤 설계 샘플 홀더 (도 2)에 장착 된 겔 (½ 1.5 % 젤란 검을 함유하는 MS 배지)의 층의 표면 상에 성장한다. 샘플 홀더는 3D 재료로서 투명 수지를 사용하여 인쇄된다. 크기를 강조 제조 버전도 2c에 도시되어있다. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 새로 고쳐 액체 (½ MS 배지)에 담근다. 잎은 공기에 남아 계속 /이 식물 (그림 1A, B 그림 3A-C) 위의 링으로 배열되어 파란색과 빨간색의 LED에서 나오는 s의 130 μmol / ㎡ 크기의 광 강도 조명. LED가 링은 우리의 기계 공장에서 제조되며,우리는 그림 3과 재료 목록의 LED 링을 구축하는 방법에 대한 기술 정보를 제공합니다. 광 강도가 연속적으로 30 내지 250 μmol / ㎡ / s (도 3d)에 이르기까지 조정될 수있다. 루트 시스템은 물 표면을 덮는 블랙 플라스틱 포일의 작은 시트 (도 1)에 의해 차광된다. 검출 렌즈에 의해 수집 된 조명에서 어떤 미광은 GFP 필터 (그림 3E)에 의해 필터링된다. 이 설정으로, 성장 애기 측면 루트의 시간 경과는 20X / 0.5 렌즈 (그림 4)를 사용하여 17 시간 동안 기록되었다. 측면 루트는 기본 루트 내부 깊이있는 pericycle 세포 층에서 그 기원을 가지고있다. 연장 시간 동안 조직의 내부에도 깊은 촬상 기능을 설명하기 위해, 더 높은 배율 (40X / 0.75) 측면 RO의 형성을 캡처하는 데 사용 된OT 제 1 스테이지에서 primordium까지 38 시간 (도 5)의 시간 내에 기본 루트 중에서 출현. 데이터 세트의 예시적인 2D 슬라이스는도된다. 5B. 이 기록은 셀룰러 해상도로 3D (그림 5A)의 측면 루트 형성의 역학을 따라 우리를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> 그림 1 : OpenSPIM 샘플 챔버 내부 조건을 성장. A) 이미징 챔버의 스케치입니다. 이 공장은 겔의 표면에 수직으로 성장하고있다 (참조 또한 그림 2) 사용자 정의 내장 샘플 홀더에 장착. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 교환되는 액체 배지에서 성장하고있다. 식물은 공기에서 성장하고 빨간색과 파란색의 LED (또한 그림 3 참조)에 의해 조명하는 단풍. 루트 시스템은 재치 음영 처리<html> 물 표면을 덮는 검은 색 플라스틱 호일 h의 작은 시트. 블랙 알루미늄 호일의 두 조각으로 이루어지는 덮개는 상기 수면 아래 빛의 양을 감소시키고 샘플 챔버의 습도를 유지한다. 오른쪽 확대 패널은 액체 매질에 침지 겔 블록의 표면에 성장하는 식물을 강조한다. 아가 방울 겔 상 루트 마운트. 점선 상자가 현미경으로 관찰하여 관심 영역을 나타냅니다. 뚜껑이없는 촬상 실 (의 B)의 사진). 숫자 (1) - (10) A와 B의 대표 (1) : LED 링 X / Y / Z / θ 스테이지 (2)의 샘플 홀더 (3) : 뚜껑 (4) : 애기 장대 (5) : 관류 시스템 (7) : 검출 대물 렌즈 (8) 액체 배지, (9) : 시료 챔버 (10)의 조명 대물 렌즈 검은 플라스틱 포일 (6)의 시트. C) 뚜껑 검정색 알루미늄 호일의 두 부분으로 이루어진다.<html> 대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> 그림 2 : 샘플 홀더. A) 3D 모델. 3D 모델 파일은 보조 재료에 제공된다. 투명 아크릴 수지로 (4) 및 (5) : 수지 (6)을 투명 수지 (3) - (1) 서로 다른 재료를 이용하여 3 차원 프린트 B)의 사진. C) 샘플 홀더의 기술 도면, 숫자는 mm 나타냅니다. 공장에 제조 된 샘플 홀더 D) 사진은 장착. 점선 영역은 현미경으로 관찰 할 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> / 55,044 / 55044fig3.jpg &quot;를 업로드 /&gt; 그림 3 : 공장 조명 설치. 램프 A) 회로도. LED가 쌍 방향 번개에 대해 개별적으로 온 / 오프 전환 할 수 있습니다. LED : 발광 다이오드, R : 저항, T : 트랜지스터, JP : 핀 머리. 인쇄 회로 기판) : B), 조명 램프의 최종 설계가 PCB와 소프트웨어 (PCB를 사용하여 그려졌다. 우리는 보충 자료의 보드 디자인 파일을 제공합니다. 이 보드는 제조 및 우리 연구소의 MIBA 기계 공장에서 조립되었다. LED가 링의 C) 사진은 스위치. 빨간색과 파란색 LED의 네 쌍의 반지에 배치되어있다. D)의 전압의 범위는 3.5 V와 14.0 V. 저항력 사이에서 조정될 수는 30 내지 250 μmol / m에 이르는 빛의 양에 도달하는 데 사용 된 2 / 초 (R1-8 : 220 옴, R9-12 : 1,220 옴 ). E) 램프, GFP 및 YFP의 발광 스펙트럼.<html> TP : //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> 그림 4 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 5 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. (217) 영상 (3 μm의 Z-간격)의 스택은 20 배 / 0.5 렌즈를 사용하여 17 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) (69) 중 4 시점이 최대 강도 투영에 나타낸다. B) 한 시점의 Z-스택의 식스 (217) 중 하나의 조각이 표시됩니다. A와 B의 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.로드 / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> 그림 5 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 6 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. 200 이미지 (1.5 μm의 Z-간격)의 스택은 40X / 0.75 렌즈를 사용하여 38 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) 네 시점의 3D 렌더링 그리드 안의 숫자는 메인 루트의 중심면으로 μm의, B) 단일 슬라이스를 나타낸다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">부디</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D 모델 파일이 제공된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 링 Board.brd을 LED. 기판 설계 파일이 제공된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K 조회수.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

연구

생체공학

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

발생학

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

생화학

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.

토양의 2차원 시각화 및 래빌, 무기 식물 영양소 및 오염 물질의 정량화

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

환경과학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

생물학

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...