この方法は、腸管内の微生物によるコロニー形成と感染のダイナミクスに関する微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが人間の食物媒介性感染症のより代表的であり、経口のギャバジと比較して魚の潜在的な組織損傷を減少させることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、パラメシアの高い運動性の性質のために、洗浄工程を行うことが困難であり得るため、重要である。
生育培養から、8ミリリットルのE3培地を含む10ミリリットルの組織培養フラスコに、パラメシウム培養物1ミリリットルと大腸菌MG1655培養液1ミリリットルを加える。フラスコを22度に軽く旋回させてから、コカルチャーの1ミリリットルを新鮮なE3培地の9ミリリットルを含む新しい10ミリリットルの組織培養フラスコに通過させ、2週間ごとに1ミリリットル当たり108コロニー形成単位を補う。パラメシウム内の細菌の半減期を決定するために、パラメシア菌の共培養の光学密度からパラメシアの数を数え、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に50マイクロリットルの上澄み液を6時間追加する。
PBSに1%の非イオン界面活性剤の950マイクロリットルをチューブに加えます。そして、各サンプルのパラメシアを1分間の渦で溶精し、滅菌PBSで各サンプルの10回に1回希釈する。そして、摂氏37度で16時間のインキュベーションのために、各希釈の100マイクロリットルを選択的プレートにプレートします。
翌日、プレート上の細菌コロニーの数を決定するために、孤立した個々のコロニーのみをカウントします。そして30-300コロニー形成単位を得る希釈と板を識別する。感染前日、遠心分離による治療当たり600培養の光学密度から1体積の細菌を採取する。
そして、チューブあたりE3培地の1ミリリットルでペレットを再中断します。次に、各細菌懸濁液に適切な細菌染色の1マイクロリットルを加える。そして、ホイルでチューブ写真の漂白を保護します。
室温で15分間エンドオーバー回転で細菌サンプルをインキュベートする前に。インキュベーションの終わりに、過剰な染料を除去するために大量のE3培地で細菌を2回洗浄する。そして、チューブあたり新鮮なE3培地の1ミリリットルでペレットを再中断します。
次に、室温で2時間インキュベーションするために、条件ごとに新鮮なパラメシアの2つのフラスコのそれぞれに細菌懸濁液の1ミリリットルを加える。個々の50ミリリットルの円錐管に条件ごとに両方のフラスコの内容物を引っ張ります。そして遠心分離により試料をペレット化する。
滅菌ピペットを使用して、各チューブ内のE3上清の約10ミリリットルを、遠心分離によって3つのスケを行う新鮮なE3培地の10ミリリットルに置き換えます。最後の洗浄後、約10ミリリットルのE3上清を取り除き、ペレットを破壊しないように気をつけて、残りの10ミリリットルのE3培地中のペレットを再び懸濁します。各懸濁液500マイクロリットルを、個々の1.5ミリリットルマイクロセニフュージチューブに移し、遠心分離によってパラメシアをペレットに入れ替えます。
上清400マイクロリットルを捨て、36.5%ホルムアルデヒド溶液の20マイクロリットルを穏やかなピペットで残りの100マイクロリットルのパラメシアに加えます。室温で5分後、1ミリリットル当たりの死んだパラメシアの数を数える前に、ピペットで各チューブの実際の総量を測定します。ゼブラフィッシュの食物媒介感染の場合、パラメシアサンプルをE3培地濃度の1ミリリットル当たり10〜5パラメシアに希釈する。
そして、各パラメシア培養の3ミリリットルを条件ごとに6ウェルプレートの1つの井戸に加えます。次に、麻酔ゼブラフィッシュを10匹ずつ、最小限の量の液体で各ウェルに移します。そして、昼間の条件下で日経インキュベーターで摂氏30度で2時間の共培養をインキュベートします。
捕食率を決定するには、捕食捕獲のビデオ映像を取得しながら、ステレオ顕微鏡の下で餌ゼブラフィッシュを見ます。獲物捕獲は、獲物に向かってゼブラフィッシュの打撃によって特徴付けられる。各ストライキは、1 つの獲物キャプチャ イベントであると推定されます。
インキュベーションの終わりに, 5 種類のウェルでゼブラフィッシュを洗浄 3 新鮮な E3 培地のミリリットルを含む 100 トリケーヌのリットルあたり 100 ミリグラムあたりよく.そして、黒い井戸6ウェルプレートに1%低融解アガロースの3ミリリットルに各ゼブラフィッシュを埋め込みます。すべての魚が埋め込まれたら、プレートをステレオ顕微鏡の下に置き、クリップされたゲルローディングチップを使用して、ヘッドが左側にあり、各視野の右側に尾が表示されていることを確認します。
アガロースがセットされるまで5分間待ってから、組み込み魚をトリカインを添加した新鮮なE3培地で重ね、ゼブラフィッシュを蛍光顕微鏡で画像化して細菌感染の進行を評価します。病原性大腸菌の場合、最初の細菌密度はパラメシウム当たり790個の細菌であり、各パラメシウムの真空中で細菌が約2.3時間の半減期で原子を切断して分解される。獲物は特徴的な打撃行動を伴い、捕食率の決定は、各ストライキが1パラメシウムの内部化につながるという仮定に基づいています。
消化後、遊離菌は前腸から中腸および後腸に移動し、捕食開始から約1〜2時間後に検出される。例えば、S-エンテニカは、主に腸内粘膜に局地的に、上皮への好中球の浸潤につながるいくつかの上皮浸潤を伴う。特定の種類の細菌を使用することは非常に危険であり、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
