This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali emessi dalla Repubblica federale di Germania. Nota: Poiché il tessuto retinico sarà privo di ossigeno durante prolungate parti di questa procedura, tutti i passaggi devono essere eseguiti più velocemente possibile. I topi dovrebbero essere adattata al buio di almeno 3 ore prima della dissezione. Per evitare la luce adattamento della retina, la preparazione e taglio deve essere effettuata sotto la luce rossa fioca. 1. Preparazione di media e altre sostanze chimiche <ol><li> Preparare Ames &#39;Medium 6. Dopo la dissezione, immergere il tessuto retinico in Medio Ames &#39;in ogni momento. <ol><li> Sciogliere 2,2 g di Ames &#39;Medium e 298 mg HEPES in 250 ml di acqua distillata. La concentrazione di HEPES sarà di 5 mM. Mescolare delicatamente fino a quando tutte le particelle sono dissolti. </li><li> Bubble Ames &#39;Piano a temperatura ambiente con CarboGen (95% di ossigeno, 5% autoanidride bon) per almeno 5 minuti. CarboGen di alimentazione con una pipetta Pasteur di vetro alla soluzione. Collegare la pipetta Pasteur tramite tubazione appropriata all&#39;uscita del regolatore di gas. </li><li> Aggiungere 475 mg di bicarbonato di sodio alla soluzione. L&#39;aggiunta di bicarbonato dopo gorgogliamento impedisce la precipitazione di carbonato di calcio. </li></ol></li><li> Preparare a bassa temperatura agarosio gelificazione. Agarosio è necessaria per l&#39;integrazione del tessuto retinico durante vibratome sezionamento. <ol><li> Sciogliere 180 mg agarosio in 9 ml di Ames &#39;Medium e 1 ml di acqua distillata. Utilizzare un forno a microonde per riscaldare lentamente la soluzione di agarosio fino a quando tutti i solidi sono dissolti. Il calore in 5 - 10 sec incrementi per evitare l&#39;overflow. Soluzione deve essere chiara e trasparente. </li><li> Conservare disciolto agarosio a bagnomaria a 37 ° C per la durata della procedura. </li></ol></li></ol> 2. Impostazione del Vibratome NOTA: Tutti sezionamento è stata effettuata con ilvibratome elencati nella tabella materiali. Le date impostazioni si riferiscono a questo tipo di solo vibratome. Per ulteriori dettagli su vibratomo sezionamento del tessuto neurale si rimanda per fare riferimento a 7. <ol><li> Posizionare vibratome lama iniettore nella porta lama. </li><li> Misurare deflessione verticale della lama con il dispositivo &quot;Vibrocheck&quot;. Utilizzare la vite di regolazione sul portalama per inclinare la lama finché non è parallela al piano di taglio. L&#39;esatto posizionamento della lama è necessario per prevenire effetti veneziane sulla superficie sezione e per produrre un tratto piano che contiene cellule viventi sulla sua superficie. </li><li> Impostare vibratome alle seguenti impostazioni: ampiezza, 1.00; Velocità, 0.20; spessore 180 - 200 micron. </li></ol> 3. La dissezione del mouse Retina <ol><li> Anestetizzare adulti C57BL / 6 del mouse per la vaporizzazione di circa 1 ml di isoflurano in un contenitore a tenuta d&#39;aria. Quando l&#39;anestesia è completa, l&#39;eutanasia degli animali da dislocazione cervicale. Ilmouse non dovrebbe essere più di 3 mesi, altrimenti la qualità delle fette peggiorerà. </li><li> Rimuovere bulbo oculare mettendo una pinza curva sotto l&#39;occhio. Delicatamente sollevare il bulbo oculare esporrà il nervo ottico. Tagliare il nervo ottico, con una forbice molla e trasferire la palla occhio di una capsula di Petri 35 millimetri contenente 2 ml di Ames &#39;Medium. </li><li> Eseguire tutti i passaggi successivi sul palco di un microscopio stereo. Regolare l&#39;ingrandimento ad un valore che consente il controllo visivo ottimale delle seguenti procedure (passi 3.4 - 3.9) si. </li><li> Forare la cornea al passaggio alla sclera con una pinza a punta o con un ago 20 G. Durante questa fase, ferma la palla con un altro occhio pinze. Fare attenzione a non danneggiare la retina con il dispositivo punzonamento. </li><li> Inserire le forbici primavera nel piccolo foro praticato nel punto 3.3 e tagliare un cerchio intorno alla cornea. Anche in questo caso, ferma la palla occhio con una pinza durante il taglio. Mantenere l&#39;incisione molto vicino alla superficie per non cut nella retina. </li><li> Rimuovere con attenzione cornea, lenti e corpo vitreo con una pinza. Il corpo vitreo comprende uno strato sottile trasparente nella parte posteriore dell&#39;occhio. Tuttavia, è essenziale per vibratome sezionamento che il corpo vitreo è completamente rimosso. </li><li> Nella capsula di Petri, posizionare l&#39;oculare in modo che si guarda attraverso il foro in basso sulla retina. Il bordo dell&#39;apertura dovrebbe consistere soltanto il tessuto sclerale. Se il taglio circolare (passo 3.4) è stata effettuata troppo vicino all&#39;equatore del oculare, tessuto retinico sarà presente anche vicino all&#39;incisione. Fate attenzione quindi a non danneggiare la retina al punto 3.8. </li><li> Afferra la sclera con una pinza e strappare con cura il tessuto a parte. È essenziale non rottura retina durante questa fase. Se necessario, staccare la retina dalla serrata per stabilizzare la parte sclerale del tessuto con le pinze e con attenzione si staccava la retina con le altre pinze. Mantenere la pinza chiusi; mai gestire il retina con una pinza in quanto il tessuto è molto morbido e darà atto immediatamente. NOTA: A questo punto, la retina e il resto della conchiglia oculare sarà collegato solo alla testa del nervo ottico. </li><li> Tagliare il sito di attacco alla testa del nervo ottico con le forbici a molla. La retina dovrebbe ora essere liberamente fluttuante in un unico pezzo di tessuto in media Ames &#39;. </li><li> Tagliare la retina in 4 - 6 piccoli rettangoli di circa 23 mm con una lama di bisturi curvo tenendo retina lungo i bordi con la pinza, per manipolare in posizione. Evitare di pizzicare il tessuto retinico all&#39;interno dei rettangoli. Dai pezzi delle parti centrali della retina, non la periferia lontano. </li><li> Trasferimento pezzi retinici con un grande diametro plastica pipetta Pasteur ad un piatto di plastica Petri 35 mm, il cui fondo è stato sostituito da una maglia con dimensione della griglia inferiore a 1 mm. Fissare la piastra di Petri nel terzo superiore di un matraccio becher o conica e immergere pezzi retiniche in bu Piano Ames &#39;bbled con CarboGen. </li></ol> 4. Integrazione di retina Pezzi in Agarosio <ol><li> Trasferire accuratamente 2 - 3 pezzi della retina in 35 mm piatto di plastica Petri insieme con alcuni dei Ames &#39;Medium. È più conveniente usare un grande diametro di plastica pipetta Pasteur per il trasferimento. In questa fase, l&#39;orientamento esatto dei pezzi retiniche non importa. </li><li> Rimuovere il più possibile del Piano rimanente Ames &#39;con una pipetta Pasteur di vetro. Non appena il liquido è stato rimosso procedere con passo 4.3. Non lasciare che la retina asciugare il tessuto. </li><li> coprire immediatamente pezzi della retina con 2 ml di agarosio disciolto (37 ° C). Date le dimensioni di cui al punto 3.10, i pezzi non rannicchiarsi all&#39;interno agarosio. </li><li> All&#39;interno agarosio liquido, spingere delicatamente pezzi retina al fondo della capsula di Petri. Lo strato di cellule gangliari deve essere rivolto verso il basso. Utilizzare un microscopio stereo per la sentenza della posizione esatta. Per il posizionamento, gestire pi retinaECE con una piccola spatola. Posizionare la retina più veloce e preciso possibile poiché l&#39;agarosio solidifica rapidamente. <ol><li> Disporre pezzi retinici paralleli al fondo del piatto di vetro; altrimenti sezioni saranno tangenziale o oblique. Singoli pezzi non dovrebbero toccare l&#39;un l&#39;altro, ma anche non dovrebbero essere troppo distanti. Prova a mettere pezzi della retina più o meno sullo stesso livello orizzontale. </li></ol></li><li> Mettere in vetro capsula di Petri con pezzi della retina incorporati in frigorifero (4-6 ° C) per almeno 2 minuti. Questo si indurisce rapidamente l&#39;agarosio per l&#39;ulteriore elaborazione. Non appena l&#39;agarosio si è polimerizzato procedere con il passaggio successivo. </li></ol> 5. Montaggio della retina Pezzi <ol><li> Rimuovere con attenzione il blocco di agarosio contenente pezzi retina dalla capsula di Petri. Utilizzare una spatola o un dispositivo simile per sollevare il blocco agarosio dal vetro. A causa di forze adesive, questo può rivelarsi molto difficile. Tuttavia, evitare di rompere ilblocco agarosio. Eseguire questo e tutti i successivi passaggi a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare il blocco di agarosio su un vetrino di vetro e regolarne le dimensioni con una lama di bisturi. Lasciare 1 - 2 mm di agarosio su ciascun lato dei pezzi retiniche. La dimensione finale del blocco dovrebbe essere di circa 1.066 millimetri (10 mm si riferisce all&#39;altezza del blocco, 6 mm per la lunghezza bordo). </li><li> Incollare il blocco di agarosio al titolare del campione del vibratome utilizzando un adesivo istantaneo. pezzi retiniche dovrebbero essere collocati nella parte superiore del blocco di alta 10 mm e orientata parallelamente alla sua superficie, mentre la parte inferiore è fissata al supporto. </li><li> Coprire il blocco immediatamente versando Media precedentemente bollito Ames &#39;nel cassetto del buffer della vibratome. </li></ol> 6. Preparazione orizzontale vibratome Sezioni <ol><li> Inizia sezionamento. Inizialmente, impostare lo spessore di tagliare manualmente fino frammenti di tessuto retinico appaiono nella fetta. Quindi modificare le impostazioni al punto 2.3. poiché latopo retina è solo di circa 200 micron di spessore, non ci saranno più di 2 - 3 fette per blocco di agarosio. </li><li> Rimuovere sezioni dal vassoio buffer con una bacchetta di vetro e trasferirli 2 ml Ames &#39;medie da 35 mm piastra di Petri. </li><li> Conservare sezioni immediatamente in un incubatore a 37 ° C (5% CO 2/55% O 2). L&#39;agarosio che circonda sezioni resterà solida in incubatrice e può essere utilizzato per gestire le sezioni senza danneggiare la retina. Migliore qualità fetta viene ottenuta quando immagazzinati a 37 ° C entro la rispettiva atmosfera rispetto a Media ossigenato Ames &#39;a RT. Le sezioni possono essere utilizzate immediatamente o possono essere memorizzati fino a 4 ore in incubatrice con buoni risultati fisiologici. </li><li> Incorpora prossimi pezzi della retina in agarosio e ripetere le sezioni 4 - 6. </li></ol>

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	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Contrariamente alle porzioni verticali, la morfologia dendritica dei neuroni orientate radialmente come cellule orizzontali e cellule amacrine è ben conservata. Rispetto ai preparati intere retina, questi tipi di cellule sono facilmente accessibili per microelettrodi e possono essere studiate da entrambe le tecniche elettrofisiologiche e di imaging. Qui, ci siamo concentrati sulla retina esterna; tuttavia, un approccio simile è stato segnalato in particolare per le cellule amacrine della retina interna <sup class="xre...

informazioni visive è codificata come un modello dinamico spazio-temporale dell&#39;attivazione fotorecettori, e la sinapsi nastro tra fotorecettori e neuroni di secondo ordine determina il trasferimento valle di informazioni visive. La preparazione fetta verticale della retina dei mammiferi è uno strumento molto utile per studiare l&#39;elaborazione del segnale nei percorsi verticali, cioè tra fotorecettori e cellule bipolari, e tra le cellule bipolari e alcuni tipi di cellule amacrine 1, 2, 3, 4. Tuttavia, sezionamento verticale determina sempre gravi troncamento dei campi dendritiche di molti neuroni della retina, con conseguente notevole perdita di contatti sinaptici. Soprattutto nella retina esterna, cellule orizzontali sono colpiti a causa delle loro campi dendritiche estesi lateralmente diffondersi e sistemi terminali assone 5. In verticalepreparazione fetta, l&#39;ingresso sinaptico di centinaia di terminali cono fotorecettori ai dendriti di una cellula orizzontale è così ridotto a un paio di contatti sparsi. Questo potrebbe essere sufficiente per studiare le proprietà delle singole sinapsi, ma lo fa in nessun modo rappresentano le capacità di elaborazione del segnale alla base l&#39;attivazione sincronizzata delle sinapsi nastro fotorecettori. Abbiamo quindi sviluppato una preparazione fetta orizzontale, che lascia quasi tutto il fotorecettore cono di ingresso sinaptica di dendriti di cellule orizzontali intatte e funzionali. Il piano di piste sezionamento parallela alla superficie della retina, idealmente taglio attraverso lo strato nucleare interno tra cellule orizzontali e le cellule amacrine. Così, fette orizzontali della retina esterna vengono creati contenenti, sul sito presinaptica, fotorecettori con segmenti interni ed esterni, nonché terminali sinaptici, e cellule orizzontali e cellule bipolari sul sito postsinaptico. Questa preparazione è adatto to indagare ingressi sinaptici coordinati in dendriti delle cellule orizzontali da tutti i fotorecettori cono all&#39;interno del suo campo dendritiche. E quindi potrebbe rivelarsi utile per comprendere meglio il funzionamento della sinapsi nastro fotorecettore, che è cruciale per il trasferimento di informazioni visive dalla matrice di attivazione dei fotorecettori in una risposta post-sinaptica.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

preparati fetta verticali sono ben stabiliti per studiare i circuiti e la trasmissione del segnale nella retina dei mammiferi adulti. Il piano di sezionamento in queste preparazioni è perpendicolare alla superficie della retina, che lo rende ideale per lo studio dei neuroni orientate radialmente come fotorecettori e cellule bipolari. Tuttavia, le grandi pergole dendritiche di cellule orizzontali, cellule amacrine in tutto il campo, e le cellule gangliari sono per lo più troncati, lasciando marcatamente ridotta attività sinaptica in queste cellule. Mentre le cellule gangliari e le cellule amacrine sfollati possono essere studiati in un preparato tutto montato della retina, cellule orizzontali e le cellule amacrine situate nello strato nucleare interno sono solo scarsamente accessibili per gli elettrodi in tutto il tessuto della retina. Per ottenere la massima accessibilità e l&#39;integrità sinaptica, abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di topo, e studiato la trasmissione del segnale alla sinapsi tra i fotorecettori e orizzontalecellule. sezionamento orizzontale consente (1) facile e univoca identificazione visiva dei corpi cellulari orizzontali per l&#39;elettrodo il targeting, e (2) la conservazione dei campi dendritiche cellule orizzontale estesa, come un prerequisito per integro e funzionale cono di ingresso sinaptico a dendriti delle cellule orizzontali. cellule orizzontali da fette orizzontali esposte attività sinaptica tonica nel buio, e hanno risposto a brevi lampi di luce, con una riduzione di attività sinaptica verso l&#39;interno attuale e diminuita. evidenza immunocitochimica indica che quasi tutti i coni nel campo dendritica di una cella orizzontale stabiliscono sinapsi con i dendriti periferici. La preparazione fetta orizzontale è quindi adatto per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni della retina distese orizzontalmente, nonché la trasmissione del segnale sensoriale e l&#39;integrazione attraverso le sinapsi selezionati.

<html> In fette orizzontali della retina di topo, corpi cellulari orizzontali potrebbero essere facilmente identificati in base alla loro morfologia unico con diverse dendriti primari emergono da un corpo cellulare poligonale (Figura 1A). corpi cellulari orizzontali situati vicino alla superficie della fetta sono stati regolarmente accessibili per gli elettrodi di patch-clamp. Durante le registrazioni, le cellule sono state riempite con un colorante fluorescente, riveland...

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Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Views.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging. 

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Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Slice preparazione orizzontale della Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neuroscienze

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Studio delle cellule neuronali bipolari e orizzontali nella retina divisa murina

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Autore in primo piano: Utilizzo della tecnica Split Retina per un accesso migliorato e esperimenti accelerati 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

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