This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

すべての手順は、ドイツ連邦共和国によって発行された動物実験のためのガイドラインに従って行いました。 注：網膜組織は、この手順の延長部分の間に酸素を欠いていることになりますので、すべてのステップができるだけ速く行われるべきです。マウスは、解剖の前に少なくとも3時間暗順応でなければなりません。網膜の光適応を回避するために、準備とスライスは、暗赤色灯の下で行われるべきです。 メディアやその他の化学物質の作製<ol><li> エイムズ「中6を準備します。解剖後、すべての回でエイムズ「中に網膜組織を浸します。 <ol><li>エイムズ「中の2.2グラムと蒸留水250ミリリットルで298ミリグラムのHEPESを溶解させます。 HEPESの濃度は5 mMのだろう。すべての粒子が溶解するまで穏やかに撹拌します。 </li><li>カーボゲンを用いて室温でバブルエイムズ「中（95％酸素、5％の車少なくとも5分間、ボン二酸化）。溶液へのガラスパスツールピペットで供給カーボゲン。ガス調整器の出口に適切なチューブを介して、パスツールピペットを接続します。 </li><li>溶液に、475 mgのナトリウム - 炭酸水素を追加します。バブリング後の重炭酸塩の添加は、炭酸カルシウムの沈殿を防止します。 </li></ol></li><li> 低ゲル化温度アガロースを準備します。アガロースをビブラトーム切片中に網膜組織の埋め込みのために必要とされます。 <ol><li> 9ミリリットルエイムズ「中で180mgのアガロースおよび蒸留水1ミリリットルに溶解します。全ての固体が溶解するまでゆっくりとアガロース溶液を加熱するためにマイクロ波を使用してください。オーバーフローを避けるために10秒ずつ - 5の熱。溶液は透明かつ透明であるべきです。 </li><li>ストアは、処置の期間、37℃の水浴中でアガロースを溶解しました。 </li></ol></li></ol> 2.ビブラトームを設定します注：すべての切片を用いて行われています材料表に記載されているビブラトーム。指定された設定は、ビブラトームのこのタイプを参照してください。神経組織のビブラトーム切片の詳細については7を参照するために参照してください。 <ol><li>ブレードホルダーにビブラインジェクタブレードを置きます。 </li><li> &quot;のVibroCheck「デバイスとブレードの垂直偏向を測定します。それは切断面に平行になるまで、ブレードを傾けるために、ブレードホルダーの調整ネジを使用してください。ブレードの正確な位置決めは、部分表面のブラインド効果を防止するために、その表面上の生きている細胞を含む平坦部を製造する必要があります。 </li><li>以下の設定にビブラトームを設定します。振幅、1.00;スピード、0.20;厚さ、180から200ミクロン。 </li></ol>マウス網膜の3解剖<ol><li>気密容器に約1ミリリットルイソフルランの蒸発によって大人C57BL / 6マウスをAnaesthetize。麻酔が完了すると、頸椎脱臼によって動物を安楽死させます。ザマウスは、そうでなければ、スライスの品質が低下する、3カ月以上経過してはなりません。 </li><li>眼の下に曲がったピンセットを置くことによって、眼球を削除します。静かに視神経を公開します目のボールを持ち上げます。春のはさみで視神経を切断して、2ミリリットルエイムズ「中を含む35ミリメートルのペトリ皿に眼球を転送します。 </li><li>実体顕微鏡のステージ上のすべての後続のステップを実行してください。以下の手順（ - 3.9 3.4ステップ）の最適な視覚的な制御を可能にする値に倍率を調整します。 </li><li>尖った鉗子または20 G針で強膜への移行で角膜を穿刺。このステップの間、別のピンセットで眼球を安定。穿刺装置で網膜を損傷しないように注意してください。 </li><li>ステップ3.3で作られた小さな穴に春のはさみを挿入し、角膜の周りに円を切りました。切断しながら、再び、ピンセットで眼球を安定。 Cの順で表面に非常に接近していない切開をしてください網膜にユタ。 </li><li>慎重にピンセットで角膜、レンズ、および硝子体を除去します。硝子体は、眼の後部にのみ薄い透明層を含みます。しかし、硝子体が完全に除去されること切片ビブラトームに必須です。 </li><li>ペトリ皿では、1がダウンし、網膜上に穴を通して見えるような方法でアイカップを置きます。開口部の縁は、強膜組織のみで構成する必要があります。円形カット（ステップ3.4）が近すぎるアイカップの赤道に行われた場合、網膜組織はまた、切開部に存在近くなります。ステップ3.8で網膜を損傷しないように、次に注意してください。 </li><li>鉗子で強膜をつかみ、慎重に離れて組織を引き裂きます。このステップの間に、網膜を破壊することはないが不可欠です。必要に応じて、鉗子で組織の強膜の部分を安定さ、慎重に他の鉗子で網膜を剥離することによって鋸状縁から網膜を切り離します。鉗子を閉じておいてください。再処理することはありません組織は非常に柔らかく、すぐに道を与えるので、ピンセットでティナ。 注：このステップでは、網膜とアイカップの残りの部分のみが視神経頭で接続されます。 </li><li>春のはさみで視神経乳頭に付着部位をカット。網膜は今自由にエイムズ「中における組織の単一の部品として浮遊する必要があります。 </li><li>位置にそれを操作するために、鉗子でエッジに沿って網膜を保持することにより、湾曲した手術用メスの刃を用いて、約23ミリメートルの6小さな長方形 - 4に網膜をカット。長方形内の網膜組織を挟まないようにしてください。網膜、遠くない周辺部の中央部から駒を取ります。 </li><li> 35mmのプラスチック製ペトリ皿に大径プラスチックパスツールピペットで網膜の小片を移送、の底を1mm未満のグリッドサイズを有するメッシュで置換されています。ビーカーまたは三角フラスコの上部3分以内にシャーレを修正し、エイムズ「中府の網膜の部分を沈めますカルボゲンでbbled。 </li></ol>アガロースにおける網膜個の4埋め込み<ol><li>エイムズ「中のいくつかと一緒に35ミリメートルのプラスチックシャーレに3網膜個 - 注意深く2を転送します。転送のために大口径のプラスチックパスツールピペットを使用することが最も便利です。このステップでは、網膜片の正確な向きは重要ではありません。 </li><li>ガラスパスツールピペットで残りのエイムズ「中のできるだけ多くを削除してください。すぐ流体が削除されているように、ステップ4.3に進みます。網膜組織を乾燥させないでください。 </li><li>すぐにアガロース溶解の2ミリリットル（37°C）で網膜の部分をカバーしています。ステップ3.10に記載されたサイズを考えると、作品をアガロース内丸くしません。 </li><li> 液体アガロースの中で、静かにシャーレの底に網膜の部分を押してください。神経節細胞層が下向きにする必要があります。正確な位置を判断するための立体顕微鏡を使用してください。位置決めのために、網膜のパイを扱います小さなへらでECES。アガロースは迅速に固化するため、可能な限り迅速かつ正確に網膜を配置します。 <ol><li>網膜片をガラス皿の底に平行なアレンジ。そうでない場合のセクションでは、接線方向または斜めになります。個々の部分は、互いに接触しないはずですが、あまりにも遠く離れてはなりません。同じ水平レベルに多かれ少なかれ網膜片を配置してみてください。 </li></ol></li><li>少なくとも2分間 - （6°Cの4）冷蔵庫の中に埋め込まれた網膜片とガラスシャーレを入れてください。これはすぐに、さらなる処理のためにアガロースを硬化します。すぐにアガロースが重合したとして、次のステップに進みます。 </li></ol>網膜個の5取付<ol><li>慎重にペトリ皿から網膜片を含むアガロースブロックを削除します。ガラスからアガロースブロックを持ち上げるために、スパチュラまたは同様のデバイスを使用してください。接着力のために、これは非常に困難であることが判明することができます。ただし、破損しませんアガロースブロック。室温で、この以降のすべてのステップを実行してください。 </li><li>カバーガラス上のアガロースブロックを配置し、手術用メスの刃で、サイズを調整します。網膜片の両側にアガロースの2ミリメートル - 1のままにしておきます。ブロックの最終的なサイズは、約1066ミリメートル（10ミリメートルは、ブロックの高さを意味し、その辺の長さ6ミリメートル）でなければなりません。 </li><li>瞬間接着剤を使用してビブラトームの試料ホルダーにアガロースブロックを接着。底部がホルダーに固定されながら網膜の作品は、その表面に平行に10ミリメートル、高ブロックの上部に配置し、配向されるべきです。 </li><li>ビブラトームのバッファトレイに以前バブリングエイムズ「中を注ぐことにより、すぐにブロックをカバーしています。 </li></ol>水平ビブラトーム切片の6準備<ol><li>切片を開始します。網膜組織の断片が、スライスに表示されるまで最初は、手動でスライスの厚さを設定します。そして、ステップ2.3での設定に変更します。からアガロースブロックごとに3スライス - マウスの網膜は、これ以上2以下があるだろう、だけで約200μmの厚さです。 </li><li>ガラス棒でバッファトレイからセクションを削除し、35ミリメートルペトリ皿に2ミリリットルエイムズ「中に転送します。 </li><li>すぐに37℃（5％CO 2/55％のO 2）でインキュベーターに保管してセクション。セクションを囲むアガロースインキュベーター固体とどまると網膜を損傷することなくセクションを処理するために使用することができます。室温で酸素エイムズ &#39;培地に比べてそれぞれの雰囲気中37℃で保存するときに、より良いスライス品質が得られます。切片を直ちに使用することができ、または良好な生理学的結果をインキュベーターに4時間まで保存することができます。 </li><li> 6 - アガロースと繰り返しセクション4の次の網膜の部分を埋め込みます。 </li></ol>

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	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

垂直スライスとは対照的に、水平細胞とアマクリン細胞のような半径方向に配向ニューロンの樹状突起形態がよく保存されています。全網膜製剤と比較して、これらの細胞型は、微小電極のために容易にアクセス可能であり、両方の電気及びイメージング技術によって研究することができます。ここでは、網膜の外側に焦点を当てました。しかしながら、同様のアプローチは、特に、内網膜<...

視覚情報は、感光体活性化の動的な時空間的パターンとして符号化され、光受容体および二次ニューロン間のリボンシナプスは、視覚情報の下流の転送を決定します。哺乳動物の網膜の垂直スライス標本、 すなわち光受容体と双極細胞との間、および双極細胞、およびアマクリン細胞1、2、3、4、いくつかのタイプの間で、垂直の経路の信号処理を研究するための非常に貴重なツールです。 しかし、垂直切片は常にシナプスの連絡先のかなりの損失につながる、多くの網膜神経細胞の樹状突起分野の厳しい切り捨てが発生します。特に、網膜の外側に、水平細胞は、それらの横に広がる拡張樹状のフィールドと軸索末端システム5に影響を受けます。垂直でスライス標本、水平細胞の樹状突起の円錐感光体端末の数百のシナプス入力は、このように、いくつかの疎コンタクトに低減されます。これは、個々のシナプスの特性を研究するためには十分かもしれないが、それは決してないが、感光体リボンシナプスの同期化された活性化の基礎となる信号処理機能を表します。 したがって、我々は、無傷で機能的な水平細胞の樹状突起にほぼすべての錐体光受容体のシナプス入力を離れる水平スライス標本を、開発しました。切片ランの面は、理想的には、水平細胞及びアマクリン細胞間の内顆粒層を通して切断し、網膜の表面に平行です。このように、外側の網膜の水平スライスを含んで作成され、シナプス前サイト上で、シナプス後サイト上の内側と外側のセグメントだけでなく、シナプス終末、および水平細胞と双極細胞と光受容体。この調製は、トンに非常に適していますOその樹状のフィールド内のすべての錐体視細胞、水平細胞の樹状突起に協調シナプス入力を調べます。したがって、より良い、シナプス後応答に感光体活性化のマトリックスからの視覚情報の伝達のために重要である感光体リボンシナプスの働きを理解するのに有用であることが分かるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

垂直スライス標本はよく大人の哺乳類の網膜内の回路および信号伝送を研究するために設立されています。これらの製剤で切片の面は、光受容体と双極細胞のような半径方向に配向ニューロンの研究に最適です、網膜表面に対して垂直です。しかし、水平細胞、広視野アマクリン細胞、および神経節細胞の大きな樹状アーバは、これらの細胞中で著しく減少シナプス活性を残して、ほとんどが切り捨てられます。神経節細胞と変位アマクリン細胞は網膜の全体に取り付けられた準備に研究することができるのに対し、内顆粒層に位置する水平細胞とアマクリン細胞がわずかしか全体の網膜組織内の電極のためにアクセスできます。 最大のアクセシビリティとシナプス完全性を達成するために、我々は、マウス網膜の水平スライス標本を開発し、感光体と水平の間のシナプスでの信号伝達を研究しました細胞。水平方向の切片は、水平細胞の樹状突起に無傷で機能的なコーンシナプス入力のための前提条件として、電極の標的化のための水平細胞体の（1）簡単かつ明確な視覚識別、および拡張水平細胞の樹状のフィールド（2）保存を可能にします。 水平スライスからの水平細胞は暗所でトニックシナプス活性を示し、そして、彼らは内向き電流と減少したシナプス活性の低下と光の点滅を短時間に応答しました。免疫細胞化学的証拠は水平細胞の樹状フィールド内のほぼすべてのコーンはその周辺の樹状突起とシナプスを確立することを示しています。水平スライス標本は、したがって、水平方向に拡張網膜神経細胞の生理学的特性ならびに選択されたシナプス全体の感覚信号伝送との統合を研究するのに適しています。

<html>マウス網膜の水平スライスでは、水平細胞体は簡単に多角形の細胞体（ 図1A）から出てくるいくつかの主要な樹状突起とのユニークな形態に応じて特定することができました。スライスの表面近くに位置する水平細胞体は、パッチクランプ電極のための日常的にアクセス可能でした。録音時には、細胞が密接に無傷のマウス網膜8（ ...

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Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K ビュー.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg. 私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。 

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Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

網膜の水平スライス標本

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

生物学

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

マウス網膜からERG Transretinal·レコーディング：ロッドとコーンの光応答

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

ビブラトームセクショニングマウス網膜は、感光体文化を準備する

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

マウス分裂網膜における双極性および水平神経細胞の研究

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

著者スポットライト:Split Retina技術を使用してアクセスを強化し、実験を加速する 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

要約

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