This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

NOTA: As estirpes e os materiais utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 1 e a Tabela de Materiais, respectivamente. Nos experimentos de transmissão, N315 e COL cfr derivados -positivas foram usados como doadores do gene cfr (N315-45 e COL-45). Estas estirpes foram anteriormente obtidos por conjugação, utilizando como doador de um CFR clínica -positivo estirpe de Staphylococcus epidermidis (ST2), seguindo o protocolo padrão de conjugação (ver abaixo). Esta estirpe abrigavam o gene cfr em um plasmídeo pSCFS7-like 7. 1. Conjugação Usando o método de filtro de acasalamento NOTA: Uma estirpe de S. aureus que transporta o gene N315 CFR (N315-45) 7 (cm R) foi utilizado como o doador. COL 8 ou 9 MU50 estirpes (Tet R, S Cm) foram utilizados como os destinatários. Duplo-As colónias resistentes a (Tet R, CM R) capazes de crescer na presença de 32 mg / L de cloranfenicol e de 8 mg / L de tetraciclina foram considerados como transconjugantes putativos e foram analisados para determinar a presença de CFR por PCR de colónia e para determinar o perfil de suscetibilidade destinatário. <ol><li> Realizar conjugação seguindo um protocolo previamente descrito 10 com algumas modificações: <ol><li> Prepare 5 ml de cultura de uma noite do doador e do receptor em meio de tripticase de caldo de soja (TSB) (com e sem 32 mg / L de cloranfenicol, respectivamente), com agitação a 37 ° C. </li><li> Ajustar a densidade óptica (OD 600) de as culturas durante a noite a 1 (OD 600 = 1,0) usando meio TSB fresco. Misturar 0,5 ml da cultura dadora (N315-45) com 0,5 ml da cultura de receptor (COL ou MU50). Adicionar 1 mL de PBS à mistura. </li><li> Transferir a mistura de bactérias para uma USI membrana de filtro de 0,45 umng um sistema de bomba de vácuo. </li><li> Coloque as membranas de filtro em uma placa ovelhas agar sangue. Incubar a 37 ° C durante 1 dia. NOTA: Nesta etapa, o meio enriquecido é necessário para permitir o crescimento das células duplamente resistentes. </li><li> Retire o filtro de membrana da placa e suspender em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Vortex bem para recolher todas as bactérias aderidas sobre a membrana. </li><li> Fazer uma diluição de 10 vezes em série da suspensão bacteriana por meio TSB fresco. Placa de 100 ul das amostras diluídas 0-10 -4 TSB em agar (placas TSA) suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol e 8 mg / L de tetraciclina para a selecção de transconjugantes. Placa de 100 ul da suspensão diluída (10 -5 -10 -6) em placas de TSA com 8 mg / l de tetraciclina sozinha para contar o número total de receptores. Incubar as placas a 37 ° C durante 18-24 h. </li><li> Analise colónias duplamente resistentes (transconjugantes putativos) para a presença do CFgene r pela colônia PCR 7 e seus perfis de susceptibilidade (antibiograma). </li><li> Determinar o antibiograma, medindo as concentrações inibidoras mínimas (MICs) de antibióticos apropriados de acordo com o método de microdiluição de difusão em disco ou método padrão 11. O perfil de sensibilidade dos transconjugantes deve ser idêntico ao receptor, excepto para o cloranfenicol (e outros compostos afectadas pelo gene CFR). Esta determinação é essencial para afastar resistência à tetraciclina desenvolvido pela estirpe doador. </li></ol></li></ol> 2. Fago Transdução NOTA: O bacteriófago MR83a pertencente ao (do laboratório) Siphoviridae família foi utilizado nas experiências de transdução. N315-45 foi usado como dador de CFR para a infecção por fagos. N315, COL, ou MU50 estirpes foram utilizados como receptores. A aquisição de CFR foi determinada pela abdegra da estirpe receptora de crescer na presença de 32 mg / L de cloranfenicol. Colónias que crescem sob esta condição foram analisados para determinar a presença de cfr (por colônia PCR) e determinar o perfil de sensibilidade para descartar a contaminação potencial. <ol><li> Amplificação do fago no doador <ol><li> Prepara-se uma cultura durante a noite de N315-45 em 5 ml de caldo nutriente suplementado com 3,6 mM de Ca 2+ (NBCaCl 2) a 37 ° C com agitação (180 rpm). NOTA: O cálcio é necessário para a infecção por fagos. Veja a Tabela de Materiais. Nutrient caldo de outras empresas podem ter problemas, tais como a precipitação de cálcio. </li><li> Prepare subculturas diluindo cultura durante a noite a 1: 1000 em um volume final de 10 mL de NBCaCl 2 em 50 ml de frascos de vidro ou frascos de vidro. Deixar crescer as bactérias durante 1 hora a 37 ° C com agitação (180 rpm). </li><li> Preparar uma série de MR83a fago diluído em NBCaCl 2 mediUM (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5, -6 e 10). Adicionar 20 ul de fago diluído na cultura bacteriana. Também se preparar uma cultura de controlo sem infecção por fagos, que serve como o controlo positivo para o crescimento da célula bacteriana e pode ser utilizado para determinar o título de fagos no dia seguinte. </li><li> Deixar crescer as culturas a 37 ° C com agitação suave (100 rpm) durante a noite. NOTA: As células irão crescer até certo ponto quando o fago infectando não está em excesso; em seguida, eles vão entrar em fase de lise devido à amplificação do fago através do ciclo lítico. A cultura sem fago vai mostrar o pleno crescimento, enquanto culturas com fago irá mostrar taxas distintas de transparência. </li><li> Seleccionar um ou dois frascos de cultura limpo com a maior diluição de fago adicionado. </li><li> Transferir as culturas em 15 ml de tubos de centrífuga. Adicionar 250 mL de clorofórmio e misture bem, invertendo os tubos. </li><li> Centrifugar os tubos a 5000 <em&gt; xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Transfira os sobrenadantes para tubos frescos e armazená-las a 4 ° C até à sua utilização. NOTA: O fago é estável durante pelo menos alguns meses, mas o armazenamento a preparação de fagos para muito tempo reduz o título de transdução e eficiência. </li></ol></li><li> Medição do título de fagos (ensaio de placas de fago) <ol><li> Prepare ágar caldo nutriente (1,5% de agar) meio; mantê-lo aquecido em banho-maria a 55 ° C. Adicionar autoclavada M solução de CaCl 2 de 0,5 para o meio a uma concentração final de 3,6 mM. Derramá-la em 90 mm placas de Petri (NBCaCl 2 placas). </li><li> Prepara-se uma cultura durante a noite de N315 em 5 ml de NBCaCl 2 a 37 ° C com agitação; este pode ser substituído com a cultura de controlo descrito acima (passo 2.1.3). </li><li> Adicionar 10 ul da cultura durante a noite em 200 ul de NBCaCl 2 e espalhar uniformemente na placa NBCaCl 2. Pare a difusão quando a superfície dea placa é coberta com líquido. Deixe a placa seca. </li><li> Faça uma diluição de 1:10 de série (de 10 -5 -10 -10) de fago previamente preparado (passo 2.1.8) usando NBCaCl 2 médio. </li><li> Mancha 3 ul de cada diluição de fago para a placa coberta com bactérias. </li><li> Incubar a placa durante a noite a 30 ° C. </li><li> Contar o número de placas e calcular o título de fagos utilizando a seguinte equação: unidade formadora de placas (pfu) / ml = número de placas x factor de diluição / volume manchado (3 x 10 -3 ml) </li></ol></li><li> transdução do fago NOTA: O conjunto de fagos foi preparada na etapa anterior (2.1.8) é utilizado para testar a transdução do gene CFR nas estirpes de S. aureus. Nesta experiência, as estirpes N315, COL, ou MU50 são utilizados como os destinatários. <ol><li> Preparar a cultura durante a noite de N315, COL, ou MU50 em 5 ml de NBCaCl 2 a 37 ° C com agitação (180 rpm). </li><li> diluir tele fago NBCaCl 2 a ~ 10 9 pfu / ml. </li><li> Num frasco de vidro de 50 mL, misturar 500 ul da cultura durante a noite, a 500 ul de fresco NBCaCl 2, e 1 ml de fagos (~ 10 9 pfu / ml); a multiplicidade esperado de infecção (MOI) não deve ser superior a 1. Incubar a mistura a 37 ° C com agitação suave (100 rpm) durante 30 min. NOTA: O tratamento térmico das células receptoras apenas antes da adição do fago (52 ° C durante 2 minutos para inactivar as enzimas de restrição endógenos) podem aumentar a eficiência de 12. </li><li> Adicionar 50 ul de 20% de Na 3 -citrato. Continue a agitação suave durante 30 min a 37 ° C. NOTA: Na 3 -citrato actua como um quelante de cálcio moderada. </li><li> Prepare de agar (agar 1,5%) forma derretida de infusão cérebro-coração (BHI) e mantê-lo em um banho de água a 55 ° C. </li><li> Transferir a mistura de fago-bactéria para um balão de 100 ml, adicionar 50 ml de ágar de BHI quente suplementado com 32 mg / L chloramphenicol, e misture bem. Despeje a mistura em pratos de Petri de 90 mm. NOTA: Este método permite a detecção de um pequeno número de colónias em crescimento (transdutantes putativos). </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 24-48 hr. </li><li> Além disso testar as colónias geradas (transdutantes) para resistência através da transferência das colónias para novas placas de agar de BHI suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol. Confirmar a presença do gene por PCR de colónias CFR 7. </li></ol></li></ol> 3. Transformação Natural NOTA: O ensaio de transformação natural em S. aureus foi realizada seguindo o método descrito em nosso estudo prévio 2. O derivado de N315, N2-2.1 2, 7, foi utilizado como o destinatário. Nesta estirpe, o locus suspiro foi duplicado, de modo a constitutivamente suspiro Express 2. para detprocedimentos afligia sobre como isolar variantes de competência expressa suspiro, consulte a descrição anterior 2. Se o marcador de resistência a ser transferida não é cloranfenicol, pRIT-suspiro (cm R) podem ser utilizados para expressar suspiro, como descrito anteriormente 2. O plasmídeo purificado ou extracto de ADN inteiro de CFR adquiridas em S. aureus COL-7 45 é utilizado como o doador de ADN para a transformação. <ol><li> Preparação de DNA dadora <ol><li> Cultivar COL-45 durante a noite com agitação a 37 ° C num balão de 300 ml contendo 50 ml de TSB suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol. Cultura E. coli HST04 pHY300 transportando plasmídeo (TetR) para extrair o plasmídeo para a experiência de controlo. NOTA: HST04 (dam - / DCM -) não possui o DNA metilase 13 genes. Outras estirpes convencionais com metilases de ADN também pode ser usadod para preparar o ADN dador, porque o estado de metilação de ADN não afecta a eficácia de transformação. Alternativamente, pT181 plasmídeo purificado a partir da estirpe de S. aureus COL, também pode ser utilizado como um controlo positivo para o ensaio de transformação 2. </li><li> Recolher as células por centrifugação (8000 xg durante 10 min a 4 ° C). </li><li> Extrair os plasmídeos utilizando um kit de extracção de ADN plasmídeo ou um método de purificação convencional para purificar ADN todo o ADN. </li><li> Quantificar o ADN purificado por espectrómetro e mantê-lo a 4 ° C até à sua utilização. NOTA: Usar uma preparação de ADN fresco para o ensaio de transformação, normalmente menos de uma semana de idade. preparações de ADN de idade reduzir a eficiência da transformação. </li></ol></li><li> ensaio de transformação <ol><li> Cultura da célula receptora (N2-2.1) durante a noite em 5 ml de TSB a 37 ° C com agitação. </li><li> Transferir 0,5 mL da cultura durante a noite em um tubo de 1,5 ml. Precipilitar as células por centrifugação (10000 xg durante 1 min a 4 ° C). </li><li> Suspender as células com 10 ml de meio de CS2 em um tubo de 50 ml. NOTA: medium CS2 é um meio sintético completo que induz a competência para a transformação natural em S. aureus 2 (ver a composição do meio na tabela de Material). Outros meios convencionais de laboratório, tais como TSB ou BHI, não são adequados para a transformação de 2, 13. </li><li> Deixar crescer as bactérias a 37 ° C com agitação (180 rpm) até à fase exponencial tardia (cerca de 8 h). </li><li> Colher as células por centrifugação (5000 xg durante 5 min a 4 ° C). </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de meio fresco CS2. </li><li> Adiciona-se 10 ug de plasmídeo purificado de ADN ou genoma (passo 3.1.4) para a suspensão de células. Agitar a 37 ° C e 180 rpm durante 2,5 h. NOTA: Os tempos mais curtos de incubação com DNA (&lt;2,5 hr) resultar em menor transffrequências ormação. </li><li> Recolher as células por centrifugação (5000 xg durante 5 min a 4 ° C). </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de meio BHI. Misture a suspensão de células com 90 ml de ágar de BHI fundido (55 ° C) com suplemento de 32 mg / L de cloranfenicol (ou 5 mg / L de tetraciclina na experiência de controlo). Despeje a mistura em pratos de Petri de 90 mm. Rapidamente legal e deixar o agar solidificar. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante 2 dias. </li><li> Replicar colônias gerados (transformantes), transferindo as colónias (usando palitos) para novas placas de agar BHI contendo os antibióticos apropriados para confirmar as suas características de resistência. Confirmar o gene de resistência adquirida (cfr ou tetM) pela colônia PCR 7. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

<html> Este trabalho descreve os três métodos principais para estudar a HGT de determinantes genéticos em S. aureus. Apesar de transdução e conjugação têm sido estudados há décadas, a existência de transformação natural só recentemente foi reconhecida 2. Assim, S. aureus é equipado com todos os três principais modos de HGT, e testar todos eles é necessária para esclarecer as possíveis vias de disseminação de determinantes genéticos. O objetivo deste trabalho...

Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva comensais que habita naturalmente na pele e cavidade nasal do ser humano e animais. Esta espécie bacteriana é a principal causa de infecções nosocomiais em hospitais e estabelecimentos de cuidados. Além disso, a sua capacidade de desenvolver resistência a diferentes compostos antimicrobianos fez a gestão das infecções causadas por esta bactéria em uma preocupação mundial. Duas principais vias envolvidas na divulgação de fenótipos de resistência são conhecidos: a disseminação clonal de genótipos resistentes e de difusão dos determinantes genéticos entre a piscina bacteriana. No caso de S. aureus, diferentes genes de resistência a antibióticos (bem como determinantes de virulência) foram encontrados para ser associado com elementos genéticos móveis (EGM) 1. A presença destes elementos no genoma de S. aureus indica que a aquisição e a transferência de genmaterial de etic dentro da população bacteriana poderia desempenhar um papel importante para a adaptação de S. aureus e evolução. O material genético pode ser trocada através de três mecanismos bem conhecidos de HGT em bactérias Gram-positivas: transformação, conjugação e transdução do fago. Transformação envolve a absorção de DNA livre. Para adquirir DNA estranho, as células bacterianas precisam desenvolver uma fase fisiológicas especiais: a fase de competência. Quando este estado for atingido, as células competentes são capazes de transportar o DNA para o citoplasma, a aquisição de novos determinantes genéticos. No caso de S. aureus, a existência de transformação natural foi recentemente demonstrado 2. Em consonância com isso, o nosso grupo tem lançar luz sobre a relevância da expressão do fator de suspiro (um fator sigma de transcrição secundária enigmática) na fase de competência do desenvolvimento e sobre a forma como a sua expressão constitutiva torna S. aureus capaz de reaching o estágio de competência, o que permite a aquisição de fenótipos resistentes pela transformação natural 2. A conjugação é um processo que envolve a transmissão de ADN a partir de uma célula viva (dador) para um outro (receptor). Ambas as células devem estar em contacto directo, permitindo que o ADN a ser trocados enquanto está a ser protegida por estruturas especiais, tais como tubos ou poros. A transferência de ADN por este método requer a maquinaria conjugativo. Em S. aureus, o plasmídeo protótipo conjugada é PGO1, que abriga o operon TRAA conjugada 3. O fago de transdução envolve a transferência de DNA a partir de uma célula para outra por meio da infecção de bacteriófago e implica a embalagem de ADN bacteriana, em vez do ADN virai, na cápside do fago. A maioria dos isolados de S. aureus são lysogenized por bacteriófagos 1. Após a condições de stress, profagos pode ser excisado do genom bacterianae e mudança para o ciclo lítico. Estes são os três mecanismos bem conhecidos para a transmissão do ADN em S. aureus. Existem alguns mecanismos de transferência adicionais, tais como &quot;pseudo-transformação&quot; e dois sistemas de fagos como na transferência de ilhas de patogenicidade 4. Recentemente, um grupo relatou que &quot;nanotubos&quot; estão envolvidos na transferência de materiais celulares (incluindo ADN de plasmídeo) entre células vizinhas 5, 6, mas um estudo de seguimento não apareceu a partir de outros grupos de medida. Este trabalho apresenta a metodologia necessária para estudar HGT em S. aureus, abordando as três principais vias de transferência de conjugação, a transdução e transformação natural. Os resultados obtidos com estas metodologias foram usadas para estudar a transmissão do gene CFR (cloranfenicol / resistência florfenicol) entreS. aureus 7. Estas três técnicas são ferramentas versáteis para a investigação de transmissão MGE em S. aureus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="737">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Becton Dickinson&#160;</td>
			<td style="width:121px;">211825</td>
			<td style="width:116px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutrient Broth No. 2</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep blood agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co.,Ltd.</td>
			<td>E-MR96</td>
			<td>Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar powder</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>010-08725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulose Ester Gridded 0.45 &#956;L HAWG filter</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>HAWG 02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAfilter Plasmid Midi kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the study of horizontal gene transfer in staphylococcus aureus

Uma característica importante do grande agente patogénico humano oportunista Staphylococcus aureus é a sua capacidade extraordinária para adquirir rapidamente resistência a antibióticos. Estudos genómicos revelam que o S. aureus transporta muitos genes de virulência e resistência localizadas em elementos genéticos celulares, sugerindo que a transferência genética horizontal (HGT) desempenha um papel crítico na evolução S. aureus. No entanto, uma descrição completa e detalhada da metodologia utilizada para estudar HGT em S. aureus ainda está em falta, especialmente em relação transformação natural, que foi recentemente relatada nesta bactéria. Este trabalho descreve três protocolos que são úteis para a investigação in vitro de HGT em S. aureus conjugação, a transdução do fago, e transformação natural. Para este objectivo, o gene cfr (cloranfenicol / resistência florfenicol), que confere as fenicóis, Lincosamidas, Oxazolidinonas, pleuromutilinas, e estreptogramina A (PhLOPSA) -resistência fenótipo, foi usado. Compreender os mecanismos através dos quais S. aureus transfere material genético para outras estirpes é essencial para compreender a rápida aquisição de resistência e ajuda a esclarecer os modos de difusão relatados em programas de vigilância ou de prever ainda mais o modo de propagação no futuro.

Os resultados aqui representadas foram previamente publicados (adaptado da referência 7 com a permissão do editor). Foram estudados os potenciais vias de transmissão do gene CFR, o que faz com baixo nível de resistência de linezolida e a expressão do fenótipo de resistência PhLOPSA-14, 15 em estirpes de S. aureus, investigando três mecanismos de HGT. <p class="jove_content" f...

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Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.

Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

methodology-for-study-horizontal-gene-transfer-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

16.4K visualizações.  University of Tsukuba.  Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus. 

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The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Imunologia e Infecção

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

Modelo Experimental de Endocardite resistente à meticilina<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) em Rato

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Estudo das interacções de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...