This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

注：この作業で使用した株および材料は、それぞれ、 表1および材料の表に記載されています。伝送実験では、N315および陽性デリバティブCFR COLはCFR遺伝子（N315-45とCOL-45）のドナーとして使用しました。これらの株は、以前に（下記参照）を、標準的なコンジュゲーションプロトコルに従って、ドナーとして臨床CFR陽性ブドウ表皮株 （ST2）を用いて、結合することによって得ました。この株はpSCFS7のようなプラスミド7にCFR遺伝子を抱いて。 1.共役フィルター交配法を用いました注：CFR遺伝子（N315-45）7（CM R）を有する黄色ブドウ球菌 N315株をドナーとして使用しました。 COL 8またはMU50 9株（テトR、CmをS）をレシピエントとして使用しました。ダブル-クロラムフェニコールの32 mg / Lで加えたテトラサイクリン8ミリグラム/ Lの存在下で増殖することができる耐性コロニー（テトR、のCm R）の推定上のトランス接合体とみなされ、コロニーPCRによってCFRの存在を決定し、決定するために分析しました。受信者の感受性プロファイル。 <ol><li> いくつかの変更を使用して、以前に記載されたプロトコル10以下の結合を実行します。 <ol><li> 37℃で振盪しながら、トリプシン大豆培養液（それぞれ32 mg / Lのクロラムフェニコールと無い場合、）（TSB）培地中のドナーとレシピエントの一晩培養物を5mLを準備します。 </li><li>新鮮なTSB培地を用いて、1（OD 600 = 1.0）に一晩培養の光学密度（OD 600）を調整します。受信者の文化（COLまたはMU50）の0.5 mLでドナー文化（N315-45）の0.5ミリリットルを混ぜます。混合物に1mlのPBSを追加します。 </li><li> 0.45μmのフィルター膜USIに細菌の混合物を転送します真空ポンプシステムをngの。 </li><li>ヒツジ血液寒天プレート上でフィルター膜を置きます。 1日間37℃でインキュベートします。 注：このステップでは、濃縮された培地は、二重耐性細胞の増殖を可能にするために必要です。 </li><li>プレートからフィルター膜を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlに懸濁します。渦はよくメンブレン上に接続されているすべての細菌を収集します。 </li><li>新鮮なTSBを使用して、細菌懸濁液の連続10倍希釈液を作ります。プレート32 mg / Lのクロラムフェニコールおよびトランス接合の選択のための8 mg / Lのテトラサイクリンを補充したTSB寒天（TSA）プレート上で0-10 -4希釈した試料100μlの。受信者の合計数をカウントするだけでは8 mg / LのテトラサイクリンとTSAプレート上にプレート希釈懸濁液（10 -5〜10 -6）の100μLを。 18-24時間、37℃で培養します。 </li><li> CFの存在のための二重耐性コロニー（推定上のトランス）を分析コロニーPCR 7およびそれらの感受性プロファイル（アンチバイオグラム）によるr遺伝子。 </li><li>標準微量希釈法またはディスク拡散法11に従って、適切な抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）を測定することにより、アンチバイオグラムを決定します。トランス接合体の感受性プロファイルは、クロラムフェニコール（およびCFR遺伝子によって影響を受ける他の化合物）を除いて、受信者に同一である必要があります。この決意は、ドナー株によって開発されたテトラサイクリン耐性を排除することが不可欠です。 </li></ol></li></ol> 2.ファージ形質導入注： サイフォウィルス科に属するバクテリオMR83a（実験室株）を形質導入実験に用いました。 N315-45は、ファージ感染CFRドナーとして使用しました。 N315、COL、またはMU50株レシピエントとして使用しました。 CFRの買収は、ABにより決定しました32 mg / Lのクロラムフェニコールの存在下で増殖するレシピエント株のility。この条件の下で成長するコロニーは（コロニーPCRによって）CFRの存在を決定し、潜在的な汚染を排除するために感受性プロフィールを決定するために分析しました。 <ol><li> ドナー上のファージ増幅 <ol><li> （180 rpm）し振とうしながら37℃で3.6 mMののCa 2+（NBCaCl 2）を補充した栄養ブロス5mlにN315-45の一晩培養物を準備します。 注：カルシウムはファージ感染のために必要とされます。 材料表を参照してください。他社からの栄養ブロスは、カルシウム沈殿などの問題を、持っているかもしれません。 </li><li> 50ミリリットルのガラスフラスコまたはガラスバイアル中NBCaCl 2の10 mLの最終体積で千：一晩培養物1を希釈することにより継代培養を準備します。 （180 rpm）し振とうしながら37℃で1時間、細菌を成長させます。 </li><li> NBCaCl 2メディで希釈したファージMR83aのシリーズを用意ええと（10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6）。細菌培養物に希釈したファージの20μlのを追加します。また、細菌細胞の成長のための陽性対照として、翌日のファージ力価を決定するために使用できるファージ感染、ない対照培養物を調製します。 </li><li>一晩穏やかに振盪（100 rpm）しながら37℃で培養を成長させます。 注：感染ファージが過剰でない場合に、細胞がある程度成長します。その後、彼らは溶菌サイクルを通じてによるファージ増幅に溶解段階に入ります。ファージと文化は透明性の明確な速度が表示されますしながら、ファージのない文化は、完全な成長が表示されます。 </li><li>追加されたファージの最高希釈で1または2透明な培養バイアルを選択します。 </li><li> 15ml遠心チューブに培養液を移します。クロロホルム250μlを添加し、チューブを反転させることにより十分に混合します。 </li><li> 5000でチューブを遠心<em&gt; 4℃で20分間XG。 </li><li>新鮮なチューブに上清を移し、使用するまで4℃で保管してください。 注：ファージは、少なくとも数ヶ月間安定であるが、長すぎるためのファージ調製物を貯蔵することは力価及び形質導入効率を低下させます。 </li></ol></li><li> ファージ力価（ファージプラークアッセイ）を測定 <ol><li>栄養ブロス寒天（1.5％寒天）培地を準備。 55℃の水浴中で暖かいを保ちます。 3.6 mMの最終濃度を培地にオートクレーブし、0.5MのCaCl 2溶液を加えます。 90ミリメートルペトリ皿（NBCaCl 2板）にそれを注ぎます。 </li><li>振盪しながら37℃でNBCaCl 2 5ml中のN315の一晩培養物を準備します。これは、上述した対照培養（ステップ2.1.3）で置換することができます。 </li><li> NBCaCl 2の200μlの中に一晩培養物の10μlを添加して、均一にNBCaCl 2プレートの上に広げました。時の表面拡散を停止プレートは、液体で覆われています。プレートが乾燥してみましょう。 </li><li>シリアル1:10希釈を行います（10 -5 -10から-10）NBCaCl 2培地を使用して、先に調製したファージ（ステップ2.1.8）の。 </li><li>スポット細菌で覆われたプレート上に各ファージ希釈液を3μl。 </li><li> 30℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>プラーク数をカウントし、以下の式を用いてファージ力価を計算します。プラーク形成単位（PFU）/ミリリットル=プラークの数のx希釈倍率/スポッティングボリューム（3×10 -3ミリリットル） </li></ol></li><li> ファージ形質導入 注：前のステップ（2.1.8）で調製したファージプールは、 黄色ブドウ球菌株にCFR遺伝子の導入をテストするために使用されます。この実験では、N315、COL、またはMU50をレシピエントとして使用されている株。 <ol><li> （180 rpm）し振とうしながら37℃でNBCaCl 2の5ミリリットルでN315、COL、またはMU50の一晩培養物を準備します。 </li><li>トンを希釈彼は10 9 PFU / mLの〜にNBCaCl 2中のファージ。 </li><li> 50ミリリットルのガラスバイアルでは、一晩培養物500μlを、新鮮なNBCaCl 2500μlの、およびファージの1ミリリットル（〜10 9 PFU / mlで）混ぜます。感染の期待多重度（MOI）を、穏やかに30分間（100 rpm）し振とうしながら37℃で1インキュベート混合物を超えてはなりません。 注記：直前ファージの添加（内因性制限酵素を不活性化するために2分間52°C）にレシピエント細胞の熱処理が効率12を増大させることができます。 </li><li> 20％のNa 3 -クエン酸塩の50μLを加えます。 37℃で30分間穏やかに振盪続けます。 注：のNa 3 -クエン酸塩はカルシウムの適度なキレート剤として作用します。 </li><li>溶融したブレインハートインフュージョン（BHI）寒天（1.5％寒天）培地を調製し、55℃の水浴に保管してください。 </li><li> 32 mg / Lのchlorampを補っ暖かいBHI寒天の50ミリリットルを追加し、100ミリリットルのフラスコに細菌ファージ混合物を移しhenicol、よく混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。 注：この方法は、増殖するコロニー（推定形質導入）の少数の検出を可能にします。 </li><li> 24〜48時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>また、32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充した新しいBHI寒天プレート上にコロニーを転送することにより、抵抗のために生成されたコロニー（形質導入）をテストします。コロニーPCR 7によるCFR遺伝子の存在を確認してください。 </li></ol></li></ol> 3.自然変換注： 黄色ブドウ球菌の自然形質転換アッセイは我々の以前の研究2に記載の方法に従って行いました。 N315誘導体、N2-2.1 2,7は 、レシピエントとして使用しました。この株では、 ため息座は構成的に発現ため息2になるように複製されました。 DETのためため息を発現する能力変異体を単離する方法についてailed手順は、前の説明2を参照してください。転送する耐性マーカーは、クロラムフェニコールでない場合、以前に2記載されているように、PRIT-ため息（CM R）は 、ため息を発現させることができます。精製されたプラスミドまたはCFRからの全DNAの抽出は、 黄色ブドウ球菌 COL-45 7形質転換のためのドナーDNAとして使用さ-acquired。 <ol><li> ドナーDNAの調製 <ol><li> TSBの50 mLを含む300ミリリットルのフラスコ中で37℃で振盪しながら一晩COL-45を養う32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充しました。文化大腸菌 HST04運ぶpHY300 プラスミド（テト R）は、対照実験のためにプラスミドを抽出します。 注：HST04（ ダム- / DCM - ）は、DNAが遺伝子13をメチ欠いています。 DNAメチラーゼと他の従来の株も使用することができますDNAのメチル化状態は、変換効率に影響を与えないので、dは、DNA供与体を調製しました。代替的に、 黄色ブドウ球菌 COL株から精製pT181のプラスミドはまた、形質転換アッセイ2の陽性対照として使用することができます。 </li><li>遠心分離（4℃で10分間、8000×gで ）によって細胞を収集します。 </li><li>全DNAを精製し、プラスミドDNA抽出キットまたは従来のDNA精製法を用いてプラスミドを抽出します。 </li><li>分析計によって精製されたDNAを定量化し、使用するまで4℃で保管してください。 注：形質転換試験、古い通常一週間以内の新鮮なDNA調製物を使用してください。古いDNA調製物は、形質転換の効率を低下させます。 </li></ol></li><li> 形質転換試験 <ol><li>文化振とうしながら37℃で一晩TSB 5ml中の受容細胞（N2-2.1）。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに一晩培養の0.5ミリリットルを転送します。 Precipi遠心分離（4℃、1分間10,000×gで ）によって細胞をテート。 </li><li> 50mlのチューブ内CS2培地10mLで細胞を一時停止します。 注：CS2媒体（材料表に培地組成を参照）、黄色ブドウ球菌 2の自然形質転換のための能力を誘発する完全合成培地です。例えばTSBまたはBHIなどの他の標準的な実験用培地は、形質転換2、13には適していません。 </li><li>後期指数期（約8時間）まで（180 rpm）し振とうしながら37℃で細菌を成長させます。 </li><li>遠心分離（4℃で5分間、5,000×gで ）により細胞を収穫。 </li><li>新鮮CS2培地10mlに細胞を再懸濁。 </li><li>細胞懸濁液に精製されたプラスミドまたはゲノムDNA（ステップ3.1.4）の10μgのを追加します。 37°Cと2.5時間、180rpmで振盪します。 注：DNAと短いインキュベーション時間（&lt;2.5時間）下TRANSFになりますormation周波数。 </li><li>遠心分離（5000×gで 5分間4℃で）によって細胞を収集します。 </li><li> BHI培地10ml中で細胞を再懸濁します。 32 mg / Lのクロラムフェニコール（または対照実験では5 mg / Lのテトラサイクリン）との溶融BHI寒天（55°C）サプリメントの90ミリリットルで細胞懸濁液を混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。迅速クールと寒天を固化させます。 </li><li> 2日間37℃で培養します。 </li><li>その抵抗特性を確認するために、適切な抗生物質を含む新しいBHI寒天プレートに（楊枝を使って）コロニーを転送することによって生成されたコロニー（形質転換体）を複製します。コロニーPCR 7によって取得された耐性遺伝子（CFRまたはtetM）を確認してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+variation+and+evolution+of+Staphylococcus+aureus.">Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus.</a> IJMM. 300, 98-103 (2010).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+cryptic+secondary+sigma+factor+gene+unveils+natural+competence+for+DNA+transformation+in+Staphylococcus+aureus.">Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).</li><li>Caryl, J. A., O'Neill, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+nucleotide+sequence+of+pGO1,+the+prototype+conjugative+plasmid+from+the+Staphylococci.">Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci.</a> Plasmid. 62, 35-38 (2009).</li><li>Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phage-related+chromosomal+islands+of+Gram-positive+bacteria.">The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).</li><li>Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanotubes+mediate+bacterial+communication.">Intercellular nanotubes mediate bacterial communication.</a> Cell. 144, 590-600 (2011).</li><li>Dubey, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+Characteristics+of+Bacterial+Nanotubes.">Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes.</a> Dev cell. 36, 453-461 (2016).</li><li>Cafini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transmission+of+the+cfr+gene+to+MRSA+and+Enterococcus:+role+of+Staphylococcus+epidermidis+as+a+reservoir+and+alternative+pathway+for+the+spread+of+linezolid+resistance.">Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance.</a> J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).</li><li>Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillinase+production+and+intrinsic+resistance+to+penicillins+in+Staphylococcus+aures.">Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures.</a> Lancet. 1, 835-838 (1966).</li><li>Kuroda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+of+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Lancet. 357, 1225-1240 (2001).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA.">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322, 1843-1845 (2008).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).</li><li>Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+DNA+transfer+efficiency+by+temporary+inactivation+of+host+restriction.">Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction.</a> BioTechniques. 26, 892-894 (1999).</li><li>Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-affecting+antibiotics+modulate+natural+transformation+in+SigH-expressing+Staphylococcus+aureus.">Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus.</a> J. Antibiot. , (2015).</li><li>Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cfr+rRNA+methyltransferase+confers+resistance+to+Phenicols,+Lincosamides,+Oxazolidinones,+Pleuromutilins,+and+Streptogramin+A+antibiotics.">The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction-modification+system+differences+in+Helicobacter+pylori+are+a+barrier+to+interstrain+plasmid+transfer.">Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer.</a> Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).</li><li>Evans, B. A., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+variation+in+transformation+frequency+in+Streptococcus+pneumoniae.">Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae.</a> ISME J. 7, 791-799 (2013).</li><li>Wilson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+natural+transformation+frequency+of+Campylobacter+jejuni+in+liquid+shake+culture.">Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture.</a> Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).</li><li>McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+temperate+bacteriophage:+carriage+and+horizontal+gene+transfer+is+lineage+associated.">Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).</li><li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genomics+and+the+impact+of+horizontal+gene+transfer.">Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer.</a> IJMM. 304, 103-109 (2014).</li><li>Uchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragenus+generalized+transduction+in+Staphylococcus+spp.+by+a+novel+giant+phage.">Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage.</a> ISME J. 8, 1949-1952 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html>この作品は、黄色ブドウ球菌における遺伝的決定のHGTを研究するために、3つの主要な方法について説明します。形質導入および結合は数十年にわたって研究されてきたが、自然形質転換の存在はごく最近の2を認識しました。このように、 黄色ブドウ球菌は、HGTの3メジャーモードのすべてが装備され、それらのすべてのテストは遺伝的決...

黄色ブドウ球菌は自然に人間や動物の皮膚や鼻腔に生息する共生グラム陽性細菌です。この細菌種は、病院や医療現場における院内感染の主な原因です。また、別の抗菌化合物に対する耐性を開発する能力は、世界的な懸念にこの細菌によって引き起こされる感染症の管理を行っています。 耐性表現型の拡散に関与する2つの主要な経路が知られている：耐性遺伝子型のクローン普及および細菌プール間の遺伝的決定の普及を。 黄色ブドウ球菌 、異なる抗生物質耐性遺伝子（ならびに病原性決定因子）の場合には、モバイル遺伝要素（MGES 1）に関連することが見出されています。 黄色ブドウ球菌のゲノムにおけるこれらの要素の存在は、世代の取得及び譲渡ことを示しています細菌集団内エティックな材料は、 黄色ブドウ球菌の適応と進化のための重要な役割を果たし得ます。 形質転換、抱合、およびファージ形質導入：遺伝物質は、グラム陽性細菌にHGTの三周知の機構を介して交換することができます。形質転換は、遊離DNAの取り込みを伴います。能力段階：外来DNAを取得するには、細菌細胞は、特別な生理的相を開発する必要があります。この段階に到達すると、コンピテント細胞は、細胞質中にDNAを輸送する新しい遺伝的決定を取得することが可能です。 黄色ブドウ球菌の場合には、天然の形質転換の存在は、最近2を実証されています。これに伴い、当社グループは、その構成的発現がreachin可能な黄色ブドウ球菌をレンダリングする方法を開発の能力段階で、オンため息因子の発現の関連性（不可解な二次転写シグマ因子）に光を当てるしています自然変換2により耐性表現型の獲得を可能にするグラム能力段階、。 結合は、別の（受信者）に1生細胞（ドナー）からのDNAの送信を伴うプロセスです。どちらの細胞は、DNAが、そのようなチューブや毛穴などの特殊な構造によって保護された状態で交換することができるように、直接接触していなければなりません。この方法によるDNAの導入は、接合機械を必要とします。 黄色ブドウ球菌では、プロトタイプ接合プラスミドは、接合オペロンTRAA 3を保有PGO1、です。 ファージ形質導入は、バクテリオファージ感染を介して細胞への細胞からのDNAの移動を伴う、代わりにウイルスDNAのファージキャプシドに、細菌DNAのパッキングを意味します。 黄色ブドウ球菌分離株のほとんどは、バクテリオファージ1によって溶原化されています。ストレス条件に、プロファージは、細菌GENOMから切り出すことができますeおよび溶菌サイクルへの移行。 これらは、 黄色ブドウ球菌におけるDNAの伝送のための3つのよく知られた機構です。病原性島4の転送中にいくつかのような「擬似変換」などの追加の転送メカニズム、2およびファージのようなシステムがあります。最近、一つのグループは、「ナノチューブ」は、隣接するセル5,6の間（プラスミドDNAなど）は、細胞材料の転写に関与しているが、フォローアップ研究は、これまで、他のグループから出現していないことを報告しました。 接合、形質導入、および自然変換：この作品は、3つの主要な移動経路をアドレス指定することにより、黄色ブドウ球菌にHGTを勉強するために必要な方法論を提供します。これらの方法論を用いて得られた結果は、間のCFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）の送信を研究するために使用されました黄色ブドウ球菌は7菌株 。これらの3つの技術は、黄色ブドウ球菌におけるMGE伝送の調査のための多目的なツールです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="737">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Becton Dickinson&#160;</td>
			<td style="width:121px;">211825</td>
			<td style="width:116px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutrient Broth No. 2</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep blood agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co.,Ltd.</td>
			<td>E-MR96</td>
			<td>Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar powder</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>010-08725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulose Ester Gridded 0.45 &#956;L HAWG filter</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>HAWG 02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAfilter Plasmid Midi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the study of horizontal gene transfer in staphylococcus aureus

主要な日和見ヒト病原体黄色ブドウ球菌の1つの重要な特徴は、急速に抗生物質に対する耐性を獲得するその並外れた能力です。ゲノム研究は、 黄色ブドウ球菌は、水平遺伝子伝達（HGT）は、黄色ブドウ球菌の進化に重要な役割を果たしていることを示唆し、モバイル遺伝的要素に位置し、多くの病原性と抵抗性遺伝子を有することを明らかにしました。しかし、 黄色ブドウ球菌にHGTを研究するために使用される方法の完全かつ詳細な説明はまだ、不足している、特に自然変換について、最近、この細菌で報告されています。抱合、ファージ形質導入、および自然変換：この作品は、 黄色ブドウ球菌におけるHGTのin vitroでの研究のために有用である3つのプロトコルについて説明します。この目的にフェニコールを与える、CFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）、リンコサミド、オキサゾリジノン、プレウロムチリン、およびストレプトA（PhLOPSA）表現型ース間オン抵抗使用しました。 黄色ブドウ球菌は、他の株に遺伝物質を転送するを通じてメカニズムを理解することは、耐性の急速な買収を理解するために不可欠であるとサーベイランスプログラムで報告普及のモードを明確にすることや、今後さらに拡散モードを予測するのに役立ちます。

ここで示される結果は、以前に公開されている（出版社の許可を得て参照7から適応）。私たちは、HGTの三つのメカニズムを調査することにより、 黄色ブドウ球菌株で15、低レベルのリネゾリド耐性とPhLOPSA耐性表現型14の発現を引き起こすCFR遺伝子の潜在的な伝送経路を検討しました。 <p cl...

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Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

ここでは接合、形質導入、および黄色ブドウ球菌における自然形質転換のin vitroでの調査のための3つの異なるプロトコルを記述します。

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

16.4K ビュー.  University of Tsukuba. ここでは接合、形質導入、および黄色ブドウ球菌における自然形質転換のin vitroでの調査のための3つの異なるプロトコルを記述します。 

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The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

免疫・感染学

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（MRSA）ラットにおける

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

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Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

バイオフィルム関連をターゲット<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...