This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

全ての動物実験は、IACUCプロトコルの承認の下で行われ、14-05-05-1018-3-01 13-04-29-1018-3-01、および14-04-17-1018-3-01の番号を付けました。 1.動物コレクション、取り扱い、および倫理的ケア<ol><li> 19 Lのバケットに小さなディップネットと場所を使用して、現場（http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htmで識別ガイド）からカダヤシアフィを収集します。種を同定するために目視検査を使用してください。 </li><li>池の水とバケツで2日間 - 1のための休憩魚。その後、バブリングAIRSTONEを通気、25℃で半分の池の水/半水道水で満たされた76または189 L水槽タンクの中に魚を移します。魚を扱うときに最低限彼らの皮膚のmicrobiomeを乱すような小さなディップネットを使用してください。 注：魚の密度は、水槽の水の20魚/ 38 Lよりも高くてはなりません。魚は、実験前に少なくとも5日間水槽に順応しています。 </li><li>魚ごとのフレークフードの5 mgを毎日投与計画で魚を養います。ホー12時間明/ 12時間暗サイクルでのld魚。 </li></ol>すべての実験のため2​​.初期抗生物質暴露<ol><li> 19 Lバケットに同じ水槽から各実験からすべての魚を描画、2つのグループ（未露光：抗生物質＆コントロールにさらさ処理したもの）に置きます。収集した以前のデータは、同じ水槽内の魚はコミュニティ組成にほとんど変動が皮膚microbiomesを均質化していることを示しています。 12 </li><li>実験中、人工池の水2Lで魚を保つ（APW; 0.33グラム/ LのCaCl 2、0.33グラム/ LのMgSO 4、0.19グラム/ LのNaHCO 3）使用前にオートクレーブで滅菌します。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）中に50mg / mLで添加することによって、リファンピシン抗生物質のストック溶液を調製します。リファンピシンは、魚に対して非毒性である代表的な広域スペクトルの抗生物質です。ヒトおよびマウスでは、組織にうまく分配します。 </li><li>リファンピシンストックから最終の管理3日間処理した魚の群の抗生物質曝露のためのAPWの2 Lで25μgの/ mLの濃度。 3日後、培養可能な皮膚細菌数は、前処理した魚の皮のそれと類似返すことに注意してください。 </li><li>並行して、APWで未処理の魚のグループを維持し、対照群として作用する水塔にDMSOの等量（APWのL当たり0.5ミリリットル）を得ました。 </li><li>実験は2Lでバケットに三日間の抗生物質曝露（または制御）の期間、転送魚以下、抗生物質自体から直接の影響を回避するために、魚の表現型の抗生物質改変microbiomeの効果を測定することを意図しています新鮮APW。 <ol><li>抗生物質は、魚の体によって除去されるように、10時間の休息期間を使用してください。ベース魚は3日間の抗生物質25μgの/ mLに暴露した実験で、この除去時間。組織グラインダーを使用して体全体を均質化、その後、ピッシングが続く脊髄をつむことにより、魚を安楽死させます。</li><li>寒天ペトリ皿の中央に0.2μmのフィルタリングの後、この懸濁液50μLを配置することにより、抗生物質の存在を決定します。小さなプラグを削除寒天、中に逆さまに無菌200μLピペットチップを押すと、このサスペンション用の穴を作ります。 </li><li>栄養寒天20mLの測定量で寒天プレートを使用し、リファンピシンに感受性である指標生物、 枯草菌 、と綿棒を使用して均一に広げます。 25°CO / Nでインキュベートし、コロニーを得るために、綿棒を使用して、栄養寒天から枯草菌を得ます。 25℃で一晩インキュベートした後、阻害ゾーンを観察すると、魚の組織中の抗生物質の存在を示します。 </li></ol></li></ol> 3. Microbiome抽出<ol><li> 2 mLの滅菌PBST（137 mMのナトリウムで満たされた無菌の15 mLコニカルチューブに魚を置くことによって、外側の粘膜表皮から皮膚microbiomeのサンプルを抽出10秒休止刻みで1分間、10の設定ではCl、10mMのリン酸、0.1％のTween-20、pH7.4）中溶液を、ボルテックス。バッファ内の洗剤および塩は、溶液中の細菌の均一な分散を促進します。同等の結果は、0.85％の食塩水で見つかりましたが、純水で細菌数を低下させました。 </li><li>回復バケットにコニカルチューブから魚を移します。皮膚抽出の致死性は、典型的には10％未満です。いずれかが、すぐに抽出の際にチューブ内の細菌懸濁液を分析したり、将来の分析のために-80℃で15,000×gで、店舗で室温で遠心機で2分間のスピンによって細菌をペレット化。 注：すべての文化や生化学的分析は即時です。 DNAやタンパク質の抽出は、凍結試料から得ることができます。 </li><li> 腸microbiomeのサンプルを入手するには、最初の滅菌ペトリ皿に魚を置きます。ピッシング続いて、手術用ハサミで頭の後ろに直接頸髄を切断することによって魚を安楽死させます、その後外部70％エタノールワイプで体を消毒。 </li><li>解剖後、食道後肛門前に切断することにより、全体の腸を削除します。 </li><li>長さは2ミリメートルと円錐管で2 mLのPBST溶液に、すべてのセクションを配置 - 小1のセクションに腸をカット。 1分間ボルテックスした後、別のきれいなチューブ（腸のセクションを描画しないように注意を取る）に上清を除去します。 注：上清は、直接分析に使用したり、皮膚試料について述べた従来の方法によりペレット化することができ、抽出腸内細菌が含まれています。 </li></ol>特定病原体の4感染モデルの準備とバース<ol><li> エドワードictaluri（E. ictaluri）の感染株を取得し、-80℃で保存された文化を保ちます。ひずみ93 - 感染ナマズから分離されたこの研究で使用さ146は、マーク・ローレンス、獣医学の大学、ミシシッピ州立大学から入手しました。 </li><li> STRE細菌を培養する19寒天E. ictaluriメディア（EIM）と呼ばれる選択＆差動メディアとは、27℃で2日間インキュベート上にAK E. ictaluri株。 </li><li>培養物から純粋分離されたコロニーを移し、栄養ブロス（NB; 5グラム/ Lペプトン、4グラム/ Lの牛肉エキス）の40 mLを含む150 mLのフラスコに接種。 27℃で2日間150rpmで設定シェーカーフラスコを置きます。 </li><li>インキュベーションの後、所望の感染用量ボリュームのE. ictaluri文化を校正するために650nmで0.2 ODの分光計の読みにPBST中での培養のサンプルを希釈します。 </li><li>次の魚の組織からの薬物クリアランスのために約10時間130新鮮な人工池の水のミリリットル、またはAPWを含む個々のプラスチックカップに両方の処理された（抗生物質曝露の3日後）および未処理の魚のグループを転送します。 </li><li>そして、両グループから、クリーンAPWの130 mLを含む8オンスのプラスチックカップに再び各魚を移します。 </li&gt; <li>各魚にAPWにE. ictaluri文化の2.8×10 6 CFU / mLの（風呂感染モデル）を含む致死量を与え、24時間27℃のインキュベーターに保ちます。 </li><li> E. ictaluri入浴後、APWの130 mLで新しいカップに個別に魚を移します。 </li><li>以下の水の交換、週の期間にわたって記録魚の死亡率。魚はこのにわたって供給されていません。ナマズとは対照的に、 カダヤシは、したがって、実験的エンドポイントとして死亡率を使用することが必須であり、感染の外部徴候を示しません。 </li></ol>糞便＆土壌5.複数菌チャレンジ<ol><li> 糞便処理 <ol><li>滅菌手袋、滅菌した50 mLコニカルチューブを使用して、前の2週間で抗生物質を受け取っていない健康なボランティア被験者からの新鮮なヒト糞便を取得します。 </li><li>コレクションの際に、無菌のビニール袋に糞便を収集した後、滅菌した15 mLのcに転送しますonicalチューブ。 800 mg / mlで - 500のストック溶液を得PBSTで糞便を懸濁することによってストック濃度を作ります。この濃厚な混合物は、1ミリリットルまたは開口部が大きくなるように滅菌ハサミで一番下に切断された、より大きなプラスチック製のピペットチップを使用して転送することが最善です。 </li><li>処置群および対照未処理の魚のグループの最初の抗生物質曝露後、130mLの総容量とAPWにいずれかを15mg / mLまたは10mg / mLの最終濃度で糞便懸濁液を含む個々のプラスチックカップに分離します。 25℃のインキュベーター中でカップを持ちます。 </li><li> 2日間にわたる近い観察による糞便露光時のレコードの魚の死亡率。 </li></ol></li><li> 土壌処理 <ol><li>清潔なプラスチック容器に深さと場所さ15cmダウン - 豊富な有機表土（微生物の最高密度と多様性を含むべきである）約7の2キロ - 1を収集します。土壌は、コレクション次の2日以内に使用しなければならないことに注意してください。 </li><li>悲惨なCTLY初期露光期間の後、APWの130ミリリットルの土壌の18.2グラムを含む個々のプラスチックカップに抗生物質処理および未処理魚の両方のグループに分けます。魚を追加する前に手で水井戸に土を混ぜます。微粒子のほとんどが一時停止し、カップの底に滞在していません。 </li><li> 25℃で3日間の期間中に魚を公開し、任意の死亡率を記録。 </li></ol></li></ol> 6.浸透圧ストレスチャレンジ<ol><li>上記のように10時間休止期間に続いて処理した後、APWの150ミリリットルで17.5 mg / mlで（300 mM）のでNaClを含む別々のカップに魚を個別。これは、魚を制御するために、完全に致死的ではない海水の典型的な塩分、（&lt;50％）の半分であるが、効果的な浸透圧調節を必要とする、強いストレスが多いです。 </li><li> 36時間の期間にわたって魚の死亡率を観察します。 </li></ol> 7.硝酸塩毒性チャレンジ<ol><li>抗生物質博覧会後の10時間の期間の残りの魚URE、その後、APWの130ミリリットル中10mg / mLの（118 mM）の17.5 mg / mlで（206 mM）のいずれかの硝酸ナトリウム濃度を含有する個々のカップに魚を分けます。 </li><li>低用量および高用量のために1日間4日間にわたって死亡率を記録。 </li></ol>個別またはグループ化された魚の8成長解析<ol><li>バケット内のグループとして完全な3日間の抗生物質曝露または制御期間。 </li><li> 個人の場合は、150 mLのAPWそれぞれに8オンス発泡スチロールのカップを埋めるカップに個々の魚を転送し、初期評価のために全体重を記録します。 <ol><li>両方の処理および未処理群ではすべての魚のために繰り返します。ときに明確なカップでの魚は食べないので、代わりに透明なプラスチックコップの白い発泡スチロールのカップを使用してください。 </li></ol></li><li>魚ごとに2つのペレットの標準食で毎日魚を養います。ペレットは、個々の質量の低分散（3.53±0.42 mgでそれぞれ、または8％の変動）、resultinを持っているので、ペレットはフレークではなく、使用されました食品の同様な量を受けた魚でグラム。視覚的に食べ残しのペレットを記録することにより、消費電力を監視します。消費率は、80％の上に、一般的でした。 </li><li> 4週間にわたって毎週の終わりには、魚の重量を求めます。 、新鮮なAPWで新しいカップを準備バランスに置き、その後、体重を記録します。その後、元のカップからディップネットに魚を注ぎ、その後再び秤量された新しいカップ、に移します。魚はストレスを避けるために処理されません。 </li><li> グループの場合は、19 LのバケツにAPWの2 Lを配置し、スケールを風袋引き。その後、グループ全体の重量を記録し、新しいAPWのバケットに転送するときに両方のグループで一緒に魚を保管してください。レコードの魚のグループ重量新しいバケットに転送することにより、月の時間スパンにわたって毎週。 </li></ol> 9.ガットトランジットタイム<ol><li>フルオレセイン標識の70kDaのアニオン性デキストランを使用してください。デキストランが大幅に消化し、消化管の層を横切って吸収されるには大きすぎるされていない、このように通路が腸を通る通過時間を測定します。標識デキストランは魚の餌に組み込まれました。 </li><li>滅菌した1.7 mLチューブに、滅菌脱イオン水の360μLとゼラチンの52 mgの（13％溶液）を添加し、配置管を60℃のヒートブロック上にゼラチンが溶融するまで、完全に溶解されます。 <ol><li>乳鉢と乳棒を用いて微粉末に金魚食品フレークを粉砕し、魚油の20μLとともに、チューブにこの粉末を40mgを追加します。混合した後、FITCデキストランの1.6ミリグラムを追加します。 </li></ol></li><li> μLを実験台にパラフィルム上に落下20内に高温の液体混合物を分配し、それらを迅速に冷却して凝固させます。彼らは魚が食べるにはあまりにもハードになる前に、滴は、最大4日間保存することができます。ストアは、その後、加湿滴を保つ密封されたプラスチック容器、内部の滅菌水に浮かべされたペトリ皿の半分の上にパラフィルムを配置することによって冷蔵庫に低下します。 </li><li>ただ供給する前に、四半期には、カミソリの刃を使用してセクションに落下します。 Styroに魚を順化供給なしで個別に2日間、発泡カップ（注：のみ未露光制御の魚を使用しました）。魚とカップに食品の四方を置き、彼らはそれぞれが食べる食品の何個分の30分間の魚を観察します。 </li><li>監視期間を開始するには、ディップネットを使用して、APW 80mlでカップに個別に魚を移します。 2時間ごとに、そっと手でAPWを旋回し、その後4℃で標識した1.7 mLチューブに1 mLのサンプルと店を取ります。 36時間のサンプルを取ります。 </li><li>検定終了後、同時に全ての試料の蛍光分光光度計、と録音蛍光、。キュベットに全体の1 mLのサンプルを配置し、520 nmで495 nmでの励起および発光を使用して測定された蛍光を記録します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

いくつかの課題は、魚組織に枯渇させる薬物のための抗生物質治療後の清潔なAPWで休止期間を必要とします。休止期間がスキップされている場合は、抗生物質の存在は、アッセイは、細菌への曝露を伴う場合は特に、結果を混乱させることができます。ホスト上の微生物の合計数に大きな変化なしに変更されたmicrobiome組成物からの影響を調べるために、抗生物質の露光中に予備実験監視microb...

抗生物質が微生物群集の不均衡を意味し、腸内毒素症につながる人間microbiomeを混乱させることができることが確立されています。抗生物質治療後の細菌叢の組成の変化は、特に腸管1、2に、地域社会の多様性を下げる主要メンバーを削減し、地域社会の代謝を変化させることが示されています。腸microbiomeの抗生物質の乱れがクロストリジウム・ディフィシレ 3,4及びサルモネラ 5にコロニー形成抵抗を低減することができます。 さらに、微生物の破壊は、多くの症候群およびヒトにおける疾患の発症に関連している（ 例えば、抗生物質に関連する腸炎、炎症性腸疾患、代謝障害、 など ）。抗生物質も広くにおける成長促進剤として農業に実装されています家畜や家禽の生産6。これらの強力なツールの使用方法は、抗生物質耐性の急速な上昇に明らかである、担保の効果がないわけではないだけでなく、破壊されたmicrobiomeの効果は、その生息ホストとされています。多くの研究は、広域スペクトル抗生物質の使用量は細菌叢の構造と機能に長期的な影響を持っていることが示されている、まだ抗生物質破壊microbiome影響を与えるホスト生理学から副作用がサポートされるには至っていない唯一の憶測です。 ホスト、微生物、および抗生物質間の相互作用ははるかに簡潔な方法で理解されているからです。したがって、簡単かつより扱いやすいモデルは、非常に複雑な哺乳動物系に光を流すことが有利です。腸を含むヒトで粘膜表面も、最高密度や微生物の多様性、および最も親密な微生物宿主相互作用を抱きます。魚の粘膜皮膚microbiomeがsを提供していますモデル系としてeveral利点。 真骨類 （硬骨魚）は、硬骨魚類は、先天性および共生細菌群集7との関係共進化してきた免疫系を獲得したの両方を持っていることを意味する脊椎動物の中に発散する最古の系統の一つです。魚皮共有生理機能、免疫コンポーネント、および粘液産生細胞8の配置のような哺乳動物の1型粘膜表面と多くの特徴。魚皮粘膜表面の外部の場所は、実験的に操作が容易とサンプルmicrobiomeを提供しています。 西カダヤシ、 カダヤシのアフィニス（G. アフィニス）は 、交配および毒物学9、10、11を研究するために過去に使用されてきたモデルの魚です。外来種として野生の小さなサイズ、人口豊かさを考えると、メートル<html> inimalケアコスト、および丈夫な性質は、我々は、粘膜microbiomeモデルとしてG.アフィニスを開発しました。さらに、 カダヤシは、魚種では珍しいです胎生哺乳類、若い生きるために出産の生理を共有しています。私たちは、 カダヤシ 12とプロファイリング16Sを使用して、魚の皮膚の正常細菌叢の時点で最も広範な研究を完了しました。さらなる研究は、皮膚や腸の微生物叢の破壊広域スペクトル13抗生物質を使用して、次のホスト上の3つの負の効果を実証しました。 ファイブ異なる効果は、抗生物質曝露後の魚で調べました。 microbiomeの最もよく確立されたホストの利点は、病原体の競合的排除です。魚の病原体エドワードictaluriは、市販のナマズの農場14で腸溶性敗血症の発生を引き起こすことが知られています。 E. ictaluriはまた、致死的にゼブラフィッシュに感染することが示されていますクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 15、16、 カダヤシ 17。水柱からこの病原体でのチャレンジは、除外の尺度として役立つことができます。個々の病原体に対する感受性と比較するように、混合した有機体の高密度化への暴露時に生存も行いました。糞便や有機物に富む土壌は微生物群集のよく遭遇源として使用しました。 細菌性腸コミュニティが行うもう一つの確立された役割は、このように、ホストの全体的な栄養摂取に影響を与える、栄養処理とエネルギーの収穫です。栄養の肉眼的測定としては、魚の体重は標準食を与えたことの1ヶ月前後で比較しました。平均的に制御魚は月の上に体重が増えた一方で、平均のような抗生物質で処理した魚は重量を失いました。体重増加の欠如のためのメカニズムは不明です。一つの可能​​性のある要因には、腸内の食物の通過時間です。 GIモティリティメソッドは通過時間を決定するためにゼブラフィッシュ（アダム・リッチ、SUNYブロックポート、私信）から適合させました。抗生物質処理した魚は、変更された通過時間を有する場合には、まだ決定されていません。 すべての生物が自然環境の中で経験した共通の課題、特に魚は、浸透圧ストレスです。 カダヤシは急性塩分18の高濃度で強調したときに迅速に対応することが示されています。驚くべきことに、展示抗生物質に変化したmicrobiomeと魚は高い塩ストレスに生存率を低下させました。この小説の表現型のメカニズムは調査中です。特に水槽内の水生動物、上の別の一般的なストレスは、有毒な窒素の形態（アンモニア、硝酸、亜硝酸）です。硝酸塩に対する生存率は、抗生物質処置群および対照魚の間で有意差はなかったです。この原稿に提示される方法は、 カダヤシや、ゼブラと同様の魚のモデル生物で使用することができます魚やメダカは、実験操作以下の魚における表現型を測定します。

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>tablets dissolve in water to make PBS</td></tr></tbody></table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

抗生物質曝露13から魚ホストの影響を研究するために用いた実験装置の全体概略図を図1Aに表され、魚の皮膚（ 図1B）および腸（ 図1C）microbiomesを抽出するための技術を含みます。以前のデータは、総皮膚培養可能数は、早期治療で低下している間、それは3日後に治療前のレベルに戻っていることが明らかになっ...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

この研究は、抗生物質により、皮膚や腸のmicrobiomeコミュニティ組成の変化を以下のモデル魚のホストへの影響を明らかにするためのメソッドが含まれます。

ホスト表現型の検討で<em&gt;カダヤシアフィニス</em&gt;続き抗生物質治療

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K ビュー.  Sam Houston State University. この研究は、抗生物質により、皮膚や腸のmicrobiomeコミュニティ組成の変化を以下のモデル魚のホストへの影響を明らかにするためのメソッドが含まれます。 

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

免疫・感染学

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

GF ゼブラフィッシュモデルの最適化:生成、維持管理、および微生物研究

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

著者スポットライト:微生物叢と宿主の関係研究のための無菌ゼブラフィッシュの確立

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

発生生物学

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

多剤排出システムの特性評価のための単一コピー遺伝子発現

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

著者スポットライト:排出欠損細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを使用した抗生物質耐性研究の進歩

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

ホスト表現型の検討で

要約

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表現型のハイスループットアッセイ

イメージング病因とのコーディングを解読し、

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

ホスト表現型の検討で

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表現型のハイスループットアッセイ

イメージング病因とのコーディングを解読し、

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のアスペルギルス胞子の感染

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価