この作品は、フォンVOOR Wetenschappelijk Onderzoe​​k（FWO）ブラーンデレンG0466.10、11I0113Nによってサポートされていました。小児循環器、UZルーヴェン、ベルギーのための「エディ·メルクス研究助成」と「Sporta研究グラント」（JC）。分子および血管生物学のためのセンターは、ルーベン大学の「Geconcentreerde Onderzoe​​ksacties」（GOA 13分の2009）とベーリンガーインゲルハイムからの研究助成金によって、Programmafinanciering KUルーベン（PF / 10/014）でサポートされています。

動物実験は、ルーヴェンカトリック大学の倫理委員会によって承認されました。 インビトロ灌流およびin vivo実験 1.準備細菌<ol><li>我々はSを使用しましたこの原稿に記載されているすべての実験のための黄色ブドウ球菌株ニューマン。S.黄色ブドウ球菌 Newmanのを-80℃で10％グリセロールにブレインハートインフュージョン（BHI）中に保存しました。 </li><li> （3 OD 600&gt;）、37℃でO / N凍結細菌を掻き落としおよび5に接種するために滅菌ループを使用mlのトリプシン大豆ブロス（TSB）。 </li><li>遠心分離によって細菌を洗浄し（2600グラム、室温、5分）、5mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li>エタノール中の5（6） - カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシエステル（カルボキシ - フルオレセイン）の1 mg / mlの溶液を調製します。実験室グレードの水で150μgの/ mlに1 mg / mlのカルボキシフルオレセイン溶液（ 例えば、ミリQ水）で希釈します。光からチューブを守ります-20℃でアルミ箔とストアと。 </li><li> （2,600×gで、室温、5分）細菌を遠心します。 800μlのPBS中に細菌ペレットを再懸濁し、200μlまたは150 / mlのカルボキシ-フルオレセイン溶液を400μl（最終濃度in vivo実験のために50μg/ mlの）（灌流実験のための30μg/ mlの最終濃度）を追加します。アルミホイルで光からチューブを保護し、シェーカー上で室温で30分間インキュベートします。 </li><li>標識後、PBS中に6％のウシ血清アルブミン（BSA）溶液でブロック。 </li><li>光学密度測定を用いて細菌（OD）、OD in vitro実験のための0.65の600を希釈し（とOD インビボ実験のための1.8の600（約3×10 8コロニー形成単位（CFU） 黄色ブドウ球菌用/ mlに相当します） PBS中の黄色ブドウ球菌では約1×10 9 CFU / mlの）に対応します。アルミホイルで光からチューブを保護し、氷の上に残します。 </li></ol> 2. インビトロ灌流実験<ol><li>ガラスカバースリップのコーティング<ol><li>実験室グレードの水でフォン·ヴィレブランド因子（VWF）（Haemate P、ストック濃度2,400μgの/ ml）に希釈し、50μg/ mlの最終濃度まで（蒸留脱イオン）。 </li><li> 160 / mlの最終濃度まで（製造業者によって供給されるSKF液、pHを2.7から2.9）、等張グルコース溶液中のコラーゲンを希釈。 </li><li>パラフィルム上のコーティングの200μLを滴下し、液滴の上にカバースリップを置くことにより、VWFまたはコラーゲンでコートしたカバーガラス（24×50ミリメートル）。液滴は、カバーガラスの表面に沿って拡散します。 </li><li>室温で4時間、加湿容器にカバースリップをインキュベートします。慎重に鈍い針でパラフィルムからカバーグラスを持ち上げます。フローチャンバーの底部にカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>プラスチックのコーティングは、内皮細胞でスリップ<ol><li>コー​​トプラスチックスリップPBS中の1％ゼラチン溶液1ml（1ウェルPCA細胞培養チャンバー、ザルスタット、ドイツ）を、37℃で30分間インキュベートします。ゼラチンコーティングされたプラスチック製のスリップ上シードヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）および70〜80％の密集度にそれらを成長させます。フローチャンバーの底部にあるプラスチック製のスリップをマウントします。 </li></ol></li><li>かん流実験 注： インビトロ灌流モデルの概略図を図1に示されています。 <ol><li>異なる生理学的流れの条件をシミュレートするために2.5ダイン/ cm 2で20ダイン/ cm 2の間に層状剪断応力でマイクロ平行プレートフローチャンバーインビトロ細菌付着試験を行います。 </li><li>フローチャンバー（社内の設計）は、金属フレーム及びプレキシガラスで作られた灌流チャンバー（ポリ（メチル）メタクリレート（PMMA））からなります。高精度の注入ポンプ（PHD 2000輸液、ハーバード装置、USA）に接続することによって、我々は、RAの流れを生成することができ0.0001マイクロリットル/分、220.82ミリリットル/分のTES。 </li><li>フローチャンバーの上部にチューブを接続し、チューブに培地を注入します。静かに底部の上にフローチャンバの上部に配置し、フローチャンバーを組み立てます。気泡がないように注意してください。室内に漏れていないことを確認すると、過剰な塗布液を除去するために、チャンバを通って培地1mlを注入します。気泡を避けます。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるため、厳密な無菌の手順は必要ありません。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>輸液ポンプや蛍光顕微鏡を設定します。輸液ポンプの設定は、シリンジの直径と所望の流量（2.4節を参照）に依存しています。これからは、暗い部屋で働いています。 </li><li> VWFコーティング： <ol><li>蛍光標識された細菌と注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。 10分間の注入ポンプを起動します。注入時間は、使用されるせん断速度およびコーティング、細菌やメディアに依存し、密着性の安定した状態を表している必要があります。 </li><li> 10分後、導入管にPBSで注射器を接続し、輸液ポンプを起動して、非結合細菌を洗い流します。 </li><li>洗浄工程の後に異なる場所で少なくとも15画像​​や動画を取ります。細菌は小さく、集中することが潜在的に困難です。 インビトロ流動実験の前に、適切な焦点面をカバースリップ上で蛍光標識された細菌の滴を配置し、フローチャンバー内にカバースリップを配置することによって取得することができます。次に、適切な焦点面を検索し、設定を保存します。 注：in vitroでの流動実験中に、洗浄工程（開始後±5分）の間に画像を捕捉することだけを保証します付着細菌のための信号が捕捉されます。 </li></ol></li><li>コラーゲンコーティング： <ol><li>ただ灌流を開始する前に、蛍光標識された細菌に60 / mlののVWFを追加します。 60 / mlのVWFを補充した蛍光標識細菌または蛍光標識された細菌を注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。繰り返しの手順は2.3.5.3に2.3.5.2 </li></ol></li><li>内皮細胞： <ol><li>のCa 2+ -ionophore A23187の0.1 mM溶液で灌流による内皮細胞を活性化して灌流によって10分間細菌灌流と同じせん断速度でDMEM中（ストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10mMの） 0.1 mMの。繰り返して、2.3.5.3に2.3.5.2を繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li>次のようにせん断速度とせん断応力を計算します。 せん断速度= 6Q / WH 2 ：Q：流量W ml /分での速度、：センチ幅、H：cm単位の高さ せん断応力（τ）=せん断ラット元粘度（μ） どこμ：ミディアム：0.01ダインのx秒/ cm 2であり、全血：0.04ダインのx秒/ cm 2の </li><li>画像解析<ol><li>白黒カメラと倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、画像化ソフトウェアを使用して開発します。 1.5秒の露光時間を使用してください。ランダムフローチャンバーのコーティングされた表面上に広げ、適切なファイル形式で保存（少なくとも15）複数のスナップショットを取ります。 </li><li> ImageJので画像解析を実行します。と関心のある特徴にグレースケール画像をセグメント化、下側および上側のしきい値を設定するしきい値を定義 - 画像（Substractバックグラウンド·プロセス）からのスムーズな連続バックグラウンドを除去するためのバックグラウンドを減算します。閾値に制限された領域を測定します。 </li><li>細菌の付着を比較し、統計分析ソフトウェアを用いて、例えば 、蛍光領域として表さ。一方向ANOVAまたはTを使用してグループを比較しますWO-両側スチューデントt検定を。平均値の平均値±標準誤差（SEM）としてすべての値を報告します。重要な&lt;0.05のp値を考えてみましょう（* P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001）。 </li></ol></li></ol> インビボ腸間膜灌流モデル3. <ol><li>マウスの作製/手術<ol><li>便通を制限するために、実験前の夜、マウスを絶食。 </li><li>ブプレノルフィンの皮下注射手術前に（0.1 mg / kg体重（BW））20〜30分まで6〜8週齢のマウス（C57BL / 6）手術前鎮痛を与えます。 </li><li>ケタミンの腹腔内注射（125 / kg体重）およびキシラジン（12.5 / kg体重）で、マウスを麻酔。ペダル反射により確認してください。乾燥を防ぐために、獣医軟膏を適用します。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるので、厳密asceptiを必要としませんCプロシージャ。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>蛍光標識された細菌または他の溶液の注入のための右頸静脈に2フランス語静脈カテーテルを挿入します。腹部正中切開により腹腔を開き、腸間膜を広げるために綿棒を使用し、腸間膜動脈と細静脈循環を可視化します。 </li><li>透明板の右側にマウスを置き、テープでカニューレを固定します。低体温症を防ぐためにホットパックを使用してください。組織の脱水を防ぐために、腸に500μlの0.9％のNaClをドロップします。 </li></ol></li><li>腸間膜循環への細菌付着の蛍光顕微鏡<ol><li>暗い部屋で働いています。船を固定し、倒立顕微鏡下でそれらを視覚化するために綿棒を使用してください。 </li><li>局所的に10 mM溶液oの5μLを適用FのCa 2+ -ionophore A23187は、DMSOに溶解しました。 10秒後、頸静脈カテーテルを介して（ステップ1を参照）100μlの標識された細菌を注入します。タイムラプス画像を撮影します。実験が終了した後、機関承認ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 </li></ol></li><li>画像解析<ol><li>倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、白黒カメラを用いて捕捉され、任意の画像処理ソフトウェアを使用して開発しました。自動露光時間と使用する機器に固有のコントラストの最適化を適用します。 </li><li>千枚/秒の40サイクルを使用して - ツールバー（時間多次元買収）の「取得」ツールを使用してタイムラプス画像を取得します。適切な画像ファイル形式で画像を保存します。 </li><li>画像あたりの蛍光シグナルの面積を測定するためにImageJの解析ソフトウェアを用いて処理画像。 Fにグレースケール画像をセグメント、下側及び上側のしきい値を設定するしきい値を定義します興味の特長。金利（血管）の領域を特定し、しきい値と関心領域に制限された領域を測定します。細菌の付着を比較し、いずれかの統計やグラフ作成ソフトウェアを使用して蛍光領域として表現。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

せん断応力は、血管壁への早期細菌付着および血管内または心臓内植生および転移性の感染症4,5の次の世代のための重要な要因です。我々は、生理的せん断応力下の血管内感染の病因を研究するためのin vitroおよびin vivoモデルで相補します。これらのモデルは、私たちは、主要なSとフォンビルブランド因子結合タンパク質（vWbp）を識別することができました球菌タンパク質はVWF 4を露出させ 、損傷した血管壁と流れの下で対話します。 血管内感染症、特に感染性心内膜炎は、だけでなく、ため、ローカルおよび遠隔（ &#39;転移&#39;）合併症の、ためだけでなく、敗血症誘発性の臓器不全と死の懸念されます。感染性心内膜炎および転移性の感染症を引き起こす細菌は、血管壁に付着し、したがって、血流の剪断応力に抵抗しなければなりません。最も細菌の研究が要因が静的な条件で行われてきた病原性。しかし、これらの確立された相互作用は、細菌宿主の相互作用に新たな、以前に認識されていない要因を明らかにすることができる流動条件下で剪断力と研究に耐えられない可能性があります。 マイクロパラレルフローチャンバーを用いて、他のものは血管接着用VWFの重要​​性を示しています。せん断応力下では、VWFは、次第にその静止球状構造から展開、およびそののGPIb受容体6を介して血小板と相互作用するA1ドメインを公開します。フローチャンバーは、広く血小板機能7を研究するために使用されています。 驚くべきことに、またS.流下球菌の付着は、剪断時に露出されるA1ドメインをVWFを必要とし、特に。我々は結合VWFを媒介するvWbpを同定しました。 vWbpは、Sに貢献コアグラーゼですホストのプロトロンビンを活性化することにより、 黄色ブドウ球菌の病態生理。 Staphylothrombin、RES細菌コアグラーゼとプロトロンビンとの複合体をulting、不溶性フィブリン8,9をフィブリンに変換します。我々の研究はvWbpがプロトロンビンを活性化するが、流れ4,10,11の下の血管への接着性を向上させる細菌フィブリン-血小板凝集物の形成をトリガするだけでなくことを示しました。 in vitroでのフローチャンバーモデルは、細胞またはマトリックスの構成要素に細菌付着で別の選手を研究することができます。細菌の毒性因子は、特定の表面タンパク質を発現する変異体または無害な細菌を用いて研究することができます。代替的に、薬理学的阻害剤または遮断抗体は、フローチャンバ内の培地に添加することができます。そのような細胞外マトリックスの種々の成分のような宿主因子の役割は、異なるコーティングでカバーガラスを使用して研究することができます。カバースリップは、また、活性化状態は、特定の刺激物質を添加することによって調節することができるそれらの内皮細胞で覆うことができます。アパ血管壁からのRTは、宿主の血液細胞および血漿タンパク質の寄与は流動媒体にこれらの要素を追加することによって調べることができます。したがって、複雑化の異なる条件は、細菌がin vivoで血管壁に付着することを可能にする相互作用を解明するために、層流の標準化された条件の下で研究することができます。 in vitroモデルで同定された相互作用は、その後、複雑な生物で、その妥当性をテストするために、動物モデルで研究されています。流れの下で動的な相互作用を研究するために、他のin vivoモデルは、ハムスターの背側皮下脂肪チャンバー12と精巣挙モデル13として、記載されています。対照的に、ここで説明する腸間膜灌流モデルは、可能性はマウスの遺伝的背景をホスト変えるためにおよび薬理学的介入を評価するために、その使いやすさのいくつかの利点を提供しています。 結論として、説明したモデルS.だけでなく表面タンパク質を研究する可能性を提供黄色ブドウ球菌が、別のホストの背景には多くの他の微生物の、より良い血管感染症の病因を理解します。

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

血管内感染症および感染性心内膜炎を引き起こすために、細菌は、血液の流れのせん断応力にさらされながら、血管壁に付着することができる必要があります。 微生物の血管接着に寄与する細菌と宿主因子を同定するために、生理学的剪断条件下で、これらの相互作用を研究する適切なモデルが必要とされています。ここでは、細胞外マトリックスの異なるコンポーネントに細菌の付着を調査するか、内皮細胞を可能にするインビトロフローチャンバーモデル、およびin vivoで直接内臓循環への細菌の初期接着を可視化するために開発された生体顕微鏡のモデルを記述します。これらの方法は、流れの下の細菌の付着のために必要な細菌と宿主因子を同定するために使用することができます。我々は、せん断応力の妥当性とStaphyの接着のためのフォンビルブランド因子の役割を示していますlococcus球菌の両方のin vitroおよびin vivoモデルで使用して。

VWFへの黄色ブドウ球菌の接着、内皮下マトリックスおよび内皮細胞は、せん断応力に依存する現象であります S.との間の相互作用におけるせん断応力の役割を強調するために、 黄色ブドウ球菌およびVWF、我々 は、in vitro灌流モデルを図1に示されているの概略図（異なるせん断速度でVWFの上にコーティングされたカバースリップを灌流を行った。 黄色ブドウ球菌の付着VWFに250秒からせん断速度を増加させる-1 2,000に伴って増加しました秒-1（ 図2）、高剪断力は、VWFへの細菌の付着を阻害するが、強化しないことを示します。 コラーゲンへの内皮下マトリックスの主成分を細菌付着に対するVWFの寄与を調べるために、我々は、蛍光標識されたS.を潅流VWFの存在下または非存在下でのコラーゲンの上に黄色ブドウ球菌 。 VWF、S.の付着がない場合Aコラーゲンへのureusはせん断速度の増加に伴って減少しました。しかし、VWFは、Sの密着性媒体中に存在したとき黄色ブドウ球菌は、剪断速度を（ 図3）の増加とともに増加しました。 in vitroでのフローモデルはまた、私たちは流れの下で内皮細胞への細菌の付着を調べることができます。我々は、蛍光標識されたSでのHUVECを灌流せん断速度で500〜2000秒球菌 -1。示される場合には、HUVECをVWFの放出を引き起こすためにはCa 2+ -ionophoreで活性化しました。内皮細胞の活性化およびその後のVWFのリリース、Sの増加接着リニア延伸VWF分子に沿って細菌の結合を示唆し、せん断力（ 図4B）の方向に整列した細菌のクラスタを蛍光標識の典型的な「紐状」パターンを形成球菌 （ 図4A）。 生体内での最初の内臓静脈内細菌の付着はVWFによって媒介されます S.ので、 生体内で活性化され、血管壁への細菌の付着を調査するために（ - - / VWF）球菌は VWFに付着することができ、我々は（VWF + / +）とVWF欠損マウス野生型マウスを使用していました。内臓血管のリアルタイムビデオ顕微鏡は、蛍光標識されたS.循環のインビボでの可視化を可能にしました球菌（in vivoでの灌流モデルの概略図を図5に示されています）。 のCa 2+ -ionophoreによる内皮の薬理学的活性化の後、我々は、WTマウスの血管壁への個々の細菌や細菌の凝集体の迅速な局所的蓄積を観察した（補足ビデオ1及び2）。ほとんどの細菌の付着は、VWF -deficieの活性化血管壁に見られませんでした。NTマウス（補足ビデオ3）WTマウスにおける接着と比較した（ 図6）。 VWFの非存在は、Sの能力を低下させます活性化した血管壁に付着する黄色ブドウ球菌 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> 図1. インビトロ流モデルの略図。 インビトロ流モデルは、内皮下マトリックスへの細菌の付着などの異なるせん断依存機構の研究を可能にするだけでなく、形成を血栓多機能モデルです。マイクロパラレルフローチャンバーは、タンパク質および内皮細胞の異なるコーティングを有するカバースリップ（プラスチックまたはガラス）上に配置されます。異なる細菌（オレンジ、グレードット）の付着を分析することができ、血漿タンパク質、血小板、全血の存在の影響を評価することができます。血小板のための蛍光マーカー（青楕円）またはfibrinogEN（青ストリング）は、細菌と宿主因子を区別するために別の阻害剤（黒色楕円）と組み合わせて使用​​することができます。 Sの細菌付着の代表的な画像VWFの存在（下）中のコラーゲンコーティングまたは非存在下（上）に黄色ブドウ球菌が （スケールバーは100μmである）が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Sの図2.接着増加せん断速度とVWFの増加に黄色ブドウ球菌。S.蛍光標識でコーティングされたVWF（50μg/ mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流250〜2,000秒-1培地中で（秒-1）（N&gt; 5）のせん断速度で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * P &lt;0.05、** p &lt;0.01。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S.図3接着内皮下層への黄色ブドウ球菌は 、せん断およびVWF依存している。と、蛍光標識したS.コーティングされたコラーゲン（160 / mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流培地中の250秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。示されている場合VWF（60μgの/ ml）を培地中に存在しました。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 ** P &lt;0.01。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Sの図4.接着活性化内皮細胞へ球菌は、内皮細胞上の依存せん断。マイクロパラレルフローチャンバー灌流あります 。 （A）ヒト臍帯静脈内皮細胞のCa 2+を-ionophore Aで活性化しましたS.蛍光標識の10分間の灌流に続いて23187（0.1ミリモル）培地中の500秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * p &lt;0.05。 S.と活性化されたHUVECを超えるマイクロパラレルフローチャンバー灌流の（B）イメージ千秒-2。S.のせん断速度で、 黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌は、VWF多量体との密着性を（スケールバーは100μmである）を示唆し、±200ミクロンの長さの文字列を形成している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> 図5 の生体内腸間膜灌流モデルの概略図。右頸静脈カテーテルは、（黄色の線）フッ素を投与するために挿入され、escently標識された細菌（オレンジドット）、追加の麻酔薬またはそのような医薬阻害剤および抗体などの他のコンポーネント。腹腔を開き、腸間膜は、蛍光顕微鏡下での血管（静脈および動脈）を可視化するために広がっています。 VWFの放出を誘導したCa 2+ -ionophoreによる内皮細胞の薬理学的活性化の後、細菌は、頸静脈カテーテルを介して注入することができます。リアルタイム血管内ビデオ顕微鏡は、蛍光標識された細菌や細菌血小板血栓の形成得られた循環の in vivo可視化を可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> 図6. Sの初期接着球菌in vivoでの活性化内皮にはVWFが介在する C57BL / 6 VWF + / +およびC57BL / 6 VWFとのインビボ静脈腸間膜灌流モデル- / -マウス。蛍光標識されたSの接着局所的に活性化された血管壁に球菌VWFに有意に低い- / -マウス。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 *** P &lt;0.001、n&gt;は7。 <img alt="ビデオ図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> ビデオ1：Sのリアルタイム接着VWF + / +マウスにおいて、活性化された血管壁に黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> ビデオ2：Sのリアルタイム凝集体形成および塞栓VWF + / +マウスにおける黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ビデオ図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> ビデオ3：Sのリアルタイム接着 - / -マウス- / - 。VWF + / +およびVWFを有するマウス においてインビボ腸間膜灌流モデル球菌VWF中の活性化血管壁へ 。のCa 2+ -ionophore（10ミリモル）の5μlをアプリでした可視化血管床の領域とエド。カルボキシ-フルオレセイン標識Sのサスペンション黄色ブドウ球菌は、頸静脈カテーテルを介して注入しました。腸間膜循環が倒立顕微鏡下で可視化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K ビュー.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

ビデオ: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...