Name: preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Tüm işlemler Federal Almanya Cumhuriyeti tarafından verilen hayvan deneyleri için kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. NOT: retinal doku bu prosedürün uzun aşamalarında oksijen yoksun olacağı için, tüm adımları olabildiğince hızlı yapılmalıdır. Fareler koyu adapte diseksiyon önce en az 3 saat olmalıdır. Retina, hazırlama adaptasyona önlemek ve dilimleme sönük kızıl ışık altında gerçekleştirilmelidir. Medya ve Diğer Kimyasallar 1. Hazırlık <ol><li> Ames Orta 6 hazırlayın. Diseksiyon sonra, her zaman Ames &#39;Orta retina dokusu batırmayın. <ol><li> Ames Ortama 2.2 g ve damıtılmış su, 250 ml 298 mg HEPES içinde çözülür. HEPES konsantrasyonu 5 mM olacaktır. Tüm parçacıkların çözünene kadar hafifçe karıştırın. </li><li> karbojen, oda sıcaklığında kabarcık Ames Orta (% 95 oksijen,% 5 araçen az 5 dakika boyunca bon dioksit). çözümün bir cam Pasteur pipeti ile Tedarik carbogen. Gaz regülatör çıkışına uygun boru aracılığıyla Pasteur pipeti bağlayın. </li><li> çözeltiye 475 mg sodyum-bikarbonat ekleyin. köpüren sonra bikarbonat eklenmesi kalsiyum karbonat çökmesini önler. </li></ol></li><li> Düşük jelleşme sıcaklığı agaroz hazırlayın. Agaroz vibratome kesit sırasında retina dokusunun gömmek için gereklidir. <ol><li> 9 mi Ames Ortamda 180 mg agaroz ve damıtılmış su, 1 ml içinde çözülür. tüm katılar çözülene kadar yavaşça agaroz çözeltisi ısıtmak için bir mikrodalga kullanarak. 5 Isı - 10 sn aralıklarla taşmasını önlemek için. Çözelti berrak ve saydam olmalıdır. </li><li> Mağaza prosedür süresince 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde agaroz eritilir. </li></ol></li></ol> 2. Vibratome kurma Not: tüm kesit ile gerçekleştirilmiştirVibratome Malzeme tabloda listelenmiştir. Verilen ayarlar yalnızca vibratome bu tür bakın. Nöral doku vibratome kesit ilgili daha fazla ayrıntı için 7 başvurmak bakınız. <ol><li> bıçak tutucu içine vibratome enjektör bıçağı yerleştirin. </li><li> &quot;Vibrocheck&quot; cihazı ile bıçak dikey sapmayı ölçün. o kesim düzlemine paralel olana kadar bıçak yatırmak için bıçak tutucu ayar vidasını kullanın. bıçağın gerçek konumlama bölümü yüzeyi üzerinde jaluzi etkilerini önlemek için ve yüzeyi üzerinde yaşayan hücreleri içeren düz bölümü üretilmesi için gereklidir. </li><li> Aşağıdaki ayarlara vibratome ayarlayın: genlik, 1.00; hız, 0.20; kalınlık, 180-200 um. </li></ol> Fare Retina 3. Diseksiyon <ol><li> hava geçirmez bir kapta yaklaşık 1 ml izofluran buharlaşma yoluyla yetişkin C57BL / 6 fare uyuşturan. Anestezi işlemi tamamlandığında, servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.Fare, aksi takdirde dilim kalitesi bozulacaktır, daha eski 3 ay olmamalıdır. </li><li> göz altında kavisli bir forseps koyarak göz topu çıkarın. Yavaşça optik sinir gösterecektir göz topu yukarı kaldırarak. Bir bahar makas ile optik siniri kesip ve 2 ml Ames Orta içeren 35 mm petri göz topu aktarın. </li><li> Stereo mikroskop sahnede tüm sonraki adımları uygulayın. Aşağıdaki prosedürler (- 3.9 3.4 adım) için en uygun görsel kontrol sağlayan bir değere büyütme ayarlayın. </li><li> sivri forseps ile sklera veya 20 G iğne geçiş de kornea delinme. Bu adım sırasında, başka bir forseps ile göz topu sabitleyin. delme cihazı ile retinaya zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Adım 3.3 yapılan küçük deliğe yaylı makas yerleştirin ve korneanın etrafında bir daire kesip. keserken Yine, forseps ile göz topu sabitleyin. c amacıyla yüzeye çok yakın değil kesi tutunretina içine ut. </li><li> Dikkatle forseps ile kornea, lens, vitreus cismin çıkarılması. vitreus gözün arka kısmına sadece ince şeffaf bir tabaka ihtiva eder. Bununla birlikte, camsı cisim tamamen kaldırılır kesit vibratome için gereklidir. </li><li> Petri kabı, bir aşağı retina üzerine delik bakar bir şekilde göz yuvasını yerleştirin. açıklığın jantının skleral doku, sadece oluşmalıdır. Dairesel kesim (adım 3.4) Göz yuvası ekvatora çok yakın yapılmış ise, retina dokusu da kesi mevcut yakın olacaktır. Adım 3.8 retinayı zarar vermemeye sonra dikkatli olun. </li><li> forseps ile sklerasına tut ve dikkatli bir şekilde birbirinden doku gözyaşı. Aşama sırasında retina yırtılmasına değil esastır. Gerekirse, forseps ile doku skleral kısmını steadying ve özenle diğer forseps ile retina soyularak ora serrata retina ayırın. forseps kapalı tutun; yeniden ele asladokuya beri forseps ile tina çok yumuşak ve yolu hemen verecektir. NOT: Bu aşamada, retina ve Göz yuvası geri kalanı sadece optik sinir başında bağlanacaktır. </li><li> yaylı makas ile optik sinir başında eki sitesini kesin. Retina artık serbestçe Ames Ortama doku tek parça olarak kayan olmalıdır. </li><li> pozisyon içine işlemek için, forseps ile kenarları boyunca retina tutarak kavisli bir neşter bıçak kullanarak yaklaşık 23 mm 6 küçük dikdörtgenler - 4 içine retina kesti. dikdörtgenler içinde retina dokusunun sıkışmaması. retina, çok uzak olmayan çevre orta kesimlerinde parçalara ayırın. </li><li> 35 mm plastik petri büyük çaplı plastik bir Pasteur pipeti ile Retinal parçalar, transfer alt olan 1 mm den daha az ızgara boyutu olan bir gözlü yapı ile ikame edilmiştir. Bir bardak ya da Erlenin üst üçte içinde Petri kabı düzeltmek ve Ames Orta met retina parçaları daldırınkarbojen bbled. </li></ol> Agaroz Retina Adet 4. gömülmesi <ol><li> Ames Orta bazı ile birlikte 35 mm plastik Petri kabı içine 3 retina adet - dikkatle 2 transfer. Transfer için büyük çaplı plastik Pasteur pipet kullanın en uygundur. Bu adımda, Retinal parçalar tam yönelimi önemli değildir. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kalan Ames Orta mümkün olduğu kadar çıkarın. En kısa sürede sıvı kaldırıldı olarak adım 4.3 ile devam edin. retinal doku kuru izin vermeyin. </li><li> Hemen agaroz eritilir, 2 ml (37 ° C) Retinal parçalar içermektedir. Adım 3.10 belirtilen büyüklüğü göz önüne alındığında, parçalar agaroz içinde kıvrılıp olmayacaktır. </li><li> Sıvı agaroz içinde yavaşça petri alt retina parçaları itin. Ganglion hücre tabakası aşağı dönük olmalıdır. Tam konumun yargı için bir stereo mikroskop kullanın. Konumlandırma için, retina pi koluKüçük bir spatula ile eces. Agaroz hızla katılaşır çünkü mümkün olduğunca hızlı ve hassas retina yerleştirin. <ol><li> Retinal parçalar, cam çanak tabanına paralel düzenlemek; Aksi takdirde bölümler teğet veya eğik olacaktır. Bireysel parçalar birbirine temas etmemelidir, ama aynı zamanda çok uzak olmamalı. Aynı yatay seviyede retina adet veya daha az yer çalışın. </li></ol></li><li> en az 2 dakika süreyle - (6 ° C 4) buzdolabı içine gömülü retina adet cam petri koyun. Bu hızla daha sonraki işlemler için agaroz donacaktır. En kısa sürede agaroz polimerize olduğu gibi bir sonraki adıma geçin. </li></ol> Retina Adet 5. montajı <ol><li> Dikkatle petri retina parçaları içeren agaroz bloğu kaldırmak. camdan agaroz blok kaldırmak için bir spatula veya benzeri bir cihazı kullanın. Nedeniyle yapışkan kuvvetleri, bu oldukça zor olduğu ortaya açabilirsiniz. Ancak, kırılma önlemekagaroz blok. Oda sıcaklığında bu ve sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> Bir cam lamel üzerinde agaroz blok yerleştirin ve bir neşter bıçağı ile boyutunu ayarlayın. Retinal parçalar, her bir yanı üzerinde agaroz 2 mm - 1 bırakın. bloğun son boyutu yaklaşık 1.066 mm olmalıdır (10 mm&#39;lik bir blok olarak, kenar uzunluğu 6 mm yüksekliğine karşılık gelir). </li><li> bir anlık yapıştırıcı kullanarak vibratome numune tutucu agaroz blok Tutkal. alt tutucu yapıştırılmıştır ise Retinal parçalar, yüzeyi 10 mm yüksekliğinde bloğun üst ve yönlendirilmiş paralel yer almalıdır. </li><li> vibratome tampon tepsisine önce kabarmış Ames &#39;Orta dökerek hemen bloğu örtün. </li></ol> Yatay Vibratome Bölüm 6. hazırlanması <ol><li> kesit başlayın. retina dokusunun parçaları dilim görünür kadar ilk başta, elle dilimleme kalınlığı ayarlayın. Sonra adım 2.3 ayarlara değiştirin. BeriAgaroz blok başına 3 dilim - fare retina en fazla 2 olacak, sadece yaklaşık 200 mikron kalınlığındadır. </li><li> bir cam çubuk ile tampon tepsisinden bölümleri çıkarın ve 35 mm petri 2 ml Ames Orta aktarabilirsiniz. </li><li> Hemen 37 ° C (% 5 CO 2/55% O 2) bir kuluçka makinesi içinde deposu bölümleri. bölümleri çevreleyen agaroz inkübatör katı kalacak ve retina zarar vermeden bölümleri işlemek için kullanılabilir. Oda sıcaklığında oksijenli Ames &#39;Orta kıyasla ilgili bir atmosfer içinde 37 ° C&#39;de muhafaza ederken daha dilim kalitesi elde edilir. Bölümler hemen kullanılabilir ya da iyi fizyolojik sonuçlar inkübatör 4 saat kadar saklanabilir. </li><li> 6 - agaroz ve tekrar Bölüm 4 sonraki retina parçaları göm. </li></ol>

<ol>
	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dikey dilimleri tersine, yatay bir hücre ve amacrine hücreleri gibi radyal olarak yönlendirilmiş nöronların dendritik morfolojisi iyi korunmuştur. Bütün retina hazırlıkları ile karşılaştırıldığında, bu hücre tipleri Mikroelektronlar için kolayca erişilebilir ve her ikisi de elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri ile ele alınabilir. Burada, dış retina üzerinde duruldu; Bununla birlikte, benzer bir yaklaşım, özellikle iç retina 10 amacrine hücreler için rapo...

Görsel bilgi fotoreseptör aktivasyon dinamik bir uzay-zamansal desen olarak kodlanmıştır, ve fotoreseptör ve ikinci dereceden nöronlar arasındaki şerit sinaps görsel bilgilerin aşağı transferini belirler. Memeli retina dikey dilim hazırlama yani fotoreseptör ve bipolar hücreler arasında, ve bipolar hücre ve amacrine hücre, 1, 2, 3, 4, bazı tipleri arasında dikey yollardaki sinyal işleme incelemek için çok değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yatay kesit her sinaptik temasların ölçüde kaybına yol açan bir çok retina nöronlarının dendritik alanlarının ciddi kesme neden olur. Özellikle dış retina, yatay hücreler nedeniyle yanal yayılan genişletilmiş dendritik alanları ve akson terminali sistemlerine 5 etkilenir. dikey olarakDilim Hazırlık, yatay bir hücrenin dentritlere konik fotoreseptör terminalleri yüzlerce sinaptik girişi böylece bir kaç seyrek temas düşürülür. Bu bireysel sinaps özelliklerini incelemek için yeterli olabilir, ancak hiçbir şekilde fotoreseptör şerit sinaps senkronize aktivasyonu altında yatan sinyal işleme yetenekleri temsil tarafından öyle. Bu nedenle sağlam ve fonksiyonel yatay hücre dendritler hemen hemen tüm koni fotoreseptör sinaptik girdi bırakır yatay dilim hazırlık geliştirdi. Kesit çalışır düzlemi ideal yatay hücreleri ve amacrine hücreleri arasındaki iç nükleer tabaka ile kesme, retina yüzeyine paraleldir. Bu nedenle dış retina yatay dilim içeren oluşturulur, presinaptik sahada, postsinaptik sahada, iç ve dış bölümlerin yanı sıra sinaptik terminallerinden ve yatay hücrelerin ve bipolar hücrelerle fotoreseptörler. Bu preparat, ayrıca t uygunduro kendi dendritik alanında tüm koni fotoreseptör yatay hücre dendritler içine koordineli sinaptik girişleri araştırmak. Böylece daha iyi bir postsinaptik tepki içine fotoreseptör aktivasyon matris görsel bilgi aktarımı için çok önemlidir fotoreseptör şerit sinaps, işleyişini anlamak yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

Dikey dilim hazırlıkları iyi yetişkin memeli retina devresi ve sinyal iletimi incelemek için kurulmuştur. Bu hazırlıklar içinde kesit düzlemi fotoreseptör ve bipolar hücreler gibi radyal yönelimli nöronların çalışma için idealdir, retina yüzeyine dik. Ancak, yatay hücreler, geniş alan amacrine hücreleri ve ganglion hücrelerinin büyük dendritik milleri bu hücrelerde belirgin azalma sinaptik aktivite bırakarak, çoğunlukla kesiliyor. ganglion hücrelerinin ve yerinden amacrine hücreleri retina bir bütün monte hazırlanmasında incelenebilir ise, yatay bir hücre ve iç nüklear tabakada bulunan amacrine hücreleri sadece zayıf bütün retina dokusu elektrotlar için erişilebilir. Maksimum erişilebilirlik ve sinaptik bütünlüğünü sağlamak için, biz fare retinanın yatay dilim hazırlık geliştirdi ve fotoreseptör ve yatay arasındaki sinaps sinyal iletimi okuduHücreler. Yatay kesit yatay hücre dendritler bozulmamış ve fonksiyonel koni sinaptik girişi için bir ön koşul olarak, elektrot hedefleme yatay hücre gövdeleri (1) kolay ve açık görsel kimlik ve genişletilmiş yatay hücre dendritik alanları (2) korunmasını sağlar. yatay dilimler arasından yatay hücrelerin karanlıkta tonik sinaptik aktivite göstermiştir, ve bunlar içe akım ve azalmış sinaptik aktivitenin bir azalma ile ışık çakmaları yanıt vermiştir. İmmünositokimyasal kanıtlar yatay hücrenin dendritik alanında hemen hemen tüm kozalakları onun çevresel dendritler ile sinaps kurmak olduğunu gösterir. Yatay dilim hazırlık nedenle de seçilmiş sinaps boyunca genişletilmiş retinal nöronların fizyolojik özelliklerini yanı sıra duyusal sinyal aktarımını ve entegrasyonu incelemek için uygundur.

<html> Fare retina yatay dilim, yatay hücre gövdeleri kolayca çokgen hücre gövdesi (Şekil 1A) çıkan çok sayıda primer dendritler ile eşsiz bir morfolojiye göre tespit edilebilir. dilim yüzeyine yakın yatay hücre gövdeleri patch-kelepçe elektrotlar için rutin erişilebilir. Kayıtları sırasında, hücreler yakın sağlam fare retina 8 (Şekil 1B) akson taşıyan yatay hücrelerin morfolojisi andıran Komplike den...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Görüntüleme.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil. 

Video: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biyoloji

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Murin bölünmüş retinada bipolar ve yatay nöronal hücrelerin incelenmesi

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişim ve Hızlandırılmış Deneyler için Bölünmüş Retina Tekniğini Kullanma 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler