細菌の負担と好中球の反応を同時に監視する技術は、ステープルオーレウス持続性のメカニズムと治療戦略の有効性に関する洞察を提供することができます。この技術の主な利点は、感染の持続期間を通じて、複数のパラメータを生きている宿主で縦方向に測定できることである。マウスのドーサムに傷をどこに置くか、皮膚を切除する方法、およびステープルアウレウスで創傷を接種する方法を示することが重要です。
氷の上の負の80°Cの貯蔵から興味の生物発光ステープルアウレウス株を解凍することから始めます。5%のウシの血寒天プレートに培養物をストリークする前に。摂氏37度で一晩インキュベーションを行う場合。
翌朝、ステープルアウレウスプレートからトリプティック大豆スープ(TSB)に3〜4個のコロニーを移す。37°Cで一晩揺れるインキュベーションのためのクロラムフェニコールのミリリットルあたり10マイクログラムを補う。翌朝、120マイクロリットルの培養サンプルをTSBの6ミリリットルで希釈する。
クロラムフェニコール1ミリリットル当たり10マイクログラム、摂氏37度で2時間のインキュベーション、毎分200回転。600ナノメートルの光学密度が0.5に達すると、3ミリリットルの細菌懸濁液を10ミリリットルの氷冷DPBSに移します。上清を慎重にデカントした後、ペレットに冷たいDPBSを加え、再懸濁菌を徹底的に渦化させる。
2回目の遠心分離後、細菌ペレットを氷上のPBSの1.5ミリリットルで再懸濁する。細菌濃度を確認するために、細菌懸濁液の100マイクロリットルを4thに1×10、5thに1x10の倍で連続的に希釈し、新鮮なPBSで。そして、個々の寒天プレートに各希釈液の20マイクロリットルをプレート。
摂氏37度で一晩のインキュベーションの後、総検査でコロニー形成単位の数を数え、前日の細菌濃度を計算する。レシピエント動物の皮膚傷の切除については、マウスの背面に1つずつ2インチのセクションを剃る前に、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認する。そっと拭いて、迷子の毛を取り除きます。
そして、露出した皮膚を消毒し、逐次10%ポビドネヨウ素、及び70%エタノール浸漬ガーゼ用途を用いた。スパイラルパターンで、外科的領域の中心から外側に移動する。皮膚を約1分間乾燥させた後、準備された外科領域の中心にある無菌6ミリメートルパンチ生検をしっかりと押す。
パンチ生検をツイストして、皮膚に円形の輪郭を作り、皮膚組織を完全に切り裂き、輪郭の少なくとも1つの部分を作ります。根底にある筋膜や組織に切り込まないように注意してください。次いで、滅菌ハサミ、および鉗子を使用して、表皮および真皮を切断し、パンチ生検によって刻印された円形パターンに従う。
ステープルアウレウス接種の場合、調製された生物発光細菌接種剤の50マイクロリットルで28ゲージのインスリン注射器を充填する。そして、指を使って負傷した動物の真皮を横に引っ張ります。組織に対してほぼ平行にシリンジを保持し、抵抗の急激な低下が感じられるまでゆっくりと組織に注射器を挿入する。
筋膜のピアスを示す。針を創傷の中央に置いて、接種剤の全容をゆっくりと送達する。接種剤が傷口の中心に泡を形成し、漏れや分散を最小限に抑えて確認します。
そして、動物からゆっくりと注射器を取り除きます。その後、完全な回復まで熱と監視でケージに動物を返します。創傷および感染後、そして実験中に毎日、麻酔薬を生物発光および蛍光画像体に入れ、傷をできるだけ平らにする。
イメージャーソフトウェアで、イメージングモードとして発光と写真を選択します。露光時間は、小さなビン分割時に 1 分、発光の場合は F/ストップ 1、写真用の F/Stop 8、および放出フィルタ用に開く必要があります。次に、[取得] をクリックして画像を記録します。
in vivo蛍光イメージングでは、蛍光を選択し、画像を撮像モードとして写真を選択します。露光時間は、小さなビンで1秒、蛍光のF/ストップ1、写真用のF/ストップ8、励起波長と発光波長を30ナノメートルで465、20ナノメートルで520、それぞれ高ランプ強度でプリセットする必要があります。次に、[取得] をクリックして画像を記録します。
両方の画像を取得した後、完全に回復するまで、監視と一緒にケージに動物を返します。画像解析のために、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで、定量化する画像を開き、周囲の皮膚を含む創傷領域全体にデフォルトの円形領域を配置します。対象の測定領域をクリックし、創傷の平均流束の値を記録して、各信号の平均フラックスを時間に対してプロットできるようにします。
創傷治癒を測定するには、創傷端の上に関心のある円形領域をフィットさせ、創傷の面積をセンチメートル平方で測定し、ベースラインと時間からの小数変化をプロットできるようにする。本代表的実験では、条件付きEGFP発現骨髄異分化第一応答88、またはMyD88ノックアウトマウスは、非条件付EGFP発現動物よりも、ステープルオーレウス接種に対する感受性が大きいことを示した。感染の最初の8日間に観察された80%の致死性を有する。
マウスの両方の株は、感染直後に体重の約5%を失った。しかし、マウスを発現する条件付きEGFPは、2日目までに元の体重を回復した。MyD88マウスはしませんでしたが。
ステープルアウレウス感染の存在下での創傷閉鎖は、2つの株間で異ならなかった。しかしながら、無菌傷のMyD88ノックアウトマウスは、動物を発現する条件付きEGFPと比較して、創傷治癒に重大な欠陥を持っていた。全動物イメージングは、MyD88ノックアウト動物の創傷における生物発光シグナルの増加によって証明されるように、動物を発現する条件付きEGFPと比較して、より高い細菌負担を明らかにした。
MyD88ノックアウト動物の未感染の創傷に対する初期好中球の人身売買の40%の減少は、動物を発現する条件付きEGFPと比較しても観察された。1 x 10から第7コロニー形成ユニットのステープルオーレウスが創傷直後に導入された場合、ノックアウト動物では、条件付きEGFP発現動物と比較して好中球の密売が有意に減少した。細菌を分配する前に、注射器に気泡がなく、針の位置が創傷の中央に正しく配置されていることを確認してください。
動物組織は、目的のタンパク質の発現および創傷からの細菌の播種を測定するために終点で収穫することができる。黄色ブドウ球菌は人間に感染する。そのため、細菌を取り扱う際には個人保護具を着用し、病原体を含む注射器を取り扱う際には注意が必要です。
この技術は、感染に対する宿主の自然免疫応答を高めるステープル・アウレウス感染症に対する生物学的治療の使用を探求するのに役立った。
