Name: an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Alle Tierversuche und Verfahren wurden von der Tulane University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. 1. Chirurgisches Verfahren einrichten <ol><li> Autoklav Instrumente, chirurgische Versorgung und Kultur liefert vor der Operation. Chirurgische Versorgung für jede Ratte umfassen: 1 Tuch, 1 drapieren mit vorgeschnittenen Loch (0,5 Zoll x 1,5 Zoll) in der Mitte, Gazekompressen und 1 saugfähige Unterlage. Chirurgische Instrumente umfassen: 1 Skalpell mit einer Reihe 10 Klinge, 2 Paar Pinzette, und ein Paar von einer feinen Schere. Kultur Lieferungen umfassen: 1 Tuch, 1 Pinzette und vorbereitet 6-Well-Platte Einsätze mit Polycarbonat-Filtern. </li><li> Sterilisieren eine Plexiglas-Plattform, eine chirurgische Bühne und eine chirurgische Benchtop Raum mit 70% Ethanol. Halten Sie die OP-Stufe in einer sterilen Schale bis zum Gebrauch. <ol><li> Erstellen Sie eine chirurgische Bühne durch einen etwa 2 in von 1 in Loch in der Mitte einer 100 mm Kulturschale zu bohren. Als nächstes verwenden Schmirgelpapier glättenScharfe Kanten und eine Schicht aus Silikonkleber auf die Kanten des Lochs fügen Sie eine erhabene Oberfläche für die Gewebe zu schaffen. </li><li> Alternativ entwerfen die chirurgische Phase CAD - Software und von 3-D - Druck (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Legen Sie eine sterile saugfähige Unterlage nach unten und legen ein Plexiglas-Plattform oben drauf. Legen Sie das Tuch, ohne ein vorgeschnittenes Loch, über eine beheizte Pad neben dem absorbierenden underpad. </li><li> Pre-warmer steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Medien und Kochsalzlösung auf 37 ° C. Ort Medien und PBS in getrennten Kulturschalen oben auf dem Heizkissen und Stelle saline in einem 50 ml konischen Röhrchen neben der chirurgischen Einrichtung. </li><li> Sicherstellen, dass alle Pakete vor dem Beginn der Operation geöffnet werden sterile Handhabung aller Materialien zu gewährleisten. Eine vollständige Liste der gemeinsamen Werkzeuge in diesem Verfahren verwendet werden, in der aufgelistet Tabelle der spezifischen chirurgischen Materialien und Werkzeuge. </li></ol> 2. Mesentery Tissue Ernte <ol><li> Verwenden erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (350 ± 25 g; 6 - 8 Wochen alt). Andere Stämme und Alter der Ratten kann ersetzt werden. </li><li> Anästhesieren die Ratte über eine intramuskuläre Injektion von Ketamin (80 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (8 mg / kg Körpergewicht). Bestätigen Sie die Ratte unter Narkose ist zwischen den Zehen durch Kneifen für eine Reflexantwort zu überprüfen; sollte es keine geben. Präemptive Analgesie für dieses Terminal Verfahren ist nicht erforderlich. </li><li> Rasieren Sie den Bauchbereich und entfernen Sie restlichen Haare mit Haarentfernungs-Creme. Wischbauchhaut zweimal mit 70% igem Isopropylalkohol gefolgt von Povidon-Iod. Für die Wischtücher in der Mitte der Operationsstelle beginnen und so überlappen, um keine Bereiche in einer kreisförmigen Weise nach außen des vorbereiteten Bereichs bewegen, die zuvor mit dem gleichen Stück steriler Gaze oder steriles Wattestäbchen geschrubbt der Chirurg sollte. Dann übertragen Tier zum sterilen OP-Setup und legen oben auf dem Plexiglas platbilden. </li><li> Mit einem Skalpell, machen Sie eine 0,75 in - 1,25 in Einschnitt im Darm ab dem 1. in unterhalb des Brustbeins. Achten Sie darauf, nicht den Darm oder Gekröse (1 Schicht der Haut, 1 Schicht von Bindegewebe und 1 Muskelschicht) zu durchstechen. </li><li> Legen Sie ein Tuch mit einem vorgeschnittenen Loch über den Einschnitt und legen Sie eine sterile OP-Bühne oben auf dem Tuch. Sicherstellen, dass die Öffnung steht im Einklang mit dem Einschnitt. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen zu lokalisieren und das Ileum durch die chirurgische Bühnenöffnung herausziehen. </li><li> Ziehen Sie 6 - 8 mesenterialen Fenster , durch die Bühne mit Wattestäbchen, und darauf achten , nicht die Fenster zu berühren (Abbildung 1). Gewebe werden typischerweise aus dem Ileum Bereich des Dünndarms ausgehend in der Nähe des Blinddarms geerntet. Halten Sie ausgesetzt Gewebe feucht mit erwärmter steriler Kochsalzlösung als eine sterile Spritze erforderlich unter Verwendung der Lösung tropft. </li><li> Euthanize die Ratte über Intrakardial von Pentobarbital - Natrium (0,2 ml pro Ratte). Vor mir Entfernensenteric Fenster, sicherstellen, dass die Ratte durch Palpation des Herzens eingeschläfert wird; es sollte kein Impuls sein. </li><li> Entfernen gewünschte Gekröse Gewebe durch Pinzette mit dem Fettpolster und einer feinen Schere zu greifen, das Fenster zu schneiden. Lassen Sie eine Grenze von Fett (2 mm) rund um das Fenster. Waschen Sie Gewebe einmal in erwärmte sterile PBS und einmal in den Medien. </li><li> Zurück exteriorisierten Ileum in die Bauchhöhle und entsorgen Tier gemäß gültiger Richtlinien. </li></ol> 3. Mesentery Gewebekultur für Zeitrafferstudien <ol><li> Transfer autoklaviert Kultur liefert und Gewebe zu einer sterilen Laminar-Flow-Haube (siehe Abschnitt 1.1). </li><li> Verwenden einer Pinzette jedes Gewebe auf einem Polycarbonat-Filtermembran zu übertragen. Schnappen Gewebe durch das Fettpolster zu vermeiden, dass die Gefäße schädigen. </li><li> Schnell verbreitete das Gewebe, das die Fettpolster verwenden, wobei darauf geachtet, das Fenster nicht zu berühren. Kehren Sie die Einlage mit dem Gewebe in den Boden einer 6-Well - Platte geben und mit 3 ml Medium (Abbildung 1 </strong&gt;). Typische Medien für dieses Verfahren verwendet wird, umfasst Minimum Essential Medium (MEM) mit 1% Penicillin Streptomycin (PenStrep) und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Medien können mit anderen Seren und / oder Wachstumsfaktoren, die Angiogenese zu stimulieren, ergänzt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 für jedes Gewebe und Kultur in Standard - Inkubator Bedingungen (5% CO 2, 37 ° C) für bis zu 5 Tage. </li></ol> 4. Time-Lapse-Imaging von Mesentery Tissue <ol><li> Am Tag der Bildgebung, ergänzen die Medien in jeder Vertiefung mit konjugierten BSI-Lektin und unter Standardkulturbedingungen für 30 min inkubiert. Waschen Sie Gewebe zweimal mit Lektin-freien Medien. BSI-Lektin Fleck auf dem Gekröse Gewebe für bis zu 3 Tage in der Kultur sichtbar bleiben. </li><li> Übertragen Sie die Platte zu einem Mikroskoptisch. Identifizieren Sie Blut- und Lymphgefäße auf der Grundlage ihrer Morphologie und Netzstruktur. </li><li> Suchen Sie eine gewünschte Netzbereich auf jedem Gewebe und nehmen Bilder. Beachten Sie die BildgebungLage die gleiche Region zu gewährleisten wird für nachfolgende Bilder aufgenommen werden. Wenn eine motorisierte Bühne verwenden, dokumentieren die Koordinaten. </li><li> Zurück Gewebe in den Inkubator und weiter zu Kultur, bis der gewünschte Endpunkt. Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,3 je nach Bedarf, je nach gewünschten experimentellen Zeitpunkten. </li></ol> 5. Gewebeimmunmarkierung <ol><li> BSI-Lektin Labeling <ol><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei 37 ° C mit 1.40 FITC-konjugiertem Lektin in Medien (2,5 ml Antikörperlösung pro Well in 6-Well-Platte) durch zwei Spülungen mit Medien folgt. Für Spülungen, fügen Sie Medien und dann sofort zu ersetzen. </li></ol></li><li> Live / Dead Labeling <ol><li> Inkubieren Gewebe für 10 min bei 37 ° C mit 1: 500 2 mM Ethidium Homodimer-1 und 1: 500 1 mM Calcein AM in Medium (2,5 ml Antikörperlösung pro Well in 6-Well-Platte) durch zwei Spülungen mit Medien folgt. </li></ol></li><li> BSI-Lektin / NG2 Labeling <ol><li> Spread Gewebe auf einem Mikroskop geschobene (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 Kaninchen-polyklonalen Antikörper NG2 und 5% normalem Ziegenserum (NGS). Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 goat anti-rabbit CY2-konjugiertem Antikörper (GAR-CY2) und 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. Für Spülungen, fügen PBS und dann sofort zu ersetzen. </li><li> Um die Folien montieren, decken Gewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Labeling<ol><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 200 monoclonalen Maus-biotinyliertem CD31-Antikörper und 1: 100 Kaninchen polyklonalen LYVE-1-Antikörper in PBS + 0,1% Saponin + 2% Rinderserumalbumin (BSA) + 5% NGS . Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 500 CY3-konjugiertem Streptavidin-Antikörper und 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und setzen Sie ein Deckglas an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-Lektin Labeling <ol><li> 1 mg / ml BrdU auf Medien und Gewebemedien mit BrdU-Lösung zu ersetzen. bei 37 ° C für 2 h inkubiert. </li><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS (3 x 10 min). </li><li> Gewebe DNA in 2 M HCl für 1 h bei 37 ° C denaturieren. Waschen Gewebe in PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 monoklonaler Maus-anti-BrdU in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 Ziegen- anti-Maus-Cy3-konjugiertem Antikörper (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li&gt; Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li><li> BSI-Lektin / CD11b Kennzeichnung <ol><li> Verbreiten Sie Gewebe auf einem Objektträger (1 - 2 Gewebe / Folie) und trocknen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Fett mit einem Skalpell durch Drücken Sie fest nach unten um das Fett zu auszuschneiden. </li><li> Fix Gewebe in kaltem Methanol 30 Minuten bei -20 ° C. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für die primäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100-Maus-anti-Ratten-CD11b in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Gewebe mit PBS + 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Für sekundäre Antikörpermarkierung inkubieren Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur mit 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% Saponin + 2% BSA + 5% NGS. Waschen Sie Gewebe mit PBS+ 0,1% Saponin (3 x 10 min). </li><li> Inkubieren Gewebe für 30 min bei Raumtemperatur mit 01.40 FITC-konjugiertem Lektin in PBS, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. </li><li> Zur Montage Träger, Deckgewebe mit 50:50 PBS und Glycerin-Lösung und Eindecken an der Spitze. Verschließen Sie die Dia Kanten mit Nagellack. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieses Protokoll dokumentiert ein Verfahren zur Verwendung der Ratte Gekröse Kulturmodell als Ex - vivo - Werkzeug für Zeitraffer-Bildgebung von mikrovaskulären Netzwerk Wachstum. Frühere Arbeiten in unserem Labor wurde für 1) Angiogenese 8, 2) Lymphangiogenese 8, 3) pericyte-Endothel-Interaktionen 8, die Verwendung unseres Modells etabliert und 4) anti-angiogenen Drogen - Test - 9. Die Fähigkeit zum A...

Die mikrovaskuläre Netzwerk Wachstum und Umbau sind gemeinsame Nenner für die Gewebefunktion, Wundheilung, und mehrere Pathologien und ein Schlüsselprozess ist die Angiogenese, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden 1, 2. Für das Tissue Engineering neue Schiffe oder angiogenen Therapien entwerfen, das Verständnis der Bedeutung der zellulären Dynamik an der Angiogenese beteiligt ist kritisch. Jedoch ist dieses Verfahren komplex. Es kann an spezifischen Stellen innerhalb einer mikrovaskulären Netzwerk variieren und mehrere Zelltypen (zB endothelialen Zellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Makrophagen, Stammzellen) beinhaltet und mehrere Systeme (lymphatischen Netze und neuronale Netze). Obwohl in vitro Modellen enorm , um die Beziehung zwischen verschiedenen Zellen beigetragen haben , bei der Angiogenese 3, deren physiologische Relevanz beteiligt Prüfung kann aufgrund thei untergraben<html> begrenzter Komplexität r und die Tatsache , dass sie eine in vivo - Szenario nicht genau reflektieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, dreidimensionale Kultursysteme 3, ex vivo - Gewebemodelle 4, mikrofluidische Systeme 5, 6 und Rechenmodelle 7 wurden in den letzten Jahren entwickelt und eingeführt. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf für ein Modell mit Zeitraffer Fähigkeit zur Angiogenese in intakten mikrovaskulären Netzwerke ex vivo zu untersuchen. Der Aufbau neuer Zeitraffer-Modelle für die Angiogenese-Studien mit diesem Grad an Komplexität wird ein unschätzbares Werkzeug zur Verfügung stellen, die zugrunde liegenden Mechanismen regulieren die Angiogenese und zur Verbesserung der Therapien zu verstehen. Ein mögliches Modell, das die Ex - vivo - Untersuchung der Angiogenese in einem intakten mikrovaskulären Netzwerk ermöglicht , ist die Kulturmodell Ratte Gekröse&gt; 8. In einer neueren Arbeit haben wir gezeigt, dass Blut-und lymphatischen mikrovaskuläre Netzwerke nach Kultur lebensfähig bleiben. funktionellen pericyte-Endothel-Interaktionen zu untersuchen, Blut-und lymphatischen endothelialen Zellverbindungen und Zeitraffer-Bildgebung Noch wichtiger ist, kann die Ratte Gekröse Kulturmodell verwendet werden. Das Ziel dieser Arbeit ist unser Protokoll für den Zeitraffer-Bildgebungsverfahren bereitzustellen. Unsere repräsentative Ergebnisse dokumentieren die mehrere Zelltypen, die mit Serum nach der Stimulation der Angiogenese lebensfähig bleiben und bieten Beispiele für die Verwendung dieser Methode für gewebespezifische angiogene Antworten sowie Endothelzellen Tracking-Studien zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&amp;rdquo; x 12&amp;rdquo; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Scalpel Handle, #3; Solid; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Sterile Surgical Blade</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Stainless Steel; Size 10</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (curved tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (straight tweezers)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5130</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4&quot; Length</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;&lt;br/&gt; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2&quot; Overall Length</td></tr><tr><td>Gauze Pads</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4&quot; x 4&quot; 12-Ply</td></tr><tr><td>Cotton-Tippled Applicators</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6&quot; Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td></tr><tr><td>6-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td></tr><tr><td>Sterile Syring 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td></tr><tr><td>6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td><td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td></tr><tr><td>Polycarbonate Filter Membrane</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&amp;nbsp;&amp;micro;m, 47&amp;nbsp;mm, White Plain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine</td><td>Operand</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Lectin</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Antibody</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&#039;-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Rat CD11b&amp;nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks

Angiogenesis, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen beinhaltet Endothelzellen, Perizyten, glatte Muskelzellen, Immunzellen und die Koordination mit der Lymphgefäße und Nerven. Die Multi-Zelle, erfordern Multi-System-Interaktionen, die Untersuchung der Angiogenese in einem physiologisch relevanten Umfeld. Während also die Verwendung von in vitro-Zellkulturmodelle mechanistische Erkenntnisse zur Verfügung gestellt haben, eine gemeinsame Kritik ist , dass sie rekapitulieren nicht die Komplexität , die mit einer mikrovaskulären Netzwerk verbunden. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fähigkeit zu demonstrieren, Zeitraffer-Vergleiche von intakten mikrovaskuläre Netzwerke vor und nach der Angiogenese Stimulation in kultivierten Ratte Gekröse Gewebe zu machen. Kultivierte Gewebe enthalten mikrovaskuläre Netzwerke, die ihre Hierarchie pflegen. Immunhistochemischen Markierung bestätigt das Vorhandensein von Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Blutgefäße und Lymphgefäße. In einemddition, Etikettieren Gewebe mit BSI-Lektin ermöglicht Zeitraffer-Vergleich von lokalen Netzregionen vor und nach dem Serum oder Wachstumsfaktor-Stimulation durch erhöhte Kapillare sprießen und Gefäßdichte gekennzeichnet. Im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmodelle, stellt dieses Verfahren ein Werkzeug für die Endothel-Zelllinie Studien und Gewebe-spezifische angiogene Arzneimittel Auswertung in physiologisch relevanten mikrovaskuläre Netzwerke.

Nach 3 Tagen in Kultur Gewebe wurden mit einer Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit markiert , um die Lebensfähigkeit des microvasculature bei der Ratte Gekröse Kulturmodell (Abbildung 2A) zu demonstrieren. Die Mehrzahl der Zellen, die in der Gekröse lebensfähig blieben in der Kultur, in der Endothel-Zellen identifiziert wurden in mikrovaskulären Segmente auf ihren Standort. Endothelzellproliferation wurde auch von Lektin / BrdU - Markierung (2D...

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An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

6.8K Aufrufe.  Tulane University. Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis. 

Serie: An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologie

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Medizin

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Ein

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