我々は、この原稿の重要な読書のための婦人科腫瘍学グループのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、部分的には国立保健医療研究評議会、オーストラリア研究評議会、および癌研究所NSW（PST）からの資金提供によってサポートされています。 MKは、ニューカッスル大学院研究員の大学の受取人です。

動物のケアおよび実験手順は、ニューサウスウェールズ州の動物研究法、ニューサウスウェールズ州動物実験規制、およびケアのためのオーストラリアのコードとにニューカッスル大学の動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、確認されました科学的な目的のための動物の使用。マウスに着手すべての手順は、ニューカッスル大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。 1.タイム交尾<ol><li>ペア6から8週齢の雄と昼光サイクルの終了直前に雌マウス。 </li><li>毎日、（8.00 AM日以前に）早朝膣栓の存在のために、女性を確認してください。プラグの日は0.5 DPCとして考えられています。 </li><li> （オスなし）新しいケージに膣栓の女性を移し、プラグの日付にラベルを付けます。 </li></ol>マウス胚性生殖隆起の2の単離<ol><li>マウスembryonを分離以下に説明するように、いくつかの修正を加えて、9で説明したように15.5 DPC妊娠女性からIC生殖隆起。 </li><li>妊婦が午後による妊娠の次の日に入ると考えられている時のように正午前に解剖を行っています。 </li><li>頸椎脱臼（または施設の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って）を使用して15.5 DPC妊婦を生け贄に捧げます。 </li><li>吸収性のティッシュペーパーにその背中の上でマウスを維持し、70％エタノールで腹部の腹側をスプレー。 </li><li>鉗子で下腹部の皮膚（腹側）を持ち上げ、手術用はさみを使用して横方向の切開を行い、胸郭の端に泌尿生殖器の開口部から延びます。腹部を露出するように、動物の頭部に向けて肌を引き出します。 </li><li>腹膜腔を公開するために手術用ハサミで腹部の筋肉をカットします。ちょうど子宮頸部上記鉗子で妊娠子宮を取得し、カットをします。今トンに保持することによって子宮を持ち上げます膀胱o及び腹膜アタッチメントから子宮を分離するために子宮卵管接合部でのカットに続いて子宮広間膜をカット。 </li><li>氷冷HBSS（ハンクス液）を含む50 mLのチューブに子宮を転送します。過剰な血液を除去するために、氷冷HBSSで優しく妊娠子宮を洗ってください。 </li><li>氷冷HBSSを含むペトリ皿に子宮を維持し、氷上に置きます。子宮壁を切り取り、胚を取り出します。氷上でHBSS新鮮なペトリ皿に胚を保管してください。 </li><li>きれいな滅菌ティッシュペーパーを取り、新しいペトリ皿の上に置きます。ティッシュペーパーで70％エタノールをスプレー。側面でこのティッシュペーパーで胚を維持し、 図1に点線で示すように方向に滅菌ブレードを使用して、下腹部からそれをカット。 </li><li>脊柱を固定することによって、滅菌スポンジベースで胚を修正しました。 </li><li>解剖実体顕微鏡下でそれを置き、慎重に腹側正中線に沿って切断。肝臓と腸を削除します。マウス泌尿生殖器系（腎臓、尿管、精巣、WD、および輸精管）が表示されるようになるはずです。 </li><li>精巣およびWDを切り取り、そして氷上で、HBSSで新鮮なペトリ皿に保管。 WDおよび精巣を取り出し、尿道への取り付けに近い輸精管を切断し、導帯からWDの下部の添付ファイルをカット。 </li><li> （これは実験計画に従って変更される場合があります）同じグループの胚からの精巣およびWDSをプール。 </li></ol>胚性生殖隆起の3.文化（図2） <ol><li> 10％FBS（ウシ胎児血清）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含むDMEM / F12を補うことにより、胚生殖隆起を培養するための培地を調製します。水浴中で37°Cにメディアを温めます。 </li><li> 24ウェル細胞培養プレートのウェルあたり培地300μLを加えます。 </li><li>新鮮なペトリ皿を取り、その上に無菌HBSSの小滴を置きます。ポリカーボネートトラックエッチメンブレン（0.8を入れて81;メートル）HBSSに面した輝く表面とのHBSSこのドロップに。 </li><li>きれいな鉗子を使用すると、（上向きにし、その粗面に）膜上の2つのWDSおよび生殖腺を入れて、滅菌ワイプ/吸収紙を使用して、HBSSの最大量を削除します。吸収紙で組織に触れないでください。そうでなければ、それは、組織を損傷します。 </li><li> WDSも生殖腺いずれも互いに接触していることを確認してください。そうでなければ、彼らはその後のインキュベーション中に一緒に固執します。 </li><li>空気 - 媒体インターフェースで300μLの培地と文化それらを含む24ウェルプレートのウェルに組織を有する膜を転送します。 WDSの嚢胞成長の膜の結果にあまりにも多くの培地。 </li><li> 5％CO 2の存在下で、37℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートします。 </li><li>毎日培地を変更します。ピペットで培地を変更するには、第1ウェルから培地を除去した後、予め温め新鮮な培地300μLを追加します。 注意：WDの形態形成の異なるシグナル伝達経路の効果を研究するために、必要な濃度での化学的活性化および/または阻害剤を培地に添加することができます。 </li><li> 3日間培養組織。 3日以内に、15.5 DPCの胚から収集巻かWDSは非常に入り組んチューブ（ 図3B）に変身します。 Wntシグナル阻害剤、IWR1の添加は、巻きWD（ 図3C）の阻害をもたらします。 </li><li>これらの組織を採取するために、氷冷PBSでペトリ皿を取ります。ペトリプレートに培養生殖腺およびWDを有する膜を転送します。膜をPBSに浮遊します。 PBSでそれをシンクし、生殖腺およびWDを取り出すために、膜を押します。 </li><li> 4℃または室温で1時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）、O / Nで組織を固定してください。必要に応じて、固定する前に、WDSの明視野像を取ります。 </li></ol> 4.ホールマウント免疫蛍光<ol><li>洗浄固定組織をPBS-T（PBS + 1％で3回RTでゆっくりと揺らし、10分ごと、とのトリトンX-100）。 </li><li>ゆっくり揺り動かし（〜30回転）で、4℃で、段階的エタノールシリーズ（25％、50％、75％及び100％）、10分毎に組織を脱水。このステップでは、組織を75％エタノール中で4℃で保存することができます。 <ol><li>エタノールを変更するには、2分間邪魔されずに組織を維持し、組織が落ち着くしましょう。できるだけ多くの上清を取り出した後、エタノールの次に高い濃度を追加します。組織への損傷を避けるために、ピペットチップは、いずれかの段階で組織に触れないようにしてください。 </li></ol></li><li>脱水後、ゆっくり揺り動かしながら4℃で、エタノール（100％、75％、50％及び25％）、10分毎に段階的に直列に組織を再水和します。 </li><li> PBS-T（PBS + 0.1％トリトンX-100）を用いて組織を洗浄し、4倍、20分毎に、室温で、穏やかで（約30 rpm）をロッキング。 </li><li>ブロッキング緩衝液を用いて室温で1時間、組織ブロック（PBS + 1％BSA + 0.2％脱脂粉乳粉末+ 0.3％トリトンX-100）。 </li><li> AFTERブロッキング、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）一次抗体溶液に組織を転送し、穏やかなロッキング（〜30 rpm）で4℃でO / Nインキュベートします。用いた一次抗体の希釈液は、 材料表に記載されています。 </li><li>次の日は、穏やかなロッキング（〜30回転）で、室温でPBS-MT（PBS + 2％脱脂粉乳+ 0.5％のTween-20）、4倍、30分ごと、で組織を洗います。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で（このステップは個々の抗体の最適化を必要とする）250と緩やかに揺り動かしながら、室温で1時間インキュベート：この洗浄工程に続いて、1の希釈で二次抗体を追加します。 </li><li>今年以降、二次抗体は、感光性蛍光体で標識されているように、光への暴露を防止するために、アルミホイルで覆われた組織を維持します。 </li><li>組織は緩やかに揺り動かしながら、PBS-T（PBS + 0.1％のTween-20）、30分ごとに3倍洗います。 </li><li>染色された組織を取り付けるためのスライドを準備します。 <ol><li>このために、ガラスカバースリップをカットダイヤモンドペンを用いて、薄いストリップに2つのストリップネイルエナメルを使用して、スライドガラス上の他の上の1つを貼り付けます。 2つの境界を作成し、これら2つの境界の間に組織を配置します。 </li><li> DAPIを含む封入剤を追加し、カバースリップ上に置きます。スライドにそれを修正するためにカバースリップの隅にネイルエナメルを適用します。 注：組織は現在、イメージングのための準備が整いました。 -20℃でこれらのスライドを保管してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

器官培養系は、伝統的な細胞培養系に比べて多くの利点を有します。このシステムは、異なる細胞型の間の元の構造関係と相互作用を保持します。これは、 インビボ系で模倣し、ニッチな要因が存在しない細胞培養研究よりも正確な情報を提供します。器官培養系の使用は、さらに、動物全体を用いて上の利点を有します。これらは、全身がすることができない動物全体を使用...

男性生殖器系は、主に精巣から成る、生殖細胞の発達および分化、および精子の成熟、輸送、および保管のために必要とされる複雑な管システムのためのサイト。精巣上体は、輸精管と精巣および生殖細胞1の後の精巣発達と成熟に主に関与を接続する管状の器官です。高度にコイル状の成体マウスの精巣上体は、シンプルでストレート前駆体管、ウォルフ管（WD）1から開発しています。精子が雌性の生殖細胞2を受精する能力を獲得するための精巣上体の複雑かつコイル構造が必須です。男性の生殖能力のために、このような本質的な臓器の形状に発展し、取得する方法を十分に理解されていません。様々なシグナル伝達経路は、Wntシグナル伝達経路3,4及び経路5シグナリングアンドロゲンとしてWDの発症に関与することが示されています。我々の最近の仕事は、BALの要件を確立しています出生前の開発4時のWDの巻き取り用のとれたWntシグナル伝達。しかし、さらなる研究が出生後の精巣上体のコイリング、細胞分化、および精巣上体上皮内および間質細胞と細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムを理解するために必要とされています。 遺伝的に改変されたマウスモデルは、種々の器官系6の開発および疾患の根底にある分子機構の同定/検証のための強力なツールであることが証明されています。その広範な使用にもかかわらず、推定される遺伝子機能にに関して目標とマウス変異体の予測できない表現型、および一部のモデルでヌル変異体で無表現型、遺伝的要因と環境要因の影響を受け、労働集約を含む遺伝子改変されたマウスモデルの重大な限界があり、マウスモデルを開発する時間のかかるプロセス。したがって、唯一の遺伝的改良剤からの所見の意義の解釈fiedがマウスモデルは、常に6簡単ではありません。これらの制限は、我々に制御培養条件下で、リアルタイムで複数のシグナル伝達経路を操作するための柔軟性を提供し、インビトロ器官培養系で使用することによって克服することができます。器官培養系は、全体の臓器7の生理学および病理学を理解することに尽力しています。また、フルオロフォア標識抗体で染色した全器官の画像化は、それによって、臓器の形状、構造、および機能8のより良い理解を提供し、それはインビボで存在するように、三次元の文脈において関心のマーカーを可視化することを可能。 ここでは、そのようなWDSとして管状の器官の形態形成に関するさまざまな質問に答えるためにも適用することができるマウス胚性生殖隆起の単離、 インビトロ培養し、WDSの全体マウント免疫蛍光イメージングのための方法を、記載しています。このプロトコルでは、我々単離したマウス15.5日から胚性泌尿生殖器の尾根ポスト交尾（DPC）妊娠中のダムや上皮細胞マーカーの免疫染色に続いて3日間（サイトケラチン8、CK8）のためにそれらを培養し、細胞増殖マーカー（ホスホ - ヒストン3、PH 3）とアクティブβcatenin。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
			<td style="width:136px;">CS24501GP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

卵管の形態形成は、男性生殖器系を含むほとんどの哺乳動物の臓器の開発のための基本的な要件です。精巣上体、男性の生殖器官の不可欠な部分は、精子貯蔵、熟成、および輸送を担当しています。大人の精巣上体ウォルフ管（WD）として知られているシンプルかつストレート胚性前駆体から発生する非常にコイル状の管です。精巣内の精子が卵母細胞を受精することができないとして、精巣上体の適切な巻取りは、男性の生殖能力に不可欠です。しかし、精巣上体の開発とコイリングの責任のメカニズムは、部分的に起因し、全器官培養およびイメージング方法の不足のため、不明なままです。本研究では、より良い他の管状器官を研究するために適用することができるWDの巻き取り及び発達のプロセスを可視化するために、インビトロ培養系全体マウント免疫プロトコルを記述する。

開発中に、WDはシンプルで直管は非常に複雑で、コイル状のダクトに変換された重大な変化を受けます。上記の方法を使用して、WDSは、培養条件に類似の変換を受けます。ここでは、3 D（ 図3）培養WDSからの結果を示しています。 WDの形態形成に関与する分子メカニズムを分析するために、培養培地は、異なるシグナル伝達経路を標的とする阻害剤および活性化剤を補充すること?...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K ビュー.  University of Newcastle. 我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。 

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

発生生物学

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

ニワトリ胚組織の開発培養法

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

要約

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静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

全体マウントクリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホールマウント免疫染色解析

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

ニワトリ胚組織の開発培養法

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

要約

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静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

ニワトリ胚組織の開発培養法

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

全体マウントクリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホールマウント免疫染色解析