This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

全ての動物実験および手順は、チューレーン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.外科プロシージャを設定<ol><li>手術前にオートクレーブ機器、手術用消耗品、および文化用品。各ラットに対する外科用品が含まれます：1ドレープ、プレカット穴に1ドレープを（0.5インチ×1.5で）中央に、ガーゼパッド、および1吸収性アンダーパッド。手術器具が含まれます：数10ブレードで1メス、ピンセットの2ペア、および微細なハサミを。文化用品が含まれます：1ドレープ、ピンセットの1組、およびポリカーボネートフィルターで6ウェルプレートのインサートを用意しています。 </li><li>プレキシガラスのプラットフォーム、外科的なステージと70％エタノールで手術用卓上スペースを滅菌します。使用するまで無菌ボウルに外科的ステージを保管してください。 <ol><li> 100ミリメートル培養皿の中央に穴中1により約2で穿孔することによって、外科的ステージを作成します。次に、滑らかにするためにサンドペーパーを使用任意のシャープなエッジとは、組織のための隆起表面を作成するために、穴のエッジにシリコーン接着剤の層を追加します。 </li><li>代替的に、CADソフトウェアを使用して外科的ステージを設計し、3-D印刷（ 図1）によって行います。 </li></ol></li><li>ダウン滅菌吸収性アンダーパッドを配置し、その上にプレキシガラスのプラットフォームを築きます。吸収性アンダーパッドの隣に加熱パッド上で、プレカット穴なしで、ドレープを配置します。 </li><li>前加温滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、37°C​​にメディアおよび生理食塩水。独立した培養皿に入れメディアとPBS加熱パッドの上、手術のセットアップの隣に50 mLのコニカルチューブに生理食塩水を配置します。 </li><li>すべてのパッケージは、すべての材料の滅菌処理を確実にするために、手術の開始に先立って開かれていることを確認します。この手順で使用する一般的なツールの完全なリストは、に記載されています 具体的な外科材料とツールの表 。 </li></ol> 2. MesenterY組織の収穫<ol><li>使用大人の雄Wistarラット（350±25グラム; 6 - 8週齢）。他の株およびラットの年齢を置換することができます。 </li><li>ケタミン（80 mg / kg体重）およびキシラジン（8 mg / kg体重）の筋肉内注射によりラットを麻酔。ラットが反射反応を確認するために足の指の間につまんで麻酔下であることを確認。どれがあってはなりません。このターミナル手続きのための先制鎮痛は必要ありません。 </li><li>腹部を剃ると脱毛クリームを使用して残りの毛を取り除きます。ポビドンヨードに続く70％イソプロピルアルコールで二回腹部の皮膚を拭いてください。ワイプのために、外科医は、手術部位の中心に開始すべきであると以前に滅菌ガーゼまたは滅菌綿棒の同じ部分でスクラビングされた領域を重ならないように円形に準備されたエリアの外に移動します。その後、無菌手術用セットアップに動物を転送し、プレキシガラスプラットの上に置きます形。 </li><li>胸骨下の1を開始し、腸の切開で1.25 - メスの刃を使用して、0.75を作ります。腸や腸間膜（皮膚の1層、結合組織の1層、および筋肉の1層）を穿刺しないように注意してください。 </li><li>切開オーバープレカット穴とドレープを配置し、ドレープの上に無菌手術用のステージを配置します。開口部は切開部と整列することを確認してください。外科的ステージ開口部を通って回腸を見つけて引き出しを滅菌綿棒アプリケータを使用してください。 </li><li>綿棒アプリケーターを使用してステージを8腸間膜Windows、およびWindows（ 図1）には触れないように気をつけて- 6を引き出します。組織は、通常、盲腸の近く始まる小腸の回腸の領域から採取されます。ソリューションを滴下し、無菌注射器を使用して、必要に応じて加温した滅菌生理食塩水で湿った露出された組織を保管してください。 </li><li>ペントバルビタールナトリウム（ラット当たり0.2 mL）を心臓内注射を介してラットを安楽死させます。私を削除する前にsenteric窓は、ラットが心を触診によって安楽死させていることを確認します。何のパルスがあってはなりません。 </li><li>ウィンドウをカットする脂肪パッドと細かいハサミをつかむためにピンセットを使用することによって、所望の腸間膜組織を削除します。窓周りの脂肪（2ミリメートル）の境界線を残します。メディアで一度温めた滅菌PBSで一度組織を洗浄し。 </li><li>腹腔に体外回腸を戻し、施設のガイドラインに従って動物を処分。 </li></ol>タイムラプス研究3.腸間膜組織培養<ol><li>無菌層流フードへの転送オートクレーブ処理培養用品（1.1節を参照）や組織。 </li><li>ポリカーボネートフィルター膜の上に、各組織を転送するためにピンセットを使用してください。血管系の損傷を防ぐために、脂肪パッドによって組織をつかみます。 </li><li>迅速ウィンドウに触れないように注意しながら、脂肪パッドを使用して、組織を広げます。 6ウェルプレートの底部に組織とインサートを反転し、メディアの3ミリリットル（ 図1でカバー</st栄&gt;）。この手順のために使用される典型的な培地は、1％のペニシリンストレプトマイシン（PenStrep）及び10％ウシ胎児血清（FBS）を有する最小必須培地（MEM）を含みます。メディアは、血管新生を刺激する他の血清および/または成長因子を補充することができます。 </li><li>までの5日間、標準的なインキュベーター条件の各組織と文化のための3.3（5％CO 2、37℃） -繰り返して、3.2を繰り返します。 </li></ol>腸間膜組織の4タイムラプスイメージング<ol><li>イメージングの日に、共役BSIレクチンで各ウェルに培地を補充し、30分間の標準的な培養条件下でインキュベートします。レクチンを含まない培地で二回組織を洗ってください。 BSI-レクチン染色は、培養中の最大3日間腸間膜組織に表示されたままになります。 </li><li>顕微鏡ステージにプレートを転送します。その形態やネットワーク構造に基づいて、血液やリンパ管を識別します。 </li><li>各組織上の所望のネットワーク領域を見つけて、画像を撮影します。イメージングのメモを取ります同じ領域を確保するための場所が、後続のイメージのためにキャプチャされます。電動ステージを使用している場合、座標を文書化します。 </li><li>インキュベーターに組織を戻し、所望の最終地点まで培養を続けます。希望の実験の時点に応じて、必要に応じて4.3 - 繰り返し、4.1を繰り返します。 </li></ol> 5.組織免疫標識<ol><li> BSI-レクチンラベリング <ol><li>メディアを有する2つのすすぎに続いて培地中1：40 FITC結合レクチン（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）を用いて37℃で30分間組織をインキュベートします。リンスの場合は、メディアを追加した後、すぐに交換してください。 </li></ol></li><li> ライブ/デッドラベリング <ol><li> 1 37℃で10分間組織をインキュベート500 2mMのエチジウムホモダイマー1及び1：メディアを有する2つのすすぎに続いて、メディア500、1mMのカルセインAM（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）。 </li></ol></li><li> BSI-レクチン/ NG2ラベリング <ol><li>スライドし、顕微鏡での組織を広げますE（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 100ウサギポリクローナルNG2抗体および5％正常ヤギ血清（NGS）：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 100ヤギ抗ウサギCY2結合抗体（GAR-CY2）および5％NGS：二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。リンスのために、PBSを追加し、すぐに交換してください。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSで組織およびグリセロール溶液と場所のカバースリップをカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAMラベリング<ol><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> 200マウスモノクローナルビオチン化CD31抗体と1：一次抗体の標識のために1ながら室温で1時間、組織をインキュベート100ウサギポリクローナルLYVE-1抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 5％NGS 。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAR-CY2：500 Cy3結合ストレプトアビジン抗体および1。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> 50:50 PBSとグリセロール溶液でスライド、カバー組織をマウントして、上にカバースリップを配置します。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> BrdU / BSI-レクチンラベリング <ol><li>メディアへの1mg / mLのBrdUのを追加し、BrdUの溶液で組織メディアを交換。 37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> 37℃で1時間、2 M HCl中の組織DNAを変性させます。 PBS + 0.1％サポニン（3×10分）で組織を洗います。 </li><li> PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100モノクローナルマウス抗BrdU：一次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体標識のために、1を室温で1時間、組織をインキュベート100ヤギ抗マウスCy3結合抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS中（GAM-のCy3）を。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li&gt;をPBSで2回リンスに続いてPBSで1：40 FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li><li> BSI-レクチン/ CD11bのラベリング <ol><li>顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。 </li><li> -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li> PBSで100マウス抗ラットのCD11b + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。 </li><li>二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAM-のCy3。 PBSで組織を洗います+ 0.1％サポニン（3×10分）。 </li><li> PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。 </li><li>スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは、微小血管ネットワークの成長のタイムラプスイメージングのためのex vivoでのツールとしてラットの腸間膜培養モデルを使用するための方法を提示します。我々の研究室での以前の研究は、1のための我々のモデル）、血管新生8、2）リンパ管8、3）周皮細胞-内皮細胞の相互作用8、および4）抗血管新生薬物検査<sup...

微小血管ネットワークの成長とリモデリングは、組織機能のための共通の分母、創傷治癒、および複数の病状であり、重要なプロセスは、既存の1、2から新たな血管の成長として定義され、血管形成です。組織は新しい血管を設計するか、血管新生に基づく治療を設計するため、血管新生に関与する細胞のダイナミクスの重要性を理解することが重要です。しかしながら、この方法は複雑です。これは、微小血管ネットワーク内の特定の位置で変化し、複数の細胞型（ 例えば 、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、マクロファージ、幹細胞）と、複数のシステム（リンパ管ネットワーク及びニューラルネットワーク）を含むことができます。 in vitroモデルは、血管新生3に関与する異なるセル間の関係を調べることに大いに貢献してきたが、それらの生理学的関連性はtheiのために弱体化することができます<html>限られた複雑さと、彼らは密接にin vivoでのシナリオを反映していないという事実rを。これらの制限、三次元培養系3、 エクスビボ組織モデル4を克服するために、マイクロ流体システム5、6、および計算モデル7は、近年開発され導入されています。しかし、無傷の微小血管ネットワークエクスビボでの血管形成を調査するタイムラプス機能を持つモデルの必要性が依然として存在します。複雑さのレベルの血管新生研究のための新たなタイムラプスモデルの確立は、血管新生を調節する根底にあるメカニズムを理解し、治療法を改善するための貴重なツールを提供します。 無傷の微小血管ネットワークを介して血管新生のex vivoでの調査を可能にする潜在的なモデルは、ラット腸間膜培養モデルであります&gt; 8。最近の研究では、血液とリンパ微小血管ネットワークは培養後に生存し続けることが実証されています。さらに重要なことは、ラット腸間膜培養モデルは、機能的な周皮細胞 - 内皮細胞の相互作用、血液およびリンパ管内皮細胞コネクション、タイムラプス撮影を調査するために使用することができます。本稿の目的は、タイムラプスイメージング法のために私たちのプロトコルを提供することです。当社の代表的な結果は、血清と血管新生の刺激後に生き続けると組織特異的血管新生反応と同様に内皮細胞追跡研究を定量化するため、このメソッドの使用例を提供する複数の細胞型を文書化します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:165px;">Drape</td>
			<td style="width:183px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:132px;">4012</td>
			<td style="width:199px;">12&#8221;x12&#8221; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Scalpel Handle</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td style="width:199px;">Scalpel Handle, #3; Solid; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Surgical Blade</td>
			<td>Cincinnati Surgical</td>
			<td>0110</td>
			<td>Stainless Steel; Size 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>10/Sleeve</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:165px;">Graefe Forcep (curved tweezers)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td style="width:199px;">Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Graefe Forcep (straight tweezers)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td style="width:199px;">Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:165px;">Noyes Micro Scissor</td>
			<td style="width:183px;">Roboz Surgical Instrument</td>
			<td style="width:132px;">RS-5677</td>
			<td style="width:199px;">Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; 
			Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2&#34; Overall Length</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Gauze Pads</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td style="width:199px;">Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4&#34;x4&#34; 12-Ply</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Cotton-Tippled Applicators</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td style="width:199px;">6&#34; Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">6-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-49</td>
			<td style="width:199px;">Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Syring 5ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td>Luer-Lok Tip</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Sterile Bowl</td>
			<td>Medical Action Industries Inc.</td>
			<td>01232</td>
			<td style="width:199px;">32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:165px;">6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z681792-3EA</td>
			<td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Polycarbonate Filter Membrane</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TMTP04700</td>
			<td style="width:199px;">Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&#160;&#181;m, 47&#160;mm, White Plain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Beuthanasia</td>
			<td style="width:183px;">Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 011168</td>
			<td style="width:199px;">Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Ketamine</td>
			<td style="width:183px;">Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 000680</td>
			<td>Kateset 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 000680</td>
			<td>Anased 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td style="width:183px;">Baxter</td>
			<td>2F7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11095080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Saponin&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S7900-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Povidone-Iodine</td>
			<td>Operand</td>
			<td>82-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">FITC-conjugated Lectin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L9381-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PECAM (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LYVE-1 Antibody</td>
			<td>AngioBio Co.</td>
			<td>11-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-585-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-227-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Clone Bu20a</td>
			<td>Dako</td>
			<td style="width:132px;">M074401-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Rat CD11b&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA275R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks

血管新生は、既存の血管か​​らの新たな血管の成長として定義され、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、及びリンパ管および神経との調整を含みます。マルチセル、マルチシステムの相互作用は、生理学的に関連する環境における血管形成の調査を必要とします。 in vitro細胞培養モデルの使用は、機械的な洞察を提供してきつつ、一般的な批判は、それらが微小血管ネットワークに関連する複雑さを再現しないことです。このプロトコルの目的は、培養ラット腸間膜組織における血管新生の刺激の前と後に無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。培養組織は、その階層を維持する微小血管ネットワークが含まれています。免疫組織化学的標識化は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、血管およびリンパ管の存在を確認します。でdditionは、BSI-レクチンと組織を標識すると、増加した毛細血管の発芽と血管密度によって特徴づけられる血清または成長因子刺激の前と後に、ローカルネットワーク領域の経時比較を可能にします。一般的な細胞培養モデルと比較すると、この方法は、内皮細胞系統の研究および生理学的に関連する微小血管ネットワークにおける組織特異的血管新生薬物評価のためのツールを提供します。

培養3日後、組織を、ラット腸間膜培養モデル（ 図2A）で微小血管系の生存能力を実証するために生/死生存率/細胞毒性キットを用いて標識しました。腸間膜中に存在する細胞の大部分は、内皮細胞が微小血管セグメントにおけるそれらの位置に基づいて同定された培養物中で生存可能のままでした。内皮細胞増殖はまた、レクチン/ BrdU標識（ 図2D）...

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An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

6.8K ビュー.  Tulane University. Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis. 

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

発生生物学

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em&gt;例OVO</emニワトリ初期胚の&gt;タイムラプスイメージング

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...