This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

NOTA: I ceppi e materiali utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella 1 e la Tabella dei Materiali rispettivamente. Negli esperimenti di trasmissione, N315 e COL CFR derivati -positive sono stati utilizzati come donatori del gene CFR (N315-45 e COL-45). Questi ceppi sono stati precedentemente ottenuti per coniugazione, utilizzando come donatore di un quadro comune di riferimento clinico -positivo ceppo Staphyloccocus epidermidis (ST2), seguendo il protocollo standard di coniugazione (vedi sotto). Questo ceppo ospitava il gene cfr su un plasmide pSCFS7 simile 7. 1. Coniugazione Usando il metodo del filtro-accoppiamento NOTA: Un ceppo di S. aureus N315 porta il gene cfr (N315-45) 7 (Cm R) è stato utilizzato come donatore. COL 8 o 9 Mu50 ceppi (Tet R, Cm S) sono stati utilizzati come destinatari. Raddoppiare-colonie resistenti (Tet R, Cm R) in grado di crescere in presenza di 32 mg / L di cloramfenicolo e di 8 mg / L di tetraciclina sono stati considerati transconjugants putativi e sono stati analizzati per determinare la presenza di cfr dalla colonia PCR e di determinare il destinatario profilo di suscettibilità. <ol><li> Eseguire coniugazione seguendo un protocollo precedentemente descritto 10 con alcune modifiche: <ol><li> Preparare 5 ml di cultura durante la notte del donatore e ricevente in media Tryptic brodo di soia (TSB) (con e senza 32 mg / L cloramfenicolo, rispettivamente), con agitazione a 37 ° C. </li><li> Regolare la densità ottica (OD 600) delle culture overnight a 1 (OD 600 = 1.0) utilizzando medie TSB fresco. Mescolare 0,5 ml della cultura del donatore (N315-45) con 0,5 ml di cultura ricevente (COL o Mu50). Aggiungere 1 ml di PBS alla miscela. </li><li> Trasferire la miscela di batteri su una membrana filtrante usi 0,45 micronng un sistema pompa a vuoto. </li><li> Mettere le membrane filtranti su una piastra di agar sangue di pecora. Incubare a 37 ° C per 1 giorni. NOTA: In questo passaggio, terreno arricchito è necessario per consentire la crescita di cellule doppio-resistenti. </li><li> Estrarre la membrana filtrante dalla piastra e sospendere in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Vortex bene a raccogliere tutti i batteri attaccati sulla membrana. </li><li> Effettuare una diluizione di 10 volte seriale della sospensione batterica utilizzando TSB fresco. Piatto 100 l di 0-10 -4 campioni diluiti su TSB agar (TSA) piastre integrato con 32 mg / L cloramfenicolo e 8 mg / L di tetraciclina per la selezione di transconjugants. Piastra 100 microlitri della sospensione diluita (10 -5 -10 -6) su piastre TSA con 8 mg / L da solo tetraciclina per contare il numero totale di destinatari. Incubare le piastre a 37 ° C per 18-24 ore. </li><li> Analizzare colonie doppio resistente (transconjugants putativi) per la presenza del cfR gene da colonia PCR 7 e i loro profili di suscettibilità (antibiogramma). </li><li> Determinare all&#39;antibiogramma misurando le concentrazioni minime inibenti (MIC) di antibiotici appropriati secondo il metodo microdiluizione o diffusione disco metodo standard 11. Il profilo di sensibilità dei transconjugants deve essere identico al destinatario, tranne cloramfenicolo (e altri composti colpite dal gene cfr). Questa determinazione è essenziale per escludere resistenza alla tetraciclina sviluppato dal ceppo donatore. </li></ol></li></ol> 2. fagi trasduzione NOTA: Il MR83a batteriofago appartenente alla famiglia siphoviridae (laboratorio stock) è stato utilizzato negli esperimenti di trasduzione. N315-45 è stato utilizzato come donatore cfr dell&#39;infezione fagica. N315, COL, o Mu50 ceppi sono stati utilizzati come destinatari. L&#39;acquisizione di cfr era determinata dalla abilità del ceppo ricevente di crescere in presenza di 32 mg / L cloramfenicolo. Colonie crescono in questa condizione sono stati analizzati per determinare la presenza di cfr (dalla colonia PCR) e per determinare il profilo di sensibilità per escludere potenziale contaminazione. <ol><li> Amplificazione Phage sul donatore <ol><li> Preparare una cultura durante la notte di N315-45 in 5 ml di brodo nutritivo integrato con 3,6 mM Ca 2+ (NBCaCl 2) a 37 ° C con agitazione (180 rpm). NOTA: Il calcio è necessario per l&#39;infezione dei fagi. Vedere la tabella materiali. brodo nutriente da altre società potrebbe avere problemi, come ad esempio la precipitazione del calcio. </li><li> Preparare subcolture diluendo la coltura overnight 1: 1.000 in un volume finale di 10 ml di NBCaCl 2 in boccette di vetro 50 ml o flaconi di vetro. Crescere i batteri per 1 ora a 37 ° C con agitazione (180 rpm). </li><li> Preparare una serie di MR83a fago diluito in NBCaCl 2 medium (10 -2, -3 10, 10 -4, -5 10 e 10 -6). Aggiungere 20 ml di fago diluito nella coltura batterica. Anche preparare una coltura di controllo senza infezione fagica, che serve come controllo positivo per la crescita cellulare batterica e può essere utilizzato per determinare il titolo fago il giorno successivo. </li><li> Far crescere le colture a 37 ° C con dolce agitazione (100 rpm) durante la notte. NOTA: Le cellule saranno crescono in certa misura quando il fago infettante non è in eccesso; quindi, essi entreranno in fase di lisi dovuta all&#39;amplificazione fago attraverso il ciclo litico. La cultura senza fago mostrerà piena crescita, mentre le culture con fago mostreranno tassi distinti di trasparenza. </li><li> Selezionare una o due flaconi di coltura liquidati con la più alta diluizione del fago aggiunto. </li><li> Trasferire le culture in 15 ml provette da centrifuga. Aggiungere 250 ml di cloroformio e mescolare accuratamente invertendo i tubi. </li><li> Centrifugare le provette a 5.000 <em&gt; xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire i supernatanti in provette freschi e conservarli a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. NOTA: Il fago è stabile per almeno alcuni mesi, ma memorizzare la preparazione fago per troppo tempo riduce l&#39;efficienza titolo e trasduzione. </li></ol></li><li> Misurare il titolo del fago (saggio di placca fago) <ol><li> Preparare il brodo nutriente agar (agar 1,5%) media; tenere in caldo in un bagno di acqua a 55 ° C. Aggiungere autoclavato 0,5 M CaCl 2 soluzione al mezzo ad una concentrazione finale di 3,6 mM. Versare il tutto in 90 mm piastre di Petri (NBCaCl 2 piastre). </li><li> Preparare una cultura durante la notte di N315 in 5 ml di NBCaCl 2 a 37 ° C con agitazione; questo può essere sostituito con la coltura di controllo sopra descritto (punto 2.1.3). </li><li> Aggiungere 10 ml di cultura durante la notte in 200 ml di NBCaCl 2 e distribuito uniformemente sulla piastra NBCaCl 2. Arrestare la diffusione quando la superficie dila piastra è ricoperta con liquido. Lasciare la piastra a secco. </li><li> Fare un diluizione 1:10 di serie (da 10 -5 -10 -10) del fago precedentemente preparato (fase 2.1.8) utilizzando NBCaCl 2 di media. </li><li> Spot 3 ml di ciascuna diluizione fago sulla piastra coperta con batteri. </li><li> Incubare la piastra per una notte a 30 ° C. </li><li> Contare i numeri placca e calcolare il titolo fago utilizzando la seguente equazione: Plaque unità di formatura (pfu) / ml = Numero di placche x fattore di diluizione / Volume trovato (3 x 10 -3 ml) </li></ol></li><li> fagi trasduzione NOTA: La piscina fago preparato nel passaggio precedente (2.1.8) è utilizzato per testare la trasduzione del gene cfr nei ceppi di S. aureus. In questo esperimento, ceppi N315, COL, o Mu50 sono usati come destinatari. <ol><li> Preparare la cultura durante la notte di N315, COL o Mu50 in 5 ml di NBCaCl 2 a 37 ° C con agitazione (180 rpm). </li><li> Diluire tegli fago in NBCaCl 2 a ~ 10 9 pfu / ml. </li><li> In un flaconcino di vetro da 50 ml, mescolare 500 ml di cultura durante la notte, 500 ml di fresco NBCaCl 2, e 1 ml di fago (~ 10 9 pfu / ml); la molteplicità atteso di infezione (MOI) non deve superare 1. Incubare la miscela a 37 ° C agitando delicatamente (100 rpm) per 30 minuti. NOTA: Trattamento termico di cellule riceventi appena prima dell&#39;aggiunta del fago (52 ° C per 2 minuti per inattivare gli enzimi di restrizione endogeno) può aumentare l&#39;efficienza 12. </li><li> Aggiungere 50 ml di 20% di Na 3 -Citrate. Continuare delicata agitazione per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: Na 3 -Citrate agisce come un chelante moderata di calcio. </li><li> Preparare agar (agar 1,5%) media fuso infusione cuore-cervello (BHI) e conservarlo in un bagno d&#39;acqua a 55 ° C. </li><li> Trasferire il composto batterio-fago in un pallone da 100 ml, aggiungere 50 ml di caldo agar BHI integrato con 32 mg / L chloramphenicol, e mescolare bene. Versare il composto in piatti di 90 mm di Petri. NOTA: Questo metodo consente il rilevamento di un piccolo numero di crescita colonie (transductants putativi). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 24-48 ore. </li><li> Ulteriori testare le colonie generati (transductants) per la resistenza trasferendo le colonie su nuove piastre di agar BHI integrato con 32 mg / L cloramfenicolo. Confermare la presenza del gene cfr dalla colonia PCR 7. </li></ol></li></ol> 3. trasformazione naturale NOTA: Il saggio naturale trasformazione in S. aureus è stata effettuata secondo il metodo descritto nel precedente studio 2. Il derivato N315, N2-2.1 2, 7, è stato utilizzato come destinatario. In questo ceppo, il locus sospiro è stato duplicato in modo da costitutivamente sospiro Express 2. per detprocedure affliggeva su come isolare varianti di competenza sospiro che esprimono, si prega di vedere la descrizione precedente 2. Se il marcatore di resistenza da trasferire non è cloramfenicolo, PRIT-Sigh (Cm R) può essere utilizzato per esprimere sospiro, come descritto in precedenza 2. Plasmide purificata o intero estratto il DNA da CFR -acquired S. aureus COL-45 7 viene utilizzato come il DNA del donatore per la trasformazione. <ol><li> Preparazione di DNA donatore <ol><li> Coltivazione COL-45 durante la notte con agitazione a 37 ° C in una beuta da 300 ml contenente 50 ml di TSB completato con 32 mg / L cloramfenicolo. Cultura E. coli HST04 pHY300 portando plasmide (Tet R) per estrarre il plasmide per l&#39;esperimento di controllo. NOTA: HST04 (dam - / DCM -) manca il DNA metilasi geni 13. Altri ceppi convenzionali con metilasi DNA possono anche essere usod per preparare il donatore del DNA, perché lo stato di metilazione del DNA non influenza l&#39;efficienza di trasformazione. In alternativa, pT181 plasmide purificato dal ceppo S. aureus COL può anche essere usato come controllo positivo per il test di trasformazione 2. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (8000 xg per 10 min a 4 ° C). </li><li> Estrarre i plasmidi usando un kit di estrazione di DNA plasmidico o un metodo di purificazione del DNA convenzionale per purificare l&#39;intero DNA. </li><li> Quantificare il DNA purificato tramite spettrometro sé a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. NOTA: Utilizzare una preparazione del DNA fresco per il test di trasformazione, di solito meno di una settimana di età. preparazioni Old DNA riducono l&#39;efficienza della trasformazione. </li></ol></li><li> test trasformazione <ol><li> Cultura cellula ricevente (N2-2.1) durante la notte in 5 ml di TSB a 37 ° C con agitazione. </li><li> Trasferire 0,5 ml di coltura durante la notte in una provetta da 1,5 ml. di precipitazionetate le cellule per centrifugazione (10.000 xg per 1 min a 4 ° C). </li><li> Sospendere le cellule con 10 ml di mezzo CS2 in un tubo da 50 ml. NOTA: media CS2 è un mezzo sintetico completo che induce la competenza per la trasformazione naturale in S. aureus 2 (vedere la composizione media nella tabella materiale). Altri media di laboratorio standard, come TSB o BHI, non sono adatti per la trasformazione 2, 13. </li><li> Crescere i batteri a 37 ° C con agitazione (180 rpm) fino alla fine fase esponenziale (circa 8 ore). </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C). </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di terreno fresco CS2. </li><li> Aggiungere 10 mg di plasmide purificato o DNA genoma (fase 3.1.4) alla sospensione cellulare. Agitare a 37 ° C e 180 rpm per 2,5 ore. NOTA: i tempi di incubazione più brevi con il DNA (&lt;2,5 hr) provocare trasf bassafrequenze ormazione. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C). </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di terreno BHI. Mescolare la sospensione cellulare con 90 ml di agar fuso BHI (55 ° C) supplemento con 32 mg / L cloramfenicolo (o 5 mg / L di tetraciclina nel esperimento di controllo). Versare il composto in piatti di 90 mm di Petri. Rapidamente fresco e lasciare che l&#39;agar solidificare. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per 2 giorni. </li><li> Replicare colonie generati (trasformanti) trasferendo le colonie (utilizzando stuzzicadenti) alle nuove piastre di agar BHI contenenti antibiotici appropriati per confermare le loro caratteristiche di resistenza. Confermare il gene di resistenza acquisita (cfr o tetM) dalla colonia PCR 7. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+variation+and+evolution+of+Staphylococcus+aureus.">Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus.</a> IJMM. 300, 98-103 (2010).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+cryptic+secondary+sigma+factor+gene+unveils+natural+competence+for+DNA+transformation+in+Staphylococcus+aureus.">Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).</li><li>Caryl, J. A., O'Neill, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+nucleotide+sequence+of+pGO1,+the+prototype+conjugative+plasmid+from+the+Staphylococci.">Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci.</a> Plasmid. 62, 35-38 (2009).</li><li>Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phage-related+chromosomal+islands+of+Gram-positive+bacteria.">The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).</li><li>Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanotubes+mediate+bacterial+communication.">Intercellular nanotubes mediate bacterial communication.</a> Cell. 144, 590-600 (2011).</li><li>Dubey, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+Characteristics+of+Bacterial+Nanotubes.">Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes.</a> Dev cell. 36, 453-461 (2016).</li><li>Cafini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transmission+of+the+cfr+gene+to+MRSA+and+Enterococcus:+role+of+Staphylococcus+epidermidis+as+a+reservoir+and+alternative+pathway+for+the+spread+of+linezolid+resistance.">Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance.</a> J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).</li><li>Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillinase+production+and+intrinsic+resistance+to+penicillins+in+Staphylococcus+aures.">Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures.</a> Lancet. 1, 835-838 (1966).</li><li>Kuroda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+of+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Lancet. 357, 1225-1240 (2001).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA.">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322, 1843-1845 (2008).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).</li><li>Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+DNA+transfer+efficiency+by+temporary+inactivation+of+host+restriction.">Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction.</a> BioTechniques. 26, 892-894 (1999).</li><li>Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-affecting+antibiotics+modulate+natural+transformation+in+SigH-expressing+Staphylococcus+aureus.">Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus.</a> J. Antibiot. , (2015).</li><li>Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cfr+rRNA+methyltransferase+confers+resistance+to+Phenicols,+Lincosamides,+Oxazolidinones,+Pleuromutilins,+and+Streptogramin+A+antibiotics.">The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction-modification+system+differences+in+Helicobacter+pylori+are+a+barrier+to+interstrain+plasmid+transfer.">Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer.</a> Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).</li><li>Evans, B. A., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+variation+in+transformation+frequency+in+Streptococcus+pneumoniae.">Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae.</a> ISME J. 7, 791-799 (2013).</li><li>Wilson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+natural+transformation+frequency+of+Campylobacter+jejuni+in+liquid+shake+culture.">Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture.</a> Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).</li><li>McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+temperate+bacteriophage:+carriage+and+horizontal+gene+transfer+is+lineage+associated.">Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).</li><li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genomics+and+the+impact+of+horizontal+gene+transfer.">Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer.</a> IJMM. 304, 103-109 (2014).</li><li>Uchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragenus+generalized+transduction+in+Staphylococcus+spp.+by+a+novel+giant+phage.">Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage.</a> ISME J. 8, 1949-1952 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Questo lavoro descrive i tre metodi principali per studiare la HGT di determinanti genetici di S. aureus. Anche se trasduzione e coniugazione sono stati studiati per decenni, l&#39;esistenza di trasformazione naturale è stata solo di recente riconosciuta 2. Così, S. aureus è dotato di tutti i tre principali modalità di HGT, e testare tutti loro è necessario per chiarire le possibili vie di diffusione dei determinanti genetici. Lo scopo di questo lavoro è quello di co...

Staphylococcus aureus è un batterio Gram-positivi commensale che abita naturalmente la cavità nasale e la pelle degli esseri umani e degli animali. Questa specie batterica è la principale causa di infezioni nosocomiali negli ospedali e case di cura. Inoltre, la sua capacità di sviluppare resistenza a diversi composti antimicrobici ha reso la gestione delle infezioni causate da questo batterio in un problema globale. Due vie principali coinvolti nella diffusione di fenotipi di resistenza sono noti: la diffusione clonale di genotipi resistenti e la diffusione dei determinanti genetici tra la piscina batterica. Nel caso di S. aureus, diversi geni di resistenza agli antibiotici (così come determinanti di virulenza) sono stati trovati per essere associate a elementi genetici mobili (MGEs) 1. La presenza di questi elementi nel genoma di S. aureus indica che l&#39;acquisizione e il trasferimento di genmateriale etico all&#39;interno della popolazione batterica potrebbe svolgere un ruolo importante per S. aureus l&#39;adattamento e l&#39;evoluzione. Il materiale genetico può essere scambiato attraverso tre meccanismi ben noti di HGT nei batteri Gram-positivi: trasformazione, coniugazione, e fago trasduzione. La trasformazione comporta l&#39;assorbimento del DNA libero. Per acquisire DNA estraneo, le cellule batteriche devono sviluppare una speciale fase fisiologica: la fase di competenza. Quando viene raggiunto questo stadio, le cellule competenti sono in grado di trasportare DNA nel citoplasma, acquisire nuovi determinanti genetici. Nel caso di S. aureus, l&#39;esistenza di trasformazione naturale è stato recentemente dimostrato 2. In linea con questo, il nostro gruppo ha messo in luce l&#39;importanza dell&#39;espressione del fattore Sigh (un criptico trascrizione secondario fattore sigma) in fase di competenze di sviluppo e su come la sua espressione costitutiva rende S. aureus in grado di reaching la fase di competenza, che consente l&#39;acquisizione di fenotipi resistenti da trasformazione naturale 2. La coniugazione è un processo che comporta la trasmissione di DNA da una cellula vivente (donatore) ad un altro (ricevente). Entrambe le cellule devono essere a contatto diretto, permettendo il DNA da scambiare essendo protetto da strutture speciali, come tubi o pori. Il trasferimento di DNA da questo metodo richiede la macchina conjugative. In S. aureus, il plasmide prototipo conjugative è PGO1, che ospita il conjugative operone Traa 3. Phage trasduzione comporta il trasferimento di DNA da cellula a cellula attraverso l&#39;infezione batteriofago ed implica il confezionamento di DNA batterico, invece di DNA virale, nel capside fagico. La maggior parte degli isolati di S. aureus sono lysogenized dai batteriofagi 1. Al condizioni di stress, profagi possono essere asportati dal genom battericaee passaggio al ciclo litico. Questi sono i tre meccanismi ben noti per la trasmissione DNA in S. aureus. Ci sono alcuni meccanismi di trasferimento aggiuntivi, come &quot;pseudo-trasformazione&quot; 2 e sistemi fago come nel trasferimento delle isole di patogenicità 4. Recentemente, un gruppo riferito che &quot;nanotubi&quot; sono coinvolte nel trasferimento di materiali cellulari (compreso il DNA plasmidico) tra cellule adiacenti 5, 6, ma un studio di follow-up non è apparsa altri gruppi finora. Questo lavoro fornisce la metodologia necessario studiare HGT in S. aureus affrontando le tre principali vie di trasferimento: coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale. I risultati ottenuti con queste metodologie sono stati usati per studiare la trasmissione del gene cfr (cloramfenicolo / resistenza Florfenicolo) traS. aureus ceppi 7. Queste tre tecniche sono strumenti versatili per l&#39;indagine della trasmissione MGE in S. aureus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="737">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Becton Dickinson&#160;</td>
			<td style="width:121px;">211825</td>
			<td style="width:116px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutrient Broth No. 2</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep blood agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co.,Ltd.</td>
			<td>E-MR96</td>
			<td>Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar powder</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>010-08725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulose Ester Gridded 0.45 &#956;L HAWG filter</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>HAWG 02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAfilter Plasmid Midi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the study of horizontal gene transfer in staphylococcus aureus

Una caratteristica importante dei principali patogeni umani opportunista Staphylococcus aureus è la sua straordinaria capacità di acquisire rapidamente la resistenza agli antibiotici. Studi di genomica rivelano che S. aureus porta molti geni di virulenza e di resistenza si trovano in elementi genetici mobili, suggerendo che il trasferimento genico orizzontale (HGT) svolge un ruolo critico in S. aureus evoluzione. Tuttavia, una descrizione completa e dettagliata della metodologia utilizzata per lo studio HGT in S. aureus è ancora carente, soprattutto per quanto riguarda la trasformazione naturale, che è stato recentemente riportato in questo batterio. Questo lavoro descrive tre protocolli che sono utili per le indagini in vitro di HGT in S. aureus: coniugazione, trasduzione dei fagi, e trasformazione naturale. A questo scopo, il gene CFR (cloramfenicolo / resistenza florfenicolo), che conferisce le fenicoli, Lincosamidi, oxazolidinoni, pleuromutiline, e streptogramine A (PhLOPSA) -Resistenza fenotipo, è stato utilizzato. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali S. aureus trasferisce materiale genetico ad altri ceppi è essenziale per comprendere la rapida acquisizione di resistenza e aiuta a chiarire le modalità di diffusione riportati in programmi di sorveglianza o per prevedere ulteriormente la modalità di diffusione in futuro.

I risultati qui rappresentati sono stati precedentemente pubblicati (adattato da riferimento 7 con il permesso dell&#39;editore). Abbiamo studiato le possibili vie di trasmissione del gene cfr, che provoca la resistenza linezolid basso livello e l&#39;espressione del PhLOPSA resistenza fenotipo 14, 15 in ceppi di S. aureus, analizzando tre meccanismi di HGT. <p class="jove_content" fo...

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus at JoVE.com

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus.

Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

methodology-for-study-horizontal-gene-transfer-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

16.4K Views.  University of Tsukuba.  Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus. 

Video: Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

L&#39;uso del flusso gocciolamento e Reattori disco rotante per Staphylococcus aureus Analisi Biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

Sottocutaneo infezione di Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

Endocardite modello sperimentale di meticillino resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

La genotipizzazione di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Per ribosomiale Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...