This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

모든 절차는 독일 연방 공화국에 의해 발행 동물 실험에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 참고 : 망막 조직이 절차의 연장 부분 중에 산소가없는 것입니다 때문에, 모든 단계가 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 마우스는 어두운 적응 해부하기 전에 적어도 3 시간을해야합니다. 망막, 준비의 빛 적응을 방지하려면 및 슬라이싱은 희미한 붉은 빛 아래에서 수행되어야한다. 미디어 및 기타 화학 물질 1. 준비 <ol><li> 에임스 &#39;중간 (6)를 준비합니다. 절개 한 후, 항상 에임스 &#39;중간에 망막 조직 몰입. <ol><li> 에임스 &#39;중간의 2.2 g과 증류수 250 ml의에서 298 mg을 HEPES를 녹여. HEPES의 농도는 5 밀리미터 될 것입니다. 모든 입자가 용해 될 때까지 부드럽게 저어. </li><li> carbogen와 실온에서 거품 에임스 &#39;중간 (95 % 산소, 5 % 차적어도 5 분 봉 이산화탄소). 솔루션에 유리 파스퇴르 피펫으로 공급 carbogen. 가스 레귤레이터의 콘센트에 적합한 튜브를 통해 파스퇴르 피펫을 연결합니다. </li><li> 이 용액에 475 mg의 나트륨 - 중탄산염을 추가합니다. 발포 후 탄산 수소 첨가는 탄산 칼슘의 침전을 방지한다. </li></ol></li><li> 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 vibratome의 절편 동안 망막 조직의 삽입이 필요합니다. <ol><li> 9 ml의 에임스 &#39;보통 180 mg의 아가로 오스와 증류수 1 ml에 용해. 모든 고체가 용해 될 때까지 천천히 아가로 오스 용액을 가열하는 전자 레인지를 사용한다. 5 열 - 10 초 단위는 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 해결 방법은 명확하고 투명해야한다. </li><li> 저장소는 절차의 지속 기간 동안 37 ℃에서 수조에 용해 아가. </li></ol></li></ol> 2. Vibratome 설정 참고 : 모든 절편이 함께 수행하고있다vibratome 재료 표에 나열된. 주어진 설정은 vibratome의이 유형을 참조하십시오. 신경 조직의 vibratome 절편에 대한 자세한 내용은 7 참조 참조하시기 바랍니다가. <ol><li> 블레이드 홀더에 vibratome 인젝터 블레이드를 놓습니다. </li><li> 은 &quot;vibrocheck&quot;장치와 블레이드의 수직 편향을 측정합니다. 이 절삭면에 평행 할 때까지 블레이드를 기울 블레이드 홀더 상에 상기 조정 나사를 사용한다. 블레이드의 실제 위치는 부 표면 블라인드 효과를 방지하고 표면에 살아있는 세포를 포함하는 평면 부를 제조 할 필요가있다. </li><li> 다음 설정에 vibratome을 설정 진폭, 1.00; 속도, 0.20; 두께, 180-200 μm의. </li></ol> 마우스 망막의 3 해부 <ol><li> 밀폐 용기에 약 1 ml의 이소 플루 란의 증발에 의해 성인 C57BL / 6 마우스를 마취. 마취가 완료되면, 경부 탈구에 의해 동물을 안락사. 그만큼마우스 그렇지 않으면 조각의 품질이 저하되며, 이전 3 개월 이상이어야한다. </li><li> 눈 아래 곡선 집게를 배치하여 안구를 제거합니다. 조심스럽게 시신경을 노출 할 눈에 볼을 올려. 스프링 가위로 시신경을 잘라 2 ml의 에임스 &#39;매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 안구를 전송합니다. </li><li> 스테레오 현미경의 무대에 이후의 모든 단계를 수행합니다. 다음 절차 (- 3.9 3.4 단계)의 최적의 시각 제어를 할 수있는 값으로 배율을 조정합니다. </li><li> 뾰족한 집게로 공막 또는 20 G 바늘로의 전환에 각막에 구멍. 이 단계에서, 다른 집게로 눈 공을 안정. 천공 장치와 망막이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 단계 3.3에서 만든 작은 구멍에 스프링 가위를 삽입하고 각막 주위에 원을 잘라. 절단하는 동안 다시 집게로 눈 공을 안정. 다하기 위해 표면에 매우 근접하지 절개 유지망막에 유타. </li><li> 조심스럽게 집게와 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 유리체는 눈 뒤쪽 만 얇은 투명층을 포함한다. 그러나, 유리체가 완전히 제거되었는지 절편 vibratome 필수적이다. </li><li> 페트리 접시에, 하나는 아래로 망막 위에 구멍을 통해 보이는하는 방식으로 아이 컵을 놓습니다. 개구부의 가장자리는 공막 조직으로 만 구성되어야합니다. 원형 컷 (단계 3.4)이 아이 컵의 적도에 너무 가까이 수행 한 경우, 망막 조직은 절개에 존재 가까이 될 것입니다. 단계 3.8에서 망막이 손상되지 않도록 다음주의하십시오. </li><li> 집게로 공막을 잡고 조심스럽게 따로 조직을 찢어. 이 단계에서 망막 파열되지 필수적이다. 필요한 경우 집게로 조직의 공막 부분을 흔들리지 조심스럽게 다른 집게와 망막 박리하여 오라 세라의 망막을 분리합니다. 포셉를 닫아 두십시오; 재 처리하지조직 이후 집게와 티나는 매우 부드럽고 방법 즉시 제공 할 것입니다. 주 :이 단계에서는, 망막과 세안 컵의 나머지 부분은 시신경 헤드에 연결된다. </li><li> 스프링 가위로 시신경 유두에 부착 사이트를 잘라. 망막은 이제 자유롭게 에임스 &#39;중간에 조직의 한 조각으로 떠되어야한다. </li><li> 위치로 조작하려면 집게로 가장자리를 따라 망막을 잡고 곡선 메스 블레이드를 사용하여 약 23mm의 6 작은 사각형 - 4로 망막을 잘라. 사각형 내에서 망막 조직을 곤란하게하지 마십시오. 망막이 아닌 지금까지 주변의 중앙 부분에서 조각을 가라. </li><li> 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫 망막 부분을 이동시켜 하부있는이 1mm 미만인 격자 크기의 메쉬로 대체되었다. 비커 나 삼각 플라스크의 상부 셋째 내에서 페트리 접시를 수정하고 에임스 &#39;중간 버퍼에 망막 조각 잠수함carbogen와 bbled. </li></ol> 아가로 오스의 망막 조각 4. 퍼가기 <ol><li> 에임스 &#39;매체의 일부와 함께 35mm 플라스틱 페트리 접시에 3 망막 조각 - 조심스럽게 2를 전송합니다. 전송 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이 가장 편리하다. 이 단계에서 망막 부분의 정확한 방향은 중요하지 않다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 나머지 에임스 &#39;매체의 가능한 한 많이 제거합니다. 즉시 유체가 제거 된 바와 같이 단계 4.3를 진행합니다. 망막 조직 건조하게하지 마십시오. </li><li> 바로 아가로 오스 용해 2 ㎖ (37 ° C)와 망막 조각을 커버한다. 단계 3.10에서 언급 한 크기 감안할 때, 조각은 아가로 오스 내에 컬하지 않을 것이다. </li><li> 액체 아가로 오스 내에서 조심스럽게 페트리 접시의 바닥에 망막 조각을 밀어 넣습니다. 신경절 세포 층이 아래로 향하게해야합니다. 정확한 위치의 판단에 대한 스테레오 현미경을 사용합니다. 측위 망막 PI 처리작은 주걱 eces. 아가로 오스 빠르게 응고하기 때문에 가능한 한 빠르고 정확한 망막을 배치합니다. <ol><li> 망막 조각이 유리 접시의 바닥에 평행하게 배열; 그렇지 않으면 섹션 접선 또는 경사 될 것입니다. 각각의 조각은 서로 접촉하지 말아야하지만, 또한 너무 멀리 떨어져이어야한다. 동일한 수평 수준에서 망막 조각이 더 많거나 적은 곳에 위치 시키십시오. </li></ol></li><li> 최소 2 분 - (6 °의 C 4) 냉장고에 내장 된 망막 조각과 유리 페트리 접시를 넣어. 이 신속하게 추가 처리를 위해 아가로 오스를 강화합니다. 즉시 아가로 오스는 중합 것처럼 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 망막 조각의 5 장착 <ol><li> 조심스럽게 페트리 접시에서 망막 조각을 포함하는 아가로 오스 블록을 제거합니다. 유리에서 아가로 오스 블록을 들어 올려 주걱 또는 유사한 장치를 사용하십시오. 때문에 접착 힘이 매우 어려운 것으로 판명 할 수 있습니다. 그러나, 파괴 방지아가로 오스 블록. 실온에서이 이후의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 유리 커버 슬립에 아가로 오스 블록을 놓고 메스 블레이드와 크기를 조정합니다. 망막 조각의 각 측면에 아가로 오스의 2mm - 1 둡니다. 블록의 최종 크기는 약 1,066mm이어야 (10mm 블록, 에지 길이 6mm의 높이를 말한다). </li><li> 순간 접착제를 사용하여 vibratome의 시험편 홀더에 아가 블록을 붙인다. 하부가 상기 홀더에 부착 된 상태에서 망막 부분은, 그 표면에 상기 10mm 높은 블록의 위쪽 및 배향과 평행에 위치한다. </li><li> vibratome의 버퍼 트레이에 이전에 버블 에임스 &#39;매체를 부어 바로 블록을 커버. </li></ol> 수평 Vibratome 섹션 6. 준비 <ol><li> 절편 시작합니다. 망막 조직의 조각이 조각에 나타날 때까지 처음에 수동으로 슬라이스의 두께를 설정합니다. 다음 단계 2.3의 설정을 변경할 수 있습니다. 이후아가로 오스 블록 당 3 조각 - 마우스 망막은 더 이상 2보다가있을 것입니다, 약 200 μm의 두께이다. </li><li> 유리 막대와 버퍼 트레이에서 섹션을 제거하고 35mm 페트리 접시에 2 ml의 에임스 &#39;매체로 전송. </li><li> 바로 37 °의 C (5 % CO 55분의 2 %의 O 2)에서 인큐베이터에 보관 섹션. 섹션을 둘러싸는 아가 인큐베이터 고체 유지되고 망막을 손상시키지 않고 부분을 처리하기 위해 사용될 수있다. RT에서 산소 에임스 중형에 비해 각각의 분위기 내에서 37 ℃에서 보관시 더 슬라이스 품질이 얻어진다. 섹션 바로 사용하거나 우수한 생리 결과 인큐베이터에서 4 시간까지 저장 될 수있다. </li><li> 6 - 아가 로스를 반복 섹션 4에서 다음 망막 조각을 포함. </li></ol>

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	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세로 슬라이스와 달리 수평 무 축삭 세포 및 세포 등을 방사상 배향 뉴런의 수지상 형태가 잘 유지된다. 전체 망막 제제에 비해, 이들 세포 유형은 마이크로 전극에 대한 접근이 용이하고 전기 생리 두 이미징 기술에 의해 조사 할 수있다. 여기서는 외부 망막 집중; 그러나, 유사한 접근 방식은 특히 내부 망막 (10)의 무 축삭 세포가보고되고있다. 수평 슬라이...

시각 정보는 시각 활성화 동적 시공간 패턴으로 부호화되고, 감광체와 2 차 뉴런 사이의 시냅스 리본 시각 정보의 다운 스트림 전송을 결정한다. 포유류 망막의 수직 슬라이스 제조 즉 감광체 바이폴라 셀 사이, 및 바이폴라 전지 및 무 축삭 세포 1, 2, 3, 4의 일부 유형 사이에서 수직 통로에 신호 처리를 연구하는 매우 유용한 도구이다. 그러나, 수직 절편은 항상 시냅스 접촉의 상당한 손실로 이어지는, 많은 망막 신경 세포의 수지상 필드의 심각한 절단됩니다. 특히 외부 망막에, 수평 세포는 그들의 옆으로 퍼져 확장 된 수지상 필드와 축삭 터미널 시스템 (5)에 영향을 받는다. 수직에서슬라이스 제조 수평 셀의 돌기에 콘 감광체 단자 수백 시냅스 입력 따라서 약간 부족한 접촉 감소된다. 이것은 개별 시냅스의 특성을 연구하기에 충분할 수 있지만, 어떠한 수단은 감광체 리본 시냅스 동기 작동의 기초가되는 신호 처리 기능을 나타내는 않음으로써는 않는다. 따라서 우리는 그대로하고 기능적인 수평 세포의 수상 돌기에 거의 모든 콘 광 수용체의 시냅스 입력 잎 수평 슬라이스 준비를 개발했다. 절편 런 평면은 수평 적으로 무 축삭 세포와 세포 사이의 내부 핵 층을 절단하는 망막의 표면에 평행. 따라서, 외부 망막의 수평 슬라이스가 포함 생성, 시냅스 사이트, 시냅스 사이트의 내부 및 외부 세그먼트뿐만 아니라 시냅스 터미널, 수평 세포와 쌍극 세포 광 수용체. 이 준비는 잘 t을 적합오의 수지상 필드 내의 모든 콘 광 수용체에 의해 수평 세포의 수상 돌기에 통합 된 시냅스 입력을 조사합니다. 따라서 그것은 더 시냅스 반응에 감광체 활성화 매트릭스로부터 시각 정보 전송을위한 중요 감광체 리본 시냅스의 동작을 이해하는 데 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

세로 슬라이스 제제 아니라 성인 포유류 망막 회로 및 신호 전달을 연구하기 위해 설립된다. 이 제제에서 절편의 비행기는 광 수용체 및 양극성 세포와 같은 방사상 중심의 신경 세포의 연구에 이상적, 망막 표면에 수직이다. 그러나, 수평 세포, 넓은 필드 무 축삭 세포 및 신경절 세포의 큰 수지상 아버 이들 세포에서 현저하게 감소 시냅스 활성을두고 주로 절단된다. 신경절 세포 변위 무 축삭 세포는 망막의 전체 실장 준비 연구 될 수있는 반면, 수평 세포 및 내부 핵 층에있는 무 축삭 세포는 잘못 전체 망막 조직에 전극 용 접근 가능하다. 최대 접근성 시냅스 무결성을 달성하기 위해 마우스 망막의 수평 조각 제제를 개발 및 감광체 및 수평의 시냅스에서 신호 전송 공부세포. 수평 절편 수평 세포의 수상 돌기에 손상 및 기능 콘 시냅스 입력을위한 전제 조건으로, 전극 타겟팅 수평 세포 기관 (1) 간단하고 명확한 시각적 식별 및 확장 된 수평 세포 수지상 필드 (2) 보존 할 수 있습니다. 수평 조각에서 수평 세포는 어둠 속에서 토닉 시냅스 활성을 나타내, 그들은 안쪽으로 전류 감소 시냅스 활동의 감소와 빛의 섬광을 브리핑하는 반응. 면역 세포 화학 증거는 수평 세포의 수지상 분야 내에서 거의 모든 콘이 그 주변 수상 돌기과 시냅스를 설정을 나타냅니다. 수평 슬라이스 준비 따라서 잘 선택 시냅스에 걸쳐 수평으로 확장 망막 신경 세포의 생리 학적 특성뿐만 아니라 감각 신호 전송 및 통합을 연구하기에 적합합니다.

<html> 마우스 망막의 수평 슬라이스에서, 수평 세포 기관을 쉽게 다각형 세포체 (그림 1A)에서 나오는 여러 주요 수상 돌기과의 독특한 형태에 따라 식별 할 수 있습니다. 슬라이스의 표면 근처에있는 수평 세포 기관은 패치 클램프 전극 용 일상적으로 접근 할 수 있었다. 녹음하는 동안 세포는 밀접 그대로 마우스 망막 8 (그림 1B)의</strong...

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Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K 조회수.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다. 

비디오: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

망막의 수평 슬라이스 준비

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

연구

생물학

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

신경과학

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal cells in the murine split retina(쥐 분할 망막의 양극성 및 수평 신경 세포 연구)

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

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