This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC - Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.

Burada açıklanan insan dokusu içeren tüm deney Liverpool Üniversitesi, Üniversite Hastanesi Aintree Hastanesi ve Güney Batı Galler Araştırma Etik Komitesi tarafından önceden onaylanmış (Onay No: 13 / WA / 0374) ve deneyler iyi uygulama rehberlik göre yapıldı. etik Bu çalışma için sponsor olarak University of Liverpool davrandı. Tüm donörler Bu çalışmanın kayıt için bilgilendirilmiş onam verdik. kaslar insanlardan izole edilmiştir (VKİ &lt;25): Yetişkin: 30 ± 2.8 yaşında ve yaşlı: 69 ± 5 yaşında. Kültür 1. Hazırlık <ol><li> Kültür kaplanması laminin yüzeyler <ol><li> 1x DPBS laminin 10 ug / mL (Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin) içindeki bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Tamamen hücreleri (Tablo 1) kaplama edilecek olan yüzey üzerine kapsayacak şekilde laminin solüsyonu az miktarda pipetle. t inkübehücrelerin kaplama önce nemlendirilmiş 37 ° C de kültür çanak en az 30 dakika,% 5 CO2 kuluçka. girdabın kullanımından kaçınmanın, dikkatli laminin tutun. DPBS içinde seyreltilmiş 10 ug / ml laminin çalışma çözeltisi, 4 ° C de muhafaza edilebilir ve çok kez yeniden-kullanılmaktadır. </li><li> 6-çukurlu plaka içindeki 60 mm (20 cm2) petri veya 2 kuyu kullanımı (2 x 10 cm2) ~ 18 başı - iskelet kası 19 mg hücreler (toplamda 5.50 x 10 4 hücre) plaka. fonksiyonel çalışmalar hücreleri kaplama yaparken her zaman hücre sayımını yapın. NOT: Örnekler aslen kadın hastalarda (: 30 ± 2.8 yaşında, yaşlı: 69 ± 5 yaşında, BKİ &lt;25 yetişkin) ayak ameliyatları (ekstansör digitorum brevis, tibialis anterior veya abdüktör halluces kaslar) elde edilmiştir. </li></ol></li><li> Enzimatik solüsyon hazırlanması <ol><li> 10 ml 1x DPBS stoklar CaCl2 277 mg: 250 mM CaCl2 çalışma çözeltisi hazırlayın. bu yüzden Filter4 ° C &#39;de 0.2 um&#39;lik bir membran filtre ve mağaza ile dökülmesinden. </li><li> Kolajenaz D 1.5 U / mL, Dispase II 2.4 U / mL ve serum içermeyen DMEM içinde 2.5 mM CaCl2 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) (Tablo 2) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> İyice karıştırın ve sterilizasyon için 0.2 um&#39;lik bir filtre zarı içinden enzimatik solüsyon filtre. önceden enzimatik çözüm hazırlayın ve aşağı donma (-20 ° C) ileride kullanılmak üzere alikotları. </li></ol></li></ol> 2. Doku sindirimi: Mekanik ve Enzimatik ayrışma <ol><li> örnek toplama ardından, sindirim kadar DPBS içinde 4 ° C&#39;de kas tutun. 18 başına kolajenaz-dispaz-CaCI2 çözeltisi 2 mL, minimum hacimde hazırlayın - kas dokusunun 19 mg ve doku kesilmeden önce, 37 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> Taze DPBS ile yıkanır, kısa bir süre için% 70 etanol içinde kas biyopsisi daldırın ve enzimatik 1 mL yeni bir Petri tabağına yerleştirin dokuçözüm. </li><li> Mümkün olduğunca fibrotik ve yağ dokusunun atın ve küçük ama ayırt parçalar halinde hızlı fakat nazikçe kas gözyaşı (yaklaşık&gt; 0.5 mm 2) steril makas veya cerrahi neşter (bıçak No. 10) ile. </li><li> Kolajenaz-dispaz-CaCI2 kalan 1 ml, 50 ml tüp içine örnek aktarın. </li><li> 40 dakika - 30 kadar, 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. 10 dk - tüp hafifçe her 5 çalkalayarak kas dokusu taşıyın. </li><li> Coat medya ile pipetler pipetler plastik duvarlar bırakılan hücrelerin yapışmasını önlemek için. Sindirim durdurmak için, örneğin, steril büyüme ortamı 2 hacim, DMEM,% 20 FBS (Fetal Sığır Serumu),% 1 L-glutamin ve% 1 P / S (Penisilin-Streptomisin) 4 mL ekleyin. </li><li> Pipet yukarı ve 5 ml pipet ile aşağı birkaç kez kas liflerinin hücrelerinin serbest yardımcı olur. NOT: Numune genellikle tamamen kendi küçük boyutları nedeniyle ayrışmış. However, kas fragmanları yine kalırsa, kas kalan adet taze enzimatik solüsyon ile ikinci bir inkübasyon kullanın. </li><li> 50 ml konik tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgecinden kas çözüm Filtre. süzgecinden daha fazla medya ve filtre kalan hücreleri yıkayın. </li><li> pelet hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 443 x g&#39;de santrifüjleyin. dikkatle süpernatant atın. </li><li> F-12 ortamı (Ham F-12 besleyici karışımı),% 20 FBS, içine pelet çözülür,% 10 HS (at serumu),% 1 P / S,% 1 α-glutamin ve 2.5 ng / FGF-b ml ( Rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü). Burada, 60 mm Petri çanağı başına ortam 4 mL kullanımı. </li></ol> Hücreleri 3. Tohum <ol><li> Daha önce inkübatör (bölüm 1.1) 10 ug / mL laminin ile kaplanmış kültür damarı toplayın. </li><li> Dikkatle kültürü çanak laminin fazlalığı kaldırmak ve yüzeye dokunmaktan kaçının (ya da protein yapısını bozacağı). Yıkama(Isteğe bağlı) DPBS ile kültür çanak. </li><li> Laminin kaplanmış kabın doğrudan hücreler plaka ve nemlendirilmiş bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 24 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Aydınlık alan mikroskobu (100X toplam büyütme) ertesi gün altında hücrelerin görselleştirmek. Yuvarlak küçük hücreler yüzeye bağlı ve kalan artıkları kültür ortamı içinde görülebilir. </li><li> % 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S,% 1 α-glutamin ve 2.5 ng / FGF-b ml ile tamamlanabilir taze F-12 medya ortamı değiştirmek. </li></ol> 4. Kültür ve Hücre Pasajlanması <ol><li> 3 D ve spontan önlemek için hücre grupları (7 Gün sonra, 100X toplam büyütme, Şekil 2&#39;de, örneğin, yaş insan gelen hücreler, geçit 0) mikroskop altında görülebilen en kısa sürede hücreleri bölme - Ortam her 2 değiştirme farklılaşma. </li><li> İlk geçit (P1) &#39;de,% 20 FBS,% 10 HS,% 1 ile tamamlanabilir yüksek glukoz DMEM bir ortamP / S,% 1 α-glutamin. FGF kültürünün başında kuvvetli bir mitojen ve önemli bir faktör olduğu gibi, bu noktadan itibaren FGF-b kullanmaktan kaçının, ancak kültürde uzun kullanılırsa fibroblast üremesine teşvik edebilir. </li><li> Hücre geçirilmesi için: <ol><li> Ortamı çıkarın ve DPBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> hücre yüzeyini kapsayacak şekilde,% 0.25 EDTA ile tripsin minimum hacim. , Tüm hücrelerin dekolmanı çözümü ile kaplıdır sağlamak, oda sıcaklığında 10 saniye süreyle inkübe ve çıkarmak için hafifçe sallayın. </li><li> Nemlendirilmiş 37 ° C hücreleri inkübe, 3,% 5 CO2 inkübatöründe - 5 dak. hafifçe dokunun ve hücreler yuvarlak ama tamamen yüzeyden ayrılmış olmadığını parlak ışık mikroskobu (100X toplam büyütme) altında kontrol edin. herhangi bir değişiklik hücrelerde gözlenirse, 5 dakika daha inkübe edilir. </li><li> 5 ml Büyüme Orta hücreleri toplamak için (yüksek glikoz DMEM% 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S,% 1 α-glutamin ile tamamlanmaktadır) ekleyin, karıştırıniyi ve T75 balona yeni medya hücreleri aktarın. Büyüme ortamının başka bir 5 ml bu adımı (bir T75 şişesinin için toplam 10 mi) tekrar geri kalan hücreler yıkanır. </li><li> (Ilk geçit tercih edilir) preplate için, 40 dakika boyunca,% 5 CO2 kuluçka nemlendirilmiş 37 ° C hücreleri inkübe edin. Yeni T75 şişede ekleyebilirsiniz ve inkübe vermedi hücreleri ile süpernatant toplayın. fibroblast çoğu ilk şişede bağlı olması gerektiği gibi bu miyoblastların kültür zenginleştirmek gerekir. </li></ol></li><li> 3 d ve maksimum verim için% 70 confluency ulaşmak en kısa sürede 4&#39;e kadar hücreler 1 bölünmüş - Ortam her 2 değiştirin. </li><li> % 2 HS,% 1 P / S,% 1 α-glutamin ile tamamlanmaktadır yüksek glikoz DMEM: Farklılaşma Orta (DM) kültür ortamı değiştirmek,% 80 confluency - farklılaşması için, hücreler bir kez 70 ulaşmıştır. 7 gün myoblast c kalite ve saflık bağlı - hücreler 5 içinde ayırt edilmelidirulture. </li></ol> 5. Transfeksiyonlar Protokol <ol><li> Tohum 50,000 hücre / oyuk MF 20, yaşlanma ve canlılık deneyleri için 12 oyuklu plaka. Kapak slipleri üzerinde veya laminin ile kaplanmış bir tabak içinde kültür hücreleri. Ki67 boyama için, 12 oyuklu bir plaka içerisinde / oyuk 25,000 hücre tohum. </li><li> Transfeksiyonlar için, 1 mL toplam hacim transfeksiyon reaktifi 5 uL, mıkroRNA taklit kontrol veya inhibitörün 100 nM, microRNA benzer veya oyuk başına mikroRNA inhibitörü, 100 nM, 100 nM kullanılarak üreticinin prosedürü izleyin. </li><li> transfeksiyon sonra Farklılaşma Orta 6 saat değiştirin (yüksek glikoz DMEM% 2 HS,% 1 P / S,% 1 α-glutamin ile tamamlanmaktadır). çoğalma deneyleri için, transfeksiyondan sonra hücreler 2 d leke; yaşlanma için, transfeksiyondan sonra 7 gün; ve MF20 boyama için, yedi gün sonra transfeksiyon. </li></ol> Hücrelerin 6. immün <ol><li> Ki67, MyoD ve MF 20 immün <ol><li> Hazırlayın Blok 1 (10% HS ve% 0.1 PBS içinde Triton-X) ve PBS) Çözeltilerin 2 (% 10 HS ve% 0.05 Triton-X bloke eder. 12 oyuklu plaka için oyuk başına reaktif 500 uL kullanın. NOT: İnkübasyon için bir çalkalayıcı kullanarak aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> hücrelerden ortamı çıkarın. </li><li> Hücrelerin PBS ile yıkayın. </li><li> bir rocker 10 dakika süreyle soğuk metanol hücreleri saptamak. </li><li> hücrelerinden metanol çıkarın ve her biri 5 dakika bir zaman boyunca PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında bir rocker hücreleri blok 1 solüsyonu eklenir ve inkübe edilir. </li><li> Primer antikor çözüm ekleyin: Ki67 boyama, Ki67 Tavşan mAb kullanın (1: blokta 1.000 seyreltme 2); Myod için, MyoD1 (D8G3) XP Tavşan mAb kullanın (1: blokta 100 seyreltme 2); MF 20 boyanma, kullanım MYH1E (MF 20) primer antikor için (DSHB, 1: blokta 1.000 seyreltme 2). </li><li> bir rocker O 1 saat (RT) / N- (4 ° C), birincil antikor ile inkübe hücreleri. </li><li> sto eğer birkaç kez yeniden kullanılabilir (birincil AB toplayınKırmızı), 4 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Hücreler, PBS, 5 dakika, her seferinde 3 kere yıkayın. </li><li> uygun bir ikincil antikor ekleyin: Ki67 ya MyoD boyama, keçi anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikor, Alexa Fluor 488 konjugatı (PBS içerisinde 1: 1000 seyrelti); (PBS içinde 1000 sulandırma 1) MF 20 boyama, keçi anti-fare IgG (H + L), ikincil antikor Alexa Fluor 488 konjügatı için. </li><li> hücreleri ihtiva eden plaka sarın ve oda sıcaklığında bir rocker karanlıkta, 2 saat süreyle ikincil antikorla enkübe edilir. </li><li> Hücreler, 5 dakika, her seferinde, PBS ile 3 kere yıkayın. </li><li> hücreleri üzerine: (PBS 1000 seyreltme 1) ve 5 için oda sıcaklığında rocker inkübe - 10 dakika DAPI çözüm ekleyin. </li><li> Hücreler, 5 dakika, her seferinde, PBS ile 3 kere yıkayın. </li><li> Taze PBS 1 ml ekleyin. </li><li> montaj çözümü kapak fişleri hücreleri bağlama veya buharlaşmayı önlemek için Parafilm ile PBS içinde hücreleri içeren plaka mühür. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> ile hücrelerin görselleştirmekfloresan mikroskop kısa sürede (en geç 2 haftadan). </li></ol></li><li> Canlılık Testi <ol><li> hücrelerden ortamı çıkarın. </li><li> PBS hücrelerin durulayın. </li><li> 1000 etidyum bromür ve 1: PBS içinde seyreltilmesi 1000 akridin turuncu 1 ekleyin. Dikkat: Kendine iyi bak ve sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine içinde çalışmak - etidyum bromür bir kanserojendir. </li><li> boyama çözeltisi hücreleri ihtiva eden plaka sarın ve 5 dakika rocker oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> floresan mikroskop ile hücrelerin görüntüleri çekmek: akridin turuncu yeşil kanal; etidyum bromür yerine kırmızı kanalı. </li></ol></li></ol>

There is nothing to disclose.

Burada, ekstansör digitorium brevis, tibialis anterior veya abdüktör halluces kasları yetişkin ve yaşlı insanlarda kas progenitör hücre / birincil miyoblastları izole basit, sağlam, ucuz, tekrarlanabilir ve etkili yöntem mevcut. Bu protokol, FACS- veya MACS-sıralama olarak daha sofistike yöntemler, pratik mümkün ya da değil, özellikle de yetişkin ve yaşlı insanlardan insan birincil miyoblastları kullanarak çalışmalarını olanak sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yazıda sunulan izolasyon yöntemi, yaklaşık 2 saat sürer. kas izolasyonu sırasında kas kirlenmesini önlemek için% 70 etanol içinde yıkanmıştır. kas ayrışmasını enzimatik önce, küçük ama görünür parçalar halinde kas kesilmiş ve çok fazla kıyma haline gelme hücre hasarı önlemek için önemlidir. myofibers ayrışması ve uydu hücreleri ve kas kaynaklı öncü hücrelerin sürümünde sindirim sonuçları. iskelet kası ~ 20 mg, tek bir 60 mm yönelik halinde(20 cm 2) Petri kabı hücrelerini hasat için en uygun yüzey alanı oldu. Hücreler daha küçük bir yüzey hücre ölümü ve aglütinasyon artış gösterdi üzerine kaplandı ise daha büyük bir yüzeyi üzerine kaplanmış hücreler, azalmış bir çoğalma gösterdi. izole üzerine, hücreler kültürlendi ve laminin kaplı plakalar üzerinde artmıştır. olmayan kaplı yüzeylerin kullanılmasını izolasyon başarısının azalma eğilimi. Bu nedenle, hücre tercihen, izole edildikten sonra, bir önceden kaplanmış bir yüzeye hasat edilebilir. hücreler, izolasyondan sonra olmayan bir kaplanmış yüzey üzerinde hasat halinde fibroblastlar ile zenginleştirilmiş kültürlerde miyoblastlar türetilmiş hücrelerden daha çok baskın olacak. Yanı sıra, laminin, bu tür Matrigel ve kollajen bazlı reaktifler olarak diğer hücre bağlanma çözeltilerinin kullanımı kullanılabilir. Kaplama çözeltileri hücre büyümesini teşvik, büyüme faktörleri ve diğer bileşikleri de içerebilir, ancak bu hücre davranışını ve bu nedenle deneysel sonuçlar değiştirebilir. İçindeherhangi bir büyüme faktörü veya diğer tamamlar yoksun olarak deneyim, 10 ug / ml laminin optimum konsantrasyonu ve uydu hücreleri ve miyoblast bağlanması ve çoğalması için uygun bir kaplama reaktifidir. Ayrıca, laminin doğrudan iskelet kas lifi ile uydu hücre eki ve göç önemli bir rol oynar sarcolemma, bağlantılı bazal lamina, doğal olarak bulunur. kültür ortamı takviyeleri de birincil myoblast davranışı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. Bu tür FGFs veya IGF olarak örnek büyüme faktörü grupları için, FGF-2 mitojenik ve programlanmış hücre ölümü, cevabını 31 hem kontrol ile, birincil myoblast kültürlerinde çok yönlü etkileri vardır. Yetişkin ve yaşlı insanların kas izole primer miyoblastların davranış farklılıkları nedeniyle saflık o kadar olması çok muhtemeldir, çünkü özellikle titizlikle kültür koşullarını kontrol edilmesi gereklidirkültürler ve uzun vadeli kültürleri 35 sırasında kültüründe miyoblastları taşmasını fibroblastların olasılığı f. Bu fibroblastlar ile kültürlerin kirlenmesini azaltmak amacıyla olmayan bir kaplı yüzey üzerine ilk bölme boyunca hücrelerin 1 saatlik ön kaplama kullanılmıştır. biz tarif yöntemi yetişkin ve yaşlı insanlarda hem de kasların miyojenik progenitör hücrelerin izole etmek için uygundur. Miyojenik hücre oranı yüksek gösterilen (Şekil 1 &#39;de MF20 immün ile görünür MyoD ifade içi ve kas özellikleri ve 2) ve işlemlerin fonksiyonel çalışmalar için bir in vitro model olarak kullanılabilir, izole edilmiş hücre bir Örnek miyojenik topluluğundan oluşmaktadır kas homeostazı ile ilgili. Daha önceki çalışmalar, insan primer miyoblastların izolasyonu ve özelliklerinin farklılıkları ya da bunun eksikliği, karakterize olanYetişkin ve yaşlı kişiler, 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 ila 6, 37, 38. Geriatrik ve / veya non-fonksiyonel insan MPCs varlığı, 22, 6 20 gösterilmiştir. Bununla birlikte, yeni izole edilmiş insan MPCs davranışında fark 27 gösterilmiştir. Bizim protokolü, yaşlı insanlar kasından izole edilen primer miyoblastların düşük çoğalma potansiyeli veya yaşlanma gibi en azından kısmen de olsa fenotipi muhafaza primer miyoblastların, izolasyonu sağlar ve bu kullanımına izin verir22 yaşlanma sırasında kas homeostazı moleküler mekanizmaların fonksiyonel çalışmalar için hücreleri. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak izole primer miyoblastlar miyojenik farklılaşma çalışmaları için değil, aynı zamanda bu tip yaşlanma sırasında insan miyojenik öncü hücrelerin meydana gelen gen ekspresyonunda değişikliklere gibi hücre içi değişiklikleri araştırmak için sadece kullanılabilir. Ancak, uzayan ex vivo kültür sırasında hücrelerde meydana gelen değişiklikler yaşlanma sırasında meydana gelen fenotipik ve genotipik değişiklikler analiz edilirken göz önünde bulundurulması gerekir. Biz bu amaçla taze izole edilmiş hücreleri kullanarak öneriyoruz. Ayrıca, burada tarif edilen primer miyoblast kültür metodu sağlam in vitro fonksiyonel çalışmalar için izin genleşme ve insan primer miyoblastların nispeten uzun süreli kültür sağlar. Daha önce eden yöntemi kullanılarak izole miyojenik progenitör hücrelerin ekspresyon profili ve fu her ikisi için de kullanılabileceğini göstermiştirkas 22 yaşlanma ile ilişkili proseslerin nctional çalışmaları. Bu yöntem, aynı zamanda, yetişkin ve yaşlı kemirgenlerde kaslarına uygulanır ve yaşlanma ve fonksiyonel çalışmalar 22 içinde genetik ve epigenetik değişiklikler profil için kullanılabilir miyoblastların zenginleştirilmiş bir kültür izolasyonu sağlar. Bu yöntemin sınırları belli bir dereceye kadar kullanımı arasında, daha karmaşık, yayımlanmış yöntemler 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42 kullanılarak elde edilebilir hücreleri yerine uydu hücreleri saf nüfusun karışık nüfusu 43. Bu yetişkin ve yaşlı birincil miyoblastlar hücrelerin izolasyonu için, basitleştirilmiş, ekonomik ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcutinsanlar. Bizim tecrübelerimize göre, (uydu hücreler-sınıflandırılmaktadır FACS gibi MACS- veya gibi) izolasyon ve insan primer miyoblastların kültürünün mevcut, daha sofistike yöntemler, hücrelerde transkriptomik veya proteomik değişiklikler profil olarak çalışmaların bazı türleri için idealdir. Bununla birlikte, bu yöntemler, pahalı uzman en azından bir düzeyde gerekir ve bağlı olarak saf birincil miyoblast kültürleri ve miyoblastlar overgrowing fibroblastlar düşük çoğalma oranı zor olabilir. Biz fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere insan birincil miyoblastların basit izolasyonuna ve kültürünü izin veren bir tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Buna ek olarak, laminin 42 kullanımı ve başarılı bir kültür 44 anahtar faktörler olarak bFGF sınırlı gerektiği sonucuna varılmıştır. Biz de hücreleri bölme ve ilk geçiş 45 az bir ön kaplama adım ne zaman santrifüj tarafından üretilen stres kaçınarak öneriyoruz. Elimizdeki, Özetlemek gerekirseizolasyon ve ayrıca kemirgenler kaslara geçerlidir ve ifade ve kas homeostasis işlevsel çalışmalar sağlayan yetişkin ve yaşlı insanların kas birincil miyoblastlar / MPCs kültürü için verimli bir protokol optimize edilmiş.

kırılganlık iskelet kas kitlesi ve fonksiyon sonuçlarının hastalıksız ve yaşa bağlı ilerleyici kaybı, yaşlı insanların yaşam kalitesini gücü ve azalma düşüş. İskelet kası yaklaşık% 40 vücut kütlesinin 1 oluşturmaktadır. Nedeniyle yağ ve fibroz infiltrasyonu, tek tek myofibers ve kas kalite azaltma ilerleyen kurumasının yaşlanma, hastalık sırasında, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oluşur. Son zamanlarda, özellikle kemirgenlerde oluşan kas lifi kaybı, insanlarda 7 gerçekleşmeyebilir, iskelet kası yaşlanma türe özgü farklılıklar meydana geldiği önerilmiştir. Bununla birlikte, yaşlı memelilerin kalan kas lifleri hasar ve bozulmuş rejenerasyon artmış duyarlılık ile karakterizedir <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 8. Yetişkin kas tamir ve bakım uydu hücreleri 9, 10 aracılık eder. kas hasarı ve diğer ilgili ipuçları üzerine, uydu hücreleri aktive ve çoğalırlar olur. hücrelerin bir alt durgun durumuna geri döner ve geri kalan miyoblastlar (miyojenik Progenitör Hücrelerinin - MPCs) içine ilerler. Bunlar mevcut myofiber 11 onarmak için katkıda bulunur. Uydu hücrelerinin fonksiyonelliği, kas rejenerasyon başarı ve 12, 13, 14, 15 gösterilmiştir yaşlanma uydu hücre durumunu değişiklikleri tespit eder. Ayrıca, eski, insan ve kemirgen kas uydu hücreleri, bir transkripsiyon profil anahtar gösteren ve potansiyel rejeneratif azaltılmış 16, 17, </sup&gt; 18, 19. Farelerin ve insanlardan elde edilen kas uydu hücreleri, aynı zamanda sınırlı işlevsellik 20 elde yaşlanmaya uğrayabilir gösterilmiştir. Kas homeostazındaki çalışma sağlayan en köklü hücre hattı fare C2C12 hücre hattı 21&#39;dir. Çalışmalarda önemli bir miktarı aynı zamanda murin primer miyoblastlar 22 kullandık. Bu kültürler, murin ve omurgalı Miyogenesis yanı sıra, kas rejenerasyonu miyotüp / myofiber atrofi ve kas hastalık sırasında oluşan ve 23, 24, 25, 26, yaşlanma hipertrofisi süreçlerinin önemli bir anlayışı yol açmıştır. Daha yakın zamanlarda, çeşitli gruplar Miyogenesis ve kas yaşlanmasını incelemek için insan primer miyoblastları kullanılarak tarif var. Ancak, regar ile fikir birliği eksikliği varYetişkin ve yaşlı insanlarda 27, 28, 29, 30, 31 kasından izole edilen primer miyoblastların arasındaki farklılıklara DS. Sistemik ve lokal çevre, yaşlanma ve hastalık 6, 32, 33, 34, gelişimi sırasında meydana gelen karakterize farklılıklara rağmen, in vitro myoblast ve mihotüp kültürleri kas gelişimi, büyümesi ve atrofi ile ilişkili moleküler mekanizmaları çalışmak için en erişilebilir araçları kalır. Buna ek olarak, bu çalışmalar sadece sağlam sağlar, ancak, aynı zamanda in vitro araç göreceli olarak hızlı, ucuz ve yüksek verimli. Ayrıca insan kas çalışmaları ile ilgili etik sonuçları bu gen ifadesinin manipülasyonları içeren fonksiyonel deneyler için ne anlama <em&gt;, In vitro insan myoblast ve mihotüp kültürleri omurgalı model organizmaların mevcut tek alternatif kalır. Burada, yetişkin ve yaşlı insanların kas birincil iskelet hücreleri veya MPCs dayanıklı, ucuz ve yeniden üretilebilir bir izolasyon için basit bir deney protokolü göstermektedir in vitro kültürü (Şekil 1) standart koşullar açıklanmıştır. kas primer kültürlerinde genellikle iskelet hücreleri yanında fibroblastları içerdiğinden, biz gelişmiş saflık ve birincil miyoblastların kalitesi amaçlayan bir preplating adım öneriyoruz. Özetlemek gerekirse, verimli ve tekrarlanabilir izolasyonu, kültür ve yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından zenginleştirilmiş fonksiyonel MPCs / primer miyoblastların fonksiyonel çalışmalar için izin veren bir protokol kurduk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:183px;">60mm Petri dishes</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:151px;">628160</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell culture plates (6 wells)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">CLS3516</td>
			<td style="width:483px;">Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell culture plates (12 wells)</td>
			<td style="width:101px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:151px;">657 160</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Cell culture Multiwell Plates.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Culture flasks</td>
			<td style="width:101px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:151px;">&#160;690175 (25cm2); 658175 (75cm2).</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Standard Disposable Scalpel</td>
			<td style="width:101px;">Granton</td>
			<td style="width:151px;">91310</td>
			<td style="width:483px;">Sterile stainless steel blade, pattern: 10.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Pipettes</td>
			<td style="width:101px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:151px;">606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml)</td>
			<td style="width:483px;">Cellstar Serological Pipettes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Pasteur plastic pipettes</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:151px;">E1414-0311</td>
			<td style="width:483px;">3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Syringe</td>
			<td style="width:101px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">300613</td>
			<td style="width:483px;">20 mL BD eccentric tip syringe.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">0.2 &#181;m filters</td>
			<td style="width:101px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">ALG422A</td>
			<td style="width:483px;">Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Cell strainers</td>
			<td style="width:101px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">11597522</td>
			<td style="width:483px;">Cell culture strainer sterile individually packed 70&#181;m polypropylene.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:101px;">Roche</td>
			<td style="width:151px;">11088882001</td>
			<td style="width:483px;">Collagenase D; ctivity: &#62;0.15 U/mg&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Dispase II</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D4693</td>
			<td style="width:483px;">Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: &#8805;0.5 units/mg solid.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">CaCl2</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">449709</td>
			<td style="width:483px;">Calcium chloride, anhydrous, beads, &#8722;10 mesh, &#8805;99.9% trace metals basis&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Laminin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">114956-81-9&#160;</td>
			<td style="width:483px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DMEM-high glucose</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D5671</td>
			<td style="width:483px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">F-12 media</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">21765029</td>
			<td style="width:483px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">FGF-b</td>
			<td style="width:101px;">PetroTech</td>
			<td style="width:151px;">100-18B&#160;</td>
			<td style="width:483px;">Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">10270-106</td>
			<td style="width:483px;">Fetal Bovine Serum.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Horse serum (HS)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">H1270</td>
			<td style="width:483px;">Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0781</td>
			<td style="width:483px;">Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G7513</td>
			<td style="width:483px;">L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">T4049</td>
			<td style="width:483px;">Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">TrypLE Express&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">12604-013</td>
			<td style="width:483px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DPBS (cell culture)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D8537</td>
			<td style="width:483px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">PBS (immunostaining)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:483px;">Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Methanol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:151px;">M/4000/PC17</td>
			<td style="width:483px;">Methanol Analytical Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">T8787</td>
			<td style="width:483px;">Triton X-100 for molecular biology.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-MF 20 antibody</td>
			<td style="width:101px;">DSHB</td>
			<td style="width:151px;">MF20-c 2ea 211 &#181;g/ml.</td>
			<td style="width:483px;">MYH1E (MF 20) Mouse mAb.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-MyoD antibody</td>
			<td style="width:101px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:151px;">13812P</td>
			<td style="width:483px;">MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:101px;">Abcam</td>
			<td style="width:151px;">ab16667</td>
			<td style="width:483px;">Rabbit mAb to Ki67 [SP6].</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-mouse 488 secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">A-11029</td>
			<td style="width:483px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">A-11034</td>
			<td style="width:483px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DAPI</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:483px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Senescence &#946;-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:101px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:151px;">9860</td>
			<td style="width:483px;">Senescence &#946;-Galactosidase Staining kit.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">DMSO</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">41639</td>
			<td style="width:483px;">Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (GC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Acridine Orange</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A8097</td>
			<td style="width:483px;">Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">E1510</td>
			<td style="width:483px;">Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">11668019</td>
			<td style="width:483px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Scramble control for transfections</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">1027271</td>
			<td style="width:483px;">miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">218300</td>
			<td style="width:483px;">Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#39;ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor</td>
			<td style="width:101px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">219300</td>
			<td style="width:483px;">Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5&#39;ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Megafuge 2.0 R Centrifuge</td>
			<td style="width:101px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">75003085</td>
			<td style="width:483px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Centrifuge rotor</td>
			<td style="width:101px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">3360</td>
			<td style="width:483px;">Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Eclipse Ti-E Inverted Microscope System</td>
			<td style="width:101px;">Nikon</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Axiovert 200 inverted microscope</td>
			<td style="width:101px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence &#946;-Galactosidase Staining).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Axiovert 25 inverted microscope</td>
			<td style="width:101px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field).</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:183px;">Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope</td>
			<td style="width:101px;">Nikon</td>
			<td style="width:151px;">n/a</td>
			<td style="width:483px;">Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Hydromount</td>
			<td style="width:101px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:151px;">HS-106</td>
			<td style="width:483px;">Hydromount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and culture of myogenic precursor cells/primary myoblasts from skeletal muscle of adult and aged humans

İskelet kası homeostasis kas büyümesi (hipertrofisi), atrofi ve yenilenme bağlıdır. Yaşlanma sırasında ve çeşitli hastalıklarda, kas erimesi meydana gelir. kas kitlesi ve işlevi kaybı, kas lifi tipi atrofi, lif tipi anahtarlama, uydu hücreleri, kas kök hücreleri ve diğer patofizyolojik süreçlerin fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı hatalı kas rejenerasyon ile ilişkilidir. Bu değişiklikler intrasellüler değişiklikler yanı sıra yerel ve sistemik nişler ile ilişkilidir. Kas yaşlanma en yaygın olarak kullanılan kemirgen modellerinde ek olarak, orada kas homeostazisini incelemek için bir ihtiyaçtır ve bağlı etik sonuçları açısından, ağırlıklı olarak, in vitro kültürleri oluşan insan modelleri kullanarak israf. İnsan miyojenik Progenitör Hücrelerinin (MPCs) ve Miyogenesis birincil miyoblastların geniş kullanılmasına rağmen, moleküler mekanizmalar yaşla ilişkili mus farklı yönlerini düzenleyen incelemek için insan primer myoblast ve mihotüp kültürleri kullanarak sınırlı veriler bulunmaktadırcle erimesi, kemirgen kas önerilen yaşlanma mekanizmaları doğrulama yardım. yetişkin ve yaşlı insanlardan izole insan MPCs, birincil iskelet hücreleri ve miyotüplerinden, kullanımı kas büyümesi, atrofi ve rejenerasyon ile ilişkili süreçlerin moleküler mekanizmaların fizyolojik ilgili bir model sağlar. enzimatik sindirim kullanılarak insan kas örneklerinden miyoblastların ve miyotüplerinden - Burada detaylı olarak izolasyon ve insan MPCs ve döl bakımı için, sağlam, ucuz, tekrarlanabilir ve verimli protokol açıklar. Ayrıca, yetişkin ve yaşlı insanların birincil miyoblastlar, bir in vitro kültür içinde yaşlanmaya uğrayabilir hangi kanal adedi belirledik. Son olarak, bu miyoblastları transferinde yeteneğini ve çoğalma ve farklılaşma kapasitesinin karakterize ve Miyogenesis ve kas in vitro israf moleküler mekanizmaların işlevsel çalışmalar gerçekleştirmek için uygunluğunun teklif yeteneğini gösterir. </p&gt;

MPCs / birincil miyoblastlar laminin kaplı bir yüzeye (Şekil 2) üzerine görünür 24 saat sonrası tohumlama olmalıdır. Hücreleri (Şekil 1A, B) iğ benzeri bir şekle benimsemeli ve pasaj 4 hala myod ifade etmelidir. Fibroblastlar da yıldız-benzeri morfolojisi ve MyoD (Şekil 1B, C) ekspresyonu olmaması ile ayırt edilebilir. Hücreler bir sonraki gün birleştirildikten sonra, ortam, taze bFGF ortamı ile değiştirilmesi gerekir. Kültür ortamı, her 48 saat değiştirilmelidir. Temsilcisi sonuçları burada gösterilen ve bizim izolasyon ve kültür protokolünü destekleyen ve insan primer miyoblastların fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilecek farklı teknikleri göstermek için laboratuar 22 amacı verileri yayınladı. Myoblast çoğalması lekelenme kullanarak Ki67 immün ve canlılığı ile ele alınabilirhücre canlılığı deneyi için gr (Şekil 3). farklılaşma, kültür ortamı farklılaşma medya değiştirilmelidir. Myotubes 5 oluşturmalıdır - 7 d ve ağır zincir pozitif (Şekil 3) miyozin olacak. Miyoblastlar yaşlı insanlar (Şekil 3) kas izole edildiğinde mihotüp oluşumu daha az verimli olabileceğini unutmayın. Yaşlılık (SA-β-galaktosidaz) boyama, aynı zamanda kültürdeki yaşlanmış hücrelerin yüzdesini tespit etmek için (Şekil 3) gerçekleştirilebilir. Daha uzun kültürleri (Şekil 3, geçiş 4) ile birlikte, yaşlı insanlar kasından izole fazla miyoblastlar yaşlanmayı göstermektedir görülmektedir. Fonksiyonel çalışmalar için, geni ve mikroRNA sentezleme sentezleme vektörleri, siRNA, mıkroRNA taklit ve antimiRs (Şekil 4) lipofilik transfeksiyon reaktifleri aracılı teslim kullanılarak manipüle edilebilir. Bu 40 için izin verir -Gen / mikroRNA seviyeleri yukarı olmak üzere% 70 transfeksiyon verimi veya fizyolojik aralık (Şekil 4; 22) içinde düzenlenir aşağı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kültür kabı </td><td> Yaklaşık. Konum (kuyu başına) </td><td> 10 ug / ml laminin Cilt </td></tr><tr><td> 35 mm çanak </td><td> 10 cm2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 60 mm çanak </td><td> 20 cm2 </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> 100 mm tabak </td><td> 60 cm2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 24 plaka </td><td> 2 cm2 </td><td> 200 uL / ​​göz </td></tr><tr><td> 12-çukurlu plaka </td><td> 4 cm2 </td><td> 500 uL / ​​göz </td></tr><tr><td> 6-yuvalı plaka </td><td> 10 cm2 </td><td> 1 mL / çukur </td></tr><tr><td> T25 </td><td> 25 cm2 </td><td> 3 mL </td></tr><tr><td> T75 </td><td> 75 cm 2 </td><td> 5 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kaplama Kültür Yüzey Laminin-DPBS Çözüm (10 ug / ml) Önerilen Minimum Birimleri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Spesifik aktivite / Molar kütle </td><td> nihai konsantrasyon </td><td> 10 ml solüsyon için gerekli kütle veya hacim </td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> 0.15 U / mg </td><td> 10 mg / ml (1.5 U / mL) </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> 0.5 U / mg </td><td> 4.8 mg / ml (2.4 U / mL) </td><td> 48 mg </td></tr><tr><td> 250 mM CaCl2 </td><td> 110.98 G / mol </td><td> 2.5 mM </td><td> 100 uL </td></tr></tbody></table> Tablo kas sindirim 2. Enzim Hazırlanması. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" /> Protokolün Adımlar Özetleme Şekil 1. Grafik Özet. Makas veya cerrahi bir neşter (I) &#39;in, insan kas biyopsi ayrışma. 40 dakika boyunca (II) - 30 ve 37 ° C de enzimatik solüsyon ile inkubasyon yapılır. Bir santrifüj tüpüne 70 um&#39;lik bir membran filtresinden çözeltisi büyüme ortamı ilave edilmesi ve süzme yoluyla sindirim sonu (III). 5 dakika boyunca (IV) &#39;ün 443 xg&#39;de santrifüj. Süpernatant atılması ve 2.5 ng / ml, FGF (V) ihtiva eden büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyona. 10 ile kaplanmış bir tabak üzerinde hücrelerin Kaplama81 g / laminin ve 24 saat (VI) daha sonra ortam değiştirme mi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" /> Farklı Passages de Yetişkin ve Yaşlı İnsanların Muscle İzole 2. miyoblastları rakam. Bir. (: Yaş 30 ± 2.8 yaşında,: 69 ± 5 yaşında, BKİ &lt;25 yetişkin) Görüntüler ekstansör digitorum brevis, kadın hastaların tibialis anterior veya abdüktör halluces kas izole miyoblastları temsil etmektedir. Geçit 0 at ve kaplama olmak 5 gün sonra, hücreler hala yuvarlak ve küçük, ama görünen parlak ışık mikroskobu (A) altındadır. Geçit 2 (A) &#39;da gösterildiği gibi miyoblastlar, daha sonra uzun bir şekle kabul edecektir. MyoD fibroblastlar miyoblastların ifade değil,<html> (B). MyoD pozitif hücrelerinin sayılmasına gösterilir; Hata çubukları, standart sapmayı gösterir; n = 3 (B). Myoblast ve fibroblast morfolojisi (C) arasındaki farkları gösteren Temsilcisi görüntü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" /> Şekil 3. İnsan İlköğretim miyoblastları Farklı Boyama Teknikleri Kullanılarak karakterize edilebilir. hücre canlılığı, hücre canlılığı deneyleri için lekeleme ile görüntülenmiştir edilebilir proliferasyon Ki67 immün kullanılarak değerlendirilebilir, farklılaşma MF20 kullanılarak değerlendirilebilir (miyozin ağır zincir), immün ve yaşlanma yaşlanması bağlantılı beta galaktosidaz, kullanılarak görüntülenebilir (SA-β-galaktosidaz ) boyama.<html> ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" /> Şekil 4. İnsan İlköğretim miyoblastları İn Vitro kas Homoestaz Fonksiyonel Araştırmaları el Olabilir. A. MF20 (miyozin ağır zincir) mihotüp büyüklüğü ve sayısı miR-378 aşın veya inhibisyon etkilerini gösteren erişkin insanlardan farklı birincil miyotüplerinin immün. İnsan birincil iskelet hücreleri içinde miR-378 aşırı ekspresyonu veya inhibisyonuna aşağıdaki miR-378 ve IGF1R, valide miR-378, hedef genin göreceli ifadesini gösteren B. qPCR. Rnu-6 ve β-2-mikroglobulin Expression göre sırasıyla gösterilmiştir. Hata çubukları SEM&#39;i göstermektedir; n = 3, * - p &lt;0.05, Student T testi.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans at JoVE.com

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

preparation-culture-myogenic-precursor-cellsprimary-myoblasts-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.8K Görüntüleme.  University of Liverpool.  Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar. 

Video: Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...